Summary
توضح هذه المقالة طريقة ميكرواري بروتين بسيطة للتنميط خلطيه الاستجابات المناعية للوحة 7-من نوع plex للغاية تنقية المستضدات المطثيّة العسيرة في الأمصال البشرية. ويمكن تمديد البروتوكول لتحديد استجابات جسم معين في الأعمال التحضيرية الغلوبولين المناعي الوريدي [بولكلونل].
Abstract
نحن نقدم عرضاً مفصلاً للمقايسة ميكرواري رواية الفائق البروتين للبت في مكافحة مستويات الأجسام المضادةالمطثيّة العسيرة في الأمصال البشرية وفي الأعمال التحضيرية منفصلة [بولكلونل] الغلوبولين المناعي الوريدي (IVIg). البروتوكول يصف الخطوات المنهجية المتبعة في إعداد عينة، وطباعة صفائف وإجراء الفحص، وتحليل البيانات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة تطوير هذا البروتوكول لتدرج عينات سريرية مختلفة بما في ذلك البلازما والخلايا supernatants ثقافة. علينا إظهار كيف يمكن استخدام ميكرواري البروتين لتحديد مزيج من ايستب (IgG, IgA, IgM)، فئة فرعية (IgG1، IgG2، IgG3، IgG4، IgA1، IgA2)، والأجسام المضادة سلالة محددة للغاية تنقية كله جيم السموم A و B (توكسينوتيبي 0، سلالة VPI 10463، ريبوتيبي 087)، السمية ب من جيم ب السم فقط--وإذ يعرب عن سلالة (ككوج 20309)، ونموذج سلائف جزء ب السم ثنائي، بكدتب، ريبوتيبي-الخاصة بالطبقة السطحية أسرة البروتينات (التخاطب؛ 001، 002، 027)، والتحكم بالبروتينات (التيتانوس توكسيد والمبيضات البيض). وخلال التجربة، يتم سبر [ميكروارس] مع الأمصال من الأفراد مع الأفراد المصابين بالتليف الكيسي (CF) دون الإسهال، ضوابط صحية (المفوض السامي)، جيم العدوى (الهيئة)، ومن قبل الأفراد والعلاج IVIg وظيفة علاج اضطراب نقص المناعة المشترك، مجتمعية وبوليراديكولوباثي دملينتينغ التهاب مزمن. أننا نواجه اختلافات كبيرة في بلغت تحييد السم ومستويات محددة من جسم ايستب متعددة بين مجموعات المرضى، التحضيرات التجارية IVIg، والأمصال قبل ويلي IVIg الإدارة. أيضا، هناك ارتباط كبير بين ميكرواري والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا) لمستويات مفتش الترياق في عينات مصل الدم. هذه النتائج تشير إلى أن ميكرواري يمكن أن تصبح أداة واعدة للتنميط الردود الأجسام المضادة على المستضدات C.difficile في البشر جرى تطعيمهم أو المصابة. مع مزيد من الصقل مستضد الألواح وتخفيض تكاليف الإنتاج، ونحن نتوقع أن التكنولوجيا ميكرواري قد تساعد في تحسين وتحديد إيمونوثيرابيس أكثر سريرياً مفيدة للعدوى جيم بصورة خاصة بالمريض.
Introduction
ويصف هذا البروتوكول التنمية والمصادقة مقايسة ميكرواري البروتين رواية ومخصصة للكشف عن وشبه الكمي للسلالة البكتيرية واستجابات جسم ايستب محددة إلى المستضدات جيم . نستخدمها بنجاح أعمالنا جيم-مقايسة ميكرواري محددة كأداة جديدة واعدة للتحاليل الطبية التركيبية لمحتوى جسم معين في الأمصال المريض1،2، الأعمال التحضيرية IVIg3، و تحديد خصائص الأجسام المضادة ترتبط بنتائج سيئة في الهيئة4. نظهر كيف يمكن تحليل عينات مصلية بيوبانكيد والتحضيرات التجارية من IVIg على شرائح ميكرواري، والسماح للتنميط استنساخه عالية الجودة للردود الخاصة بمسببات المرض جسم جيم في هذا التحليل.
كثير من الأطفال الأصحاء والبالغين قد أضداد المصل يمكن كشفها IgG و IgA للسموم جيم أ وب5،6. هذه يعتقد أن تنشأ في أعقاب التعرض عابر خلال مرحلة الرضاعة وعقب التعرض جيم في مرحلة البلوغ. لهذا السبب، فقد كان IVIg [بولكلونل] يستخدم خارج التسمية لعلاج المتكررة ومداهم ديمقراطيي7،،من89. ومع ذلك، لها دور حاسم وطريقة العمل لا يزال غير واضح. لقد بينت دراسات عديدة أن استجابة مناعية خلطيه للسموم جيم يلعب دوراً في عرض المرض ونتائجه. على وجه التحديد، تظهر أعراض المرضى بمصل زيادة السمية المضادة "مفتش" تركيز مقارنة بالمرضى الذين يصابون بأعراض مرض10. ذكر ارتباط يمكن إثباته لمتوسط السمية لمكافحة "ألف مفتش" التتر و 30 يوما جميع أسباب وفيات11. كشفت عدة تقارير أيضا عن اقتران مع حماية ضد الردود التكرار والأجسام المضادة للسم أ وب عدة مولدات المضادات غير السمية (Cwp66، Cwp84، FliC، فليد، والبروتينات الطبقة السطحية (SLPs))12،13 , 14 , 15-هذه الملاحظات قد حفزت تطوير أول المناعي السلبي المخدرات تستهدف جيم السم ب (بيزلوتوكسوماب)، الذي أقرته مؤخرا لنا الغذاء والدواء والأدوية الأوروبية الوكالة لمنع التدخلات المتكررة16. استراتيجيات التطعيم باستخدام السموم المعطل أو الشظايا السمية المؤتلف، أيضا قيد التنمية17،،من1819. لا شك في أن تحفز هذه النهج العلاجية الجديدة الحاجة إلى تقييم الاستجابات المناعية خلطيه لمولدات المضادات المتعددة في العينات ذات الأحجام الكبيرة.
