Summary
이 문서 Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원에 인간 세라 정화 7-플렉스 패널의 체액 면역 반응 높은 프로 파일링에 대 한 간단한 단백질 microarray 메서드를 설명 합니다. Polyclonal 정 맥 면역 글로불린의 준비에 특정 항 체 반응의 결정에 대 한 프로토콜을 확장할 수 있습니다.
Abstract
우리Clostridium 남과 어울리지 않는 항 체 수준의 polyclonal 정 맥 면역 글로불린 (IVIg)의 별도 준비와 인간의 세라에서의 안티-결정에 대 한 소설 높은 처리량 단백질 microarray 분석 결과 대 한 자세한 개요를 제공합니다. 프로토콜 샘플 준비, 배열, 시험 절차, 및 데이터 분석의 인쇄에 관련 된 방법론 단계를 설명합니다. 또한,이 프로토콜 플라즈마를 포함 한 다양 한 임상 샘플을 통합 하 고 문화 supernatants 셀을 더 개발 될 수 있습니다. 우리는 단백질 microarray를 사용 하 여 isotype (IgG, IgA, IgM), 서브 클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2)의 조합을 결정 하는 방법을 보여 및 스트레인-특정 항 체를 매우 전체 C. 남과 어울리지 않 는 정화 독 소 A와 B (toxinotype 0, 스트레인 VPI 10463, ribotype 087), C. 남과 어울리지 않는 독 소 B만 표현 스트레인 (CCUG 20309)에서 독 소 B, 이진 독 소, pCDTb, ribotype 특정 전체 표면 층 단백질 B 조각의 선구자 형태 (SLPs; 001, 002, 027), 단백질 (파상풍을 제어 사망 toxoid 그리고 Candida albicans)입니다. 실험 기간 동안 microarrays 세라 C. 감염과 (CDI), 낭 성 섬유 증 (CF) 설사, 건강 한 컨트롤 (HC), 없이 개인으로 개인 및 개인 사전 및 포스트 IVIg 치료와 함께 조사 됩니다는 CDI, 결합 된 면역 결핍 장애 및 만성 염증 demyelinating polyradiculopathy의 치료. 우리 환자 단체, IVIg, 그리고 전에 세라의 상업적인 준비와 다음 IVIg 관리 사이 독 소 중립화 신진대사 및 멀티 isotype 특정 항 체 수준에 큰 차이가 발생합니다. 또한, 있다 microarray 및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 사이의 중요 한 상관 관계 항 독 소 IgG 수준에 대 한 혈 청 샘플에서. 이러한 결과 microarray 예방 접종 또는 감염 된 인간 C.difficile 항 원에 항 체 응답을 프로 파일링 하기 위해 유망한 도구가 될 수 것이 좋습니다. 항 원 패널과 생산 비용에 있는 감소의 더 수정, 우리는 microarray 기술을 최적화 하 고 환자 별로 C. 감염과 대 한 가장 임상적으로 유용한 immunotherapies를 선택 도움이 될 수 있습니다 예상.
Introduction
이 프로토콜 개발 및 검출