واليوم، هناك نقص ملحوظ في المتاحة تجارياً الفائق فحوصات قادرة في نفس الوقت تقييم السلالة البكتيرية واستجابات جسم ايستب محددة إلى المستضدات جيم . وهناك حاجة غير ملباة لتطوير مثل هذه الاختبارات لتيسير جهود البحث في المستقبل والتطبيقات السريرية. [ميكروارس] البروتين هي أسلوب لشل أعدادا كبيرة من البروتينات تنقية منفردة كمجموعة منظمة مكانياً من البقع على سطح المستندة إلى شريحة مجهرية باستخدام نظام روبوتية، التي يمكن أن تكون20 جهة اتصال أو عدم الاتصال طباعة أداة21. وقد تمثل البقع الخلائط المعقدة مثل ليساتيس خلية أو الأجسام المضادة، هوموجيناتيس الأنسجة، والبروتينات الذاتية أو المؤتلف أو الببتيدات، وسوائل الجسم أو المخدرات22،23.
بروتين ميكرواري التكنولوجيا يوفر مزايا متميزة أكثر من أليسا الداخلية القياسية التقنيات التي استخدمت تقليديا لتقييم مكافحة--جيم جسم الردود. وتشمل هذه زيادة قدرة على الكشف عن مجموعة من الأجسام المضادة المتعددة-ايستب-محددة ضد فريق أوسع من أهداف البروتين، وانخفاض حجم الاحتياجات لمولدات المضادات، والعينات، والمواد الكاشفة، وتعزيز قدرة على إدماج أكبر عدد replicates التقنية، بالإضافة إلى مراقبة الجودة الداخلية متعددة (QC) تدابير1. وهي بالتالي أكثر حساسية ودقة واستنساخه [ميكروارس] أكبر مجموعة ديناميكية. وهذه العوامل تجعل [ميكروارس] بديلاً أرخص ويحتمل أن تكون مواتية الساس لكشف البروتينات المعروفة على نطاق واسع. ومع ذلك، يؤدي مساوئ التكنولوجيا ميكرواري أساسا من التكاليف الأولية الكبيرة المرتبطة بإنشاء فريق مستضدات تنقية عالية وإعداد منصة تكنولوجية.
بروتين [ميكروارس] وقد استخدمت على نطاق واسع على مدى العقدين الماضيين كأداة تشخيصية والأساسية لبحث في التطبيقات السريرية. تطبيقات محددة تشمل التعبير البروتين التنميط، ودراسة العلاقات إنزيم الركازة، فحص العلامات البيولوجية، وتحليل التفاعلات بين الميكروبات والمضيف، والتنميط جسم خصوصية23،24، 2526،،،من2728. [ميكروارس البروتين/مستضد العديد من جديد الممرض في] قد أنشئت، بما في ذلك الملاريا (المنجلية)29، وفيروس نقص المناعة البشرية-130،31من الإنفلونزا، مرض الالتهاب الرئوي الحاد (السارس)32، الحمى النزفية الفيروسية33 ، هيربيسفيروسيس34و35من السل.
يتصل هذا البروتوكول بإنشاء سهولة التشغيل جيم. صعب مستضد رد الفعل ميكرواري المقايسة، الذي يمكن القياس الكمي دقيقة ودقيقة ومحددة متعددة-ايستب والردود الخاصة بسلالة جسم إلى جيم صعب مولدات المضادات في الأمصال و IVIg [بولكلونل]. هنا، نحن تشمل الممثل نتائج تتصل أداء الإنزيم ميكرواري مقبولة بالمقارنة مع أليسا، فضلا عن دقة التحليل وإمكانية تكرار نتائج التشكيلات الجانبية. هذا التحليل يمكن زيادة تطويرها للشخصية الأخرى العينات السريرية، ويضع معايير جديدة للبحث في الأساس الجزيئي للهيئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد لوحة ميكرواري
- تمييع المستضدات جيم مع المخزن مؤقت طباعة [برنامج تلفزيوني-توين-تريهالوسي (50 مم)] في تركيز المثلى (التي كانت مسبقاً قبل تشغيل الأمصال المريض): السم (200 ميكروغرام/مل)، والسمية ب (100 ميكروغرام/مل)، بكدتب (200 ميكروغرام/مل)، وتنقية أصلي التخاطب كلها مستمدة من ريبوتيبيس 001 و 002 و 027 (200 ميكروغرام/مل).
ملاحظة: تم الحصول على السم ب من السم ب-الإعراب عن سلالة ككوج 20309 (90 ميكروغرام/مل).- تضعف الضوابط الإيجابية، ليساتيس المبيضة، والتيتانوس مع المخزن المؤقت الطباعة في 100 ميكروغرام/مل. وأخيراً، يؤدي إلى تمييع الغلوبولين المناعي البشري المنقي مطابقة ايستب جسم اختبار متسلسل، بدءاً من 50 ميكروغرام/مل عبر تخفيف 10 في المخزن المؤقت للطباعة لإنشاء منحنى معايرة.
- نقل 10 ميليلتر من تخفيف في المخزن المؤقت للطباعة في لوحة 384-جيدا.
- وتغطي اللوحة بختم اللوحة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
2-طباعة الصفائف مع روبوت الاتصال
- الحرارة دبوس السيليكون باستخدام s الموقد الغازي باليد 3 × 2 والشطف في الماء النظيف 3 × 3 s.
- ضع لوحة ميكرواري إلى خرطوشة التحميل من أررايير.
- ضع الشرائح أمينوسيلاني على درج الشريحة.
ملاحظة: يمكن لدرج الشريحة استيعاب الشرائح 27: ثلاثة صفوف من تسع شرائح. يتم ترتيب الشرائح في اتجاه عمودي ابتداء من الجانب الأيسر من الصف السفلي وبقية المساحات مغطاة بشرائح فارغة ضمان شمول جميع الثقوب على درج الشريحة.- اضغط موافق والتحقق من أن تم تشغيل فراغ وكافة الشرائح آمنة. اترك الشرائح في البيئة الرطبة من أجل ح 1 على الأقل قبل البدء الطباعة.
ملاحظة: تقدم الشرائح أمينوسيلاني في حقيبة مختومة مع ديسيككانت. بمجرد فتح، تعاد أي الشرائح غير مستخدمة فورا إلى مجففة لتخزين ما يصل إلى تاريخ انتهاء الصلاحية.
- اضغط موافق والتحقق من أن تم تشغيل فراغ وكافة الشرائح آمنة. اترك الشرائح في البيئة الرطبة من أجل ح 1 على الأقل قبل البدء الطباعة.
- قم بإعداد برنامج الطباعة المناسبة لطباعة المستضدات المطثيّة العسيرة . إطلاق "جناح تطبيق الاتفاقات" وفتح ملف معلمات تشغيل الطباعة المطلوبة من الدليل '"بي Gridding يدير"'. حدد ملف المطثيّة العسيرة لطباعة جميع المستضدات المطثيّة العسيرة في البيلوروسية.
- عند النقر المزدوج فوق الرمز ميكرواري على النافذة الرئيسية سوف تظهر نافذة كلفة ثلاثة تسمى 'ميكروارايينج المعلمات'. علامات التبويب الثلاثة هي "المصدر،" و "الهدف"، و "خيارات". تظهر علامة التبويب "مصدر" تفاصيل العدد العينات المستخدمة في لوحة ميكرواري. علامة التبويب "الهدف" يبين تفاصيل عن الكيفية التي الشرائح يتم تحميلها، حيث الصفيف يجب أن تتم طباعة على الشريحة وتحرير تخطيط الشريحة (تنسيقات صبري 16). علامة التبويب "خيارات" يبين تفاصيل البروتوكول الغسيل وأداة يتم استخدامها على سبيل المثال. يغسل بعد كل عينة المكتملة. تنظيف دبوس السليكون بين عينات لتجنب أي تلوث الصليب بين العينات المختلفة.
- خيارات البرمجة الموجودة ضمن خيارات > "تفضيلات تشغيل" شريط أدوات "جناح تطبيق الاتفاقات". توجد علامات تبويب 9 للعمل من خلال هذا المقطع وأنتم نقل علامة تبويب واحدة كاملة إلى المرحلة التالية بالنقر فوقه. النقر فوق الزر "موافق" سوف تتخذ لكم من "تفضيلات التشغيل." في علامة التبويب "عام" في "تفضيلات التشغيل"، هناك عدد من خانات الاختيار المتاحة تحت هذا الباب تتعلق بكيف سوف تتصرف الصك عند بدء تشغيل برنامج. تحقق من خانة "حمام رئيس الوزراء قبل بدء تشغيل"، سيخضع جميع يغسل ثلاث محطات تسلسل فتيلة قصيرة قبل بدء التشغيل. وسوف تغسل الاختيار المربع، "غسل في بدء تشغيل" أداة دبوس قبل زيارة المصدر الأول. حدد المربع "المياه والصرف الصحي في نهاية تشغيل"، سيتم غسلها الأداة pin بعد زيارة المصدر الأخير. يمكن للمستخدم تعيين عدد دورات الغسيل. في علامة التبويب "تفضيلات التشغيل" "المناخ"، ابدأ الترطيب. الإعداد نستخدمها على النحو التالي: تبدأ نسبة 55%، تشغيل نسبة 55%، والحد الأدنى من الرطوبة 55%، الهدف الرطوبة 60%. عدم بدء التشغيل حتى تم التوصل إلى الهدف الرطوبة وخلاف ذلك البقع سيكون حجم خطأ والمكتبة سوف تتبخر سريعاً.
- في شريط القائمة من TAS، انقر فوق الزر الذهاب الخضراء. بدء التشغيل ومراقبة بشكل دوري أرايير أثناء تشغيل الطباعة لتكون معينة في كل شيء على ما يرام.
ملاحظة: هذا يمكن تحليل العينات 15 في نفس الوقت على كل شريحة كما صبري واحد يستخدم كعنصر سلبي. تصميم سوباريس يتحدد بعدد البروتينات المطبوعة (مولدات المضادات) ويتطابق عدد البيولوجية المطبوعة.
ملاحظة: بعد طباعة كل عينة، الرأس يتحرك نحو أحواض الغسيل للسماح غمس متعددة من الدبوس في اثنين أغسل الحمامات التي تحتوي على ماء مقطر و 0.002% 20 توين ل 1.5 s في كل حمام، تليها الشطف pin مع المياه النقية فائقة وتجفيف الدبوس في محطة الغسيل الرئيسي ل 4 s.
3-تخزين الصفيف
- الاحتفاظ بالشرائح المطبوعة المخزنة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في مجففة.
ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح المطبوعة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
4-صفيف السبر
- بعناية بوضع الشرائح المطبوعة في حامل شريحة لتنسيق الدوائر المتعددة جيدا 16.
ملاحظة: الدوائر، وعلى عمق حوالي 7.5 ملم، وقد توفر سطح سخية لنسبة حجم تيسيرا لخلط وغسل الخطوات. - السماح لجميع الكواشف الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال. ما لم يحدد خلاف ذلك، تنفيذ كافة الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 100 ميليلتر من المصفاة توين ألبومين المصل البقري 5% (BSAT؛ استخدام مرشح حقنه 0.2 ميكرون) كل كتلة، وتغطي الشرائح، واحتضان لهم مع الهز ح 1.
- يغسل الشرائح 5 × 1 دقيقة في 120 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة مع 20 توين (ببست؛ 0.1% توين) كل بئر بالهز. لا تدع الشرائح تجف.
- ذوبان الجليد عينات المصل في الثلج لمدة 20 دقيقة، وتمييع كل عينة مع مادة جسم متاحة تجارياً مع خلفية الحد المكون (انظر الجدول للمواد).
- تحسين تخفيف عينات المصل وفقا الغلوبولين المناعي اختبارها كما هو مبين في الجدول 2.
- نقل 100 ميليلتر من عينات المصل المخفف لجميع الكتل باستثناء واحد، والذي سيتم استخدامه كعنصر تحكم سلبية؛ أن هذه الكتلة، إضافة 100 ميليلتر من جسم مادة فقط. احتضان الشرائح مع الانفعالات لطيف ح 1.
- تغسل شرائح 5 × 3 دقيقة في 120 ميليلتر من ببست (0.1% توين) كل بئر بالهز.
- إضافة 100 ميليلتر من جسم الإنسان لمكافحة بيوتينيلاتيد الماعز المخفف بجسم مادة.
- تحسين تخفيف جسم الثانوية حسب الغلوبولين المناعي اختبارها كما هو موضح في الجدول 2. تغطي الشرائح واحتضانها لهم مع الهز لطيف ح 1.
- يغسل الشرائح 5 × 3 دقيقة في 120 ميليلتر من ببست كل بئر بالهز.
- إضافة 100 ميليلتر من ستريبتافيدين Cy5 لكل كتلة المخفف في 1:2000 في جيش صرب البوسنة 5%. تغطي الشرائح بإحباط لحمايتهم من الضوء في حين تهتز لمدة 15 دقيقة مع الانفعالات لطيف.
- تغسل شرائح 5 × 1 دقيقة كل في 120 ميليلتر من ببست كل بئر بالهز، تليها يغسل 2 من 1 دقيقة في برنامج تلفزيوني إلا بالهز.
- تدور الشرائح لمدة 5 دقائق في 300 غرام x تجفيفها.
- نضع الشرائح في مربع الظلام للنقل والتخزين في درجة حرارة الغرفة.
- الشروع في مسح صفائف فورا لضمان اتساق إشارة بعد التحقيق.
ملاحظة: بيد سبر شرائح يمكن تخزينها في الظلام والممسوحة ضوئياً في غضون أسبوع واحد من التدقيق.
5-مسح الصفيف
- التبديل على الماسح الضوئي الليزر (انظر الجدول للمواد) 30 دقيقة قبل إجراء المسح الضوئي للاحماء الليزر. تحميل برنامج الماسح الضوئي، وقم بتوصيل الكمبيوتر بالماسح الضوئي.
- ضع شريحة ذات الوجه الوجه المطبوع لأعلى في الماسح الضوئي حتى على ضوء اللعب يتحول أخضر خالص.
- اضغط على زر الإعدادات وقم بضبط الإعدادات التالية عند مسح الشرائح على النحو التالي: وضع المسح الضوئي، والوسيط؛ اقتناء، 635 فقط؛ وضع اقتناء، دليل على ذلك. كسب، 20؛ الطاقة ومنخفضة؛ نوع الشريحة، الشريحة غير مسمى؛ التركيز، والتركيز التلقائي. إيقاف "التمرير التلقائي" وتعيين قراءة الرمز الشريطي إلى بكسل حجم 10 و 35 المسح الضوئي.
- حفظ الصور الناتجة كالرمادي 16-بت تنسيق TIFF صورة متعددة. اضغط على زر الشبكة الاستيراد وتحديد قائمة صفيف مناسبة.
ملاحظة: توضح القائمة صفيف حجم وموضع سوباريس وأسماء المواد المطبوعة المرتبطة بكل مؤشر من مؤشرات الميزة.- محاذاة إلى الشبكة للبقع على الشريحة.
- تحليل الصور بالضغط على زر عملية التحديد الكمي لقياس كثافة إشارة الأسفار من كل بقعة وحفظ النتائج في تنسيق نصي يسمى جينيبيكس النتائج (لائحة برلمان غرينلاند).
ملاحظة: يحتوي الملف لائحة برلمان غرينلاند على المتغيرات التعريب وتحديد الأهداف مستضد في الصفيف وأيضا شدة الأسفار الوسطية والخلفية المحلية يمثل الربط جسم إشارة قيم لكل نقطة.
6-بيانات التحليل
- حساب الوسيط ل replicates لكل مستضد بعد الطرح الخلفية استخدام برمجيات تحليل ميكرواري حرة دعا المرحلة عكس البروتين الصفيف (ربا) محلل, وحدة نمطية داخل لغة R الإحصائي على وكراً36.
- ارسم المنحنى القياسي واقحم الإشارات لكل مستضد بالنسبة إلى المنحنى القياسي الغلوبولين المناعي باستخدام الرسوم البيانية العلمية التجارية وبرامج الإحصاءات (انظر الجدول للمواد) لحساب مستويات الأجسام المضادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 المخطط انسيابي تصف الخطوات الرئيسية في بروتوكول وصف. ويبين الشكل 2 اختبارات ارتباط سبيرمان مما يدل على اتفاق كبيرة بين ميكرواري واليسا ل IgG و IgA المضادة السم أ وب المستويات في الأمصال اختبار المريض. ويبين الشكل 3 فئة الأجسام المضادة IgG و IgA التفاضلية استجابات جسم معين بالسمية والسمية ب السم ثنائي (بكدتب) في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي دون إسهال وديمقراطيي المرضى الذين يعانون من الإسهال، وفي المفوض السامي. ويبين الشكل 4 جيم الترياق تحييد استجابات الأجسام المضادة في الأمصال المريض. يبين الشكل 5 مفاعليه المناعي (ضد السموم جيم والتخاطب) وتأثير تحييد (ضد السموم جيم ) IVIg. ويبين الشكل 6 مفاعليه المناعي (ضد السموم جيم والتخاطب)، وتحييد تأثير (ضد السموم جيم ) قبل المريض الأمصال والإدارة IVIg وظيفة. ويبين الجدول 1 مقبول داخل وبين عاصي معاملات التغير من ميكرواري استخدام الأمصال الاختبار. ويوضح الجدول 2 قائمة المناعية المستخدمة في هذه الدراسة مع التركيزات ذات الصلة من البروتينات المنقاة، فضلا عن تخفيف الأمثل للأمصال والأجسام المضادة الثانوية.
الشكل 1 : لمحة عامة عن الخطوات الرئيسية المتضمنة في البروتوكول ميكرواري. الخطوة الأولى هي إعداد مولدات المضادات، وعناصر التحكم. يتم نقل تخفيف عينة اللاحقة إلى 384-لوحة في الاستعداد للطباعة في كوادروبليكاتيس على الشرائح أمينوسيلاني. بعد التجفيف ومنع من الشرائح، هي المحتضنة لمصفوفات مع المريض الأمصال. بعد زيادة الغسيل، يتم إضافة جسم الإنسان لمكافحة بيوتينيلاتيد (Ig) من ايستب المحدد. بعد الغسيل النهائي وخطوات التجفيف، يتم مسح الشرائح ومعالجة الصور الناتجة باستخدام برنامج تحليل صورة ميكرواري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : العلاقة بين ميكرواري ونتائج أليسا. تم استخدام معامل الارتباط سبيرمان لتقييم مستوى الاتفاق بين البلدين منصات. عند مقارنة أداء ميكرواري مع مقايسة الممتز داخلية المرتبطة بالانزيم (ELISA)، A. لوحظ معامل ارتباط جيد للسم أ (r = 0.7051؛ ف < 0.0001)، ب. وارتباط جيد معتدل للسمية ب (r = 0.5809؛ ف < 0.0001). كان البروتوكول أليسا كاملة مفصلة في أماكن أخرى37. وقد أعيد طبع هذا الرقم من نجم et al. 1 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: المطثيّة العسيرة استجابات جسم ايستب محددة السموم. هذه الصورة يبذر المصل السمية المضادة IgG و IgA الردود (توكسينوتيبي 0، سلالة VPI 10463، ريبوتيبي 087؛ بالسمية في 200 ميكروغرام/مل، تكسين ب 100 ميكروغرام/مل)، السمية ب (جيم السمية المنتجة ب سلالة ككوج 20309؛ وتكسين ب 90 ميكروغرام/مل) وشكل السلائف أ ب جزء من ثنائي السمية، بكدتب (200 ميكروغرام/مل)، في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF) دون الإسهال والمرضى المصابين بالعدوى جيم (CDI) مع إسهال، وفي ضوابط صحية (HC). تخفيف المصل لل IgG و IgA هي 1: 500 و 1: 100، على التوالي. تم تقييم الاختلافات بين المجموعات باستخدام اختبار كروسكال-واليس، تليها الاختبار دن بعد المخصص لاستجابات متعددة. بالمقارنة مع المفوض السامي (n = 17) والمرضى الذين يعانون من أعراض مجتمعية (n = 16)، المرضى CF الكبار (n = 16) أظهرت مستويات أعلى بكثير من المصل إيغا مكافحة السم أ وب؛ ≤0.05 ف . نفس النمط السائد لمفتش، إلا أنه لم يكن هناك فرق في مستويات "مفتش" السمية المضادة بين الجماعات. قطع الخط الطولي والمربع يمثل الوسيط، والنطاق، و quartiles. ≤0.0001 ف ؛ ≤0.01 ف ؛ ≤0.05 ف . يتم تطبيع إشارات موحدة للمنحنى المعياري الغلوبولين المناعي. وقد أعيد طبع هذا الرقم من موناغان et al. 2 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: بلغت جسم Neutralizing جيم السموم A و B في الأمصال المرضى. يبين هذا الشكل جسم تحييد واقية الردود (NAb) للسموم جيم A و B [توكسينوتيبي 0، سلالة VPI 10463، ريبوتيبي 087، المستخدمة في جرعة مميتة 50 في المائة (LD50)] سيرا (تخفيف 1: 100؛ والسم أ 2.5 نانوغرام/ملليلتر، السمية ب 0.5 نانوغرام/مليلتر) من المفوض السامي ، المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي دون الإسهال، والمرضى الذين يعانون من ديمقراطيي بالإسهال. الأمصال من المرضى CF معارضها أقوى بكثير الردود قبض السمية المضادة الوقائية مقارنة بالأمصال من المفوض السامي (السموم A و B) ومن المرضى الذين يعانون من التدخلات (السمية A). تم تقييم الاختلافات بين المجموعات باستخدام اختبار كروسكال-واليس، تليها الاختبار دن بعد المخصص لاستجابات متعددة. قطع الخط الطولي والمربع يمثل الوسيط، والنطاق، و quartiles. ≤0.01 ف ؛ ≤0.05 ف . وقد أعيد طبع هذا الرقم من موناغان et al. 2 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : مفاعليه محصنة وتحييد تأثير IVIg إلى المستضدات C.difficile . ألف هذه الصورة يبين مفاعليه من متعدد-ايستب أجسام مضادة محددة جيم مولدات المضادات في التحضيرات التجارية الغلوبولين المناعي الوريدي (IVIg). الحرارة خريطة يوضح مستويات إيسوتيبيس جسم معين (مفتش، IgG1، IgG2، IgG3، IgG4، إيغا، IgA1، IgA2، و IgM) في ثلاثة الاستعدادات المتوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد) ضد سبعة من مولدات المضادات جيم [السمية (ميكروغرام 200 /mL)، السمية ب (100 ميكروغرام/مل)، بكدتب (200 ميكروغرام/مل)، السمية ب (ككوج 20309؛ 90 ميكروغرام/مل)، والسطح طبقة البروتينات (SLPs) 001 و 002 و 027 (فكل 200 ميكروغرام/مل)] باستخدام تقنية ميكرواري البروتين. رمز اللون خريطة الحرارة على النحو التالي: الأخضر (منخفض) إلى كثافة إشارة حمراء (عالية). تكون القيم إشارة ممثلة للحرارة خريطة بمقياس اللون log2-تحويل من وحدات fluorescence التعسفي (عبدالرحمن). يرجى ملاحظة أنه في الآونة الأخيرة محله عبدالرحمن واصف موحدة إشارات2. وقدم إيسوتيبيس IgG و IgG1 و IgG2 مجموع ريكتيفيتيس ملزم أعلى ضد السم أ، السمية ب، السمية ثنائي (بكدتب)، والسمية ب (ككوج 20309). ب. هذه المؤامرات إظهار فعالية تحييد IVIg ضد الأصلية جيم كله السموم A و b أنها تعطي النسبة المئوية لتأثير تحييد واقية من المنتجات التجارية IVIg ضد السموم جيم A و b ويمثل كل الأرض متوسط ثلاث تجارب في تمييع 1: 100. إعداد IVIg 1 يسلك تأثير وقائي أدنى بالمقارنة مع الأعمال التحضيرية IVIg 2 و 3، ولا سيما ضد السم أ * * * ف ≤0.0001؛ ≤0.05 ف (اتجاه واحد تحليل التباين). وقد تم تعديل هذا الرقم من نجم et al. 3 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : مفاعليه محصنة وتحييد تأثير الأمصال للمريض إلى المستضدات جيم . ألف هذا الرقم يبين مقارنة بين ريكتيفيتيس الأجسام المضادة ضد البروتينات جيم في الأمصال المرضى قبل وبعد ضخ IVIg. الحرارة خريطة توضح مستوى التعبير إيسوتيبيس (مفتش، IgG1، IgG2، IgG3، IgG4، إيغا، IgA1، IgA2، و IgM) في عينات المصل في المرضى السبعة قبل وبعد ضخ IVIg ضد سبعة جيم المستضدات [السم (200 ميكروغرام/مل)، والسمية ب (100 ميكروغرام/ مل)، بكدتب (200 ميكروغرام/مل)، السمية ب (ككوج 20309؛ 90 ميكروغرام/مل)، والتخاطب 001 و 002 و 027 (فكل 200 ميكروغرام/مل)] باستخدام تقنية ميكرواري البروتين. رمز اللون خريطة الحرارة على النحو التالي: الأخضر (منخفض) إلى كثافة إشارة حمراء (عالية). تكون القيم إشارة ممثلة للحرارة خريطة بمقياس اللون تحول log2 من عبدالرحمن. يرجى ملاحظة أن عبدالرحمن محله في الآونة الأخيرة إشارات موحدة2. وكان هناك تعزيز ضخ بعد ريكتيفيتيس IgG IgG1، IgG2 و IgG3 الكلي للسم أ والسم ب بكدتب. ب-هذه الصورة تظهر الاستجابات مفتش للسم أ، السمية ب، وثنائي السمية (بكدتب)، قبل و IVIg وظيفة الإدارة. إجمالي المستويات مفتش مكافحة السموم جميع إظهار زيادة كبيرة عقب IVIg الإدارة (باستخدام اختبار رتبة وقعت الرتبي). كل الأرض يمثل متوسط ثلاث تجارب في 01:10 إضعاف. ج. هذه المؤامرات إظهار تأثير تحييد ضد الأصلية جيم السموم A و B عقب IVIg الإدارة. مقارنة بين ما قبل وما بعد ضخ تحييد أنشطة الضد يظهر تأثير حماية معززة بعد ضخ IVIg ضد الأم السموم جيم A و b كل الأرض يمثل متوسط ثلاث تجارب في 01:10 إضعاف. ولوحظ زيادة كبيرة في تأثير وقائي ضد السموم A و B في ضخ IVIg وظيفة المريض الأمصال اختبار (باستخدام اختبار رتبة وقعت الرتبي). وقد أعيد طبع هذا الرقم من نجم وآخرون. 3 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| إمكانية تكرار نتائج | السم أ | السمية ب | SLP001 | SLP002 | SLP027 | السمية ب ككوج 20309 | ب بكدت |
| الفحص داخل | 7، 70% | 6.40% | 7.40% | 5.10% | 7.60% | 7 في المائة | 3.70% |
| المقايسة بين الوكالات | 9.10% | 9.10% | 7.40% | 11.20% | 12.8 | 9.70% | 12.50% |
الجدول 1: الدقة داخل-الفحص والتحليل بين الوكالات ميكرواري 1-حسبت ميكرواري داخل وبين عاصي التقلبات استخدام الأمصال للمرضى 7. كانت جزيئي عينات مماثلة في كل من شريحتين في اثنين من النقاط الزمنية مستقلة. جميع المستضدات (n = 7 الاختبار و n = 2 ضوابط) قد رصدت في replicates خمسة في كل مجموعة.
| تركيز البروتين المنقي | تخفيف المصل | تمييع جسم الثانوية | |
| مفتش | 50 ميكروغرام/مل | 1/500 | 1/20000 |
| IgG1 | 200 ميكروغرام/مل | 1/100 | 1/5000 |
| IgG2 | 200 ميكروغرام/مل | 1/100 | 1/10000 |
| IgG3 | 200 ميكروغرام/مل | 1/100 | 1/5000 |
| IgG4 | 200 ميكروغرام/مل | 1/100 | 1/5000 |
| إيغا | 50 ميكروغرام/مل | 1/100 | 1/5000 |
| IgA1 | 200 ميكروغرام/مل | 1/100 | 1/10000 |
| IgA2 | 200 ميكروغرام/مل | 1/100 | 1/5000 |
| IgM | 50 ميكروغرام/مل | 1/500 | 1/20000 |
الجدول 2: قائمة المناعية المستخدمة في هذه الدراسة. وترد Igs مع تركيزات البروتين المنقاة ذات الصلة (ميكروغرام/مل) وتخفيف لمصل الدم والأجسام المضادة الثانوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، وقد أظهرنا ذلك ميكرواري منصة مناسبة لتحديد الاستجابات المناعية خلطيه جيم البروتين المستضدات في الأمصال المريض (الشكلان 3 و 6) والتحضيرات التجارية من IVIg (الشكل 5). وقد أثبتنا أيضا أن تقنية ميكرواري أداء جيدا بالمقارنة مع أليسا التقليدية (الشكل 2)، ويبين إمكانية تكرار نتائج ممتازة، مع التقلبات داخل وبين عاصي تقع ضمن حدود مقبولة من الدقة ( الجدول 1).
خطوات حاسمة:
يجب أن يتبع عدد من الخطوات الهامة عند بناء أي منصة ميكرواري مستضد ناجحة. في البداية، بالغ الأهمية لتشغيل التجارب ومراقبة الجودة. في هذه التجارب ومراقبة الجودة، وينبغي تقييم معلمات مختلفة، مثل اختيار الكيمياء السطحية الملائمة، المخازن المؤقتة الطباعة، المخازن المؤقتة للحظر، وتخفيف عينات مصل الدم والأجسام المضادة الثانوية. يجب إجراء هذه التجارب بهدف تقديم38،تقنية تم التحقق من صحتها جيدا وموثوق بها39.
اختيار عملية تجميد البروتين المناسبة واحدة من أهم الخطوات في تحليلات ميكرواري، لضمان أداء عالي الجودة للشرائح أمينوسيلاني اختبارها، كما رأينا في هذه الدراسة. من الأهمية بمكان ملاحظة مورفولوجيا بقعة العادية والتعميم، وكثافة إشارة عالية ومحددة، وخلفية واضحة. وثمة عامل آخر يؤثر على أداء ميكرواري هو المخزن المؤقت الطباعة، والذي نفس القدر من الأهمية لتحقيق الكيمياء السطحية المطلوبة لإنتاج البقع موحدة ومنتظمة على الشريحة.
من المهم تحديد الإعدادات الصحيحة للطباعة كما سيسمح هذا الحجم الأمثل وشكل بقعة لتتم طباعتها. على سبيل المثال، مستوى الرطوبة ينبغي الإبقاء على حوالي 55% أثناء الطباعة، لأنه دون الرطوبة هو زيادة معدل التبخر في قاعة ميكرواري وتطبع البقع أقل.
البروتين الخاصة بعدم ربط عاملاً إضافيا يؤثر على الخلفية وإشارات موضعية؛ ولذلك، يمكن أن تقلل الاختيار المناسب للمخزن المؤقت حظر أي ربط غير محددة، مما يؤدي إلى تحسين حساسية ودقة البيانات الصفيف39.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:
مولدات المضادات، وعينات المصل يجب أن تكون الكوتيد والمخزنة في أصغر الأنابيب التخزين في الثلاجة حتى الاستخدام، مما يساعد على تجنب تكرار دورات تجميد أذاب متعددة، والتي يمكن أن تتدهور قوة الإشارة من الصفيف. لتعزيز فرص تجربة ناجحة، يجب أن يكون إعداد جديدة جميع المواد الكاشفة وتتم تصفيته. التنظيف في أرايير قبل الطباعة والتحقق من الإعدادات المطلوبة. وعلاوة على ذلك، يجب أن يبقى صاحب الشريحة النظيفة للحد من الضوضاء في الخلفية.
القيود:
التطبيق [ميكروارس] البروتين يعوقه حاليا الطلب الصارمة في الكيمياء السطحية في تلفيق ميكرواري البروتين. هنا يقتضي التباين الكبير في الخصائص الكيميائية والفيزيائية للجزيئات البروتينية الكيمياء السطحية فريدة من نوعها تصميم مخصص لفئات مختلفة من البروتين والأجسام المضادة جزيئات40. غيرها من التحديات التقنية التي تواجه تنفيذ هذه التكنولوجيا على نطاق واسع وتشمل الحاجة إلى معدات متخصصة مكلفة والبرمجيات مع مقاعد البدلاء-المساحة المخصصة، فضلا عن النظر في رسوم صيانة، وتحليل البيانات المعقدة، والنسبية تقدير البروتين، والوصول إلى المستضدات المنقي خطيرة.
أهمية الأسلوب فيما يتعلق بالأساليب القائمة البديلة:
ميكرواري التكنولوجيا مماثل من حيث المبدأ لإليزا أو المتوسط الحجم اكتشاف تحديدكم لوميناكس، لكن قابل للتخصيص ويمكن زيادتها إلى تحقيق قوة إحصائية، يعتمد على كميات ميكروليتير فقط من عينات ثمينة، ولديه القدرة على الشاشة سيرا لمتعددة البروتين ريكتيفيتيس. ولذلك مناسبة خاصة للمصارف المصل على نطاق واسع، والتاريخية، واكتشاف العلامات البيولوجية والفرز.
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات للأسلوب:
وستوجه الجهود المستقبلية نحو الاستفادة المثلى من الفحص لعينات أخرى (خلية supernatants)، استخدام المقايسة كأداة تشخيصية للمرضى من الطبقات، المؤشرات الحيوية المحتملة خارجياً التحقق من استخدام أفواج كبيرة بطريقة مزدوجة التعمية، و التنبؤ وتحسين استجابة للعلاج المناعي (الإنسان والمحيط الحيوي، واللقاحات). وفي المستقبل، يمكن استخدام التكنولوجيا ميكرواري في المستشفيات كأداة تشخيصية مفيدة أو لمراقبة المخدرات خطة علاج على مدى فترة من الزمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا شيء.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث "زمالة هيرميس" نجم علا وموناغان تانيا ومن خلال تمويل مستقل من مركز أمراض الجهاز الهضمي في نوتنغهام و NIHR نوتنغهام الجهاز الهضمي الأمراض الطبية مركز البحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
References
- Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
- Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
- Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
- Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31 (2017).
- Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
- Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
- Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
- Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
- Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
- Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
- Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
- Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
- Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
- Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
- Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
- Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
- Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21 (2013).
- Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
- Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
- Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
- Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
- Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).
- Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
- Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).
- Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).
- Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349 (2015).
- Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
- Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).
- Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
- Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
- Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).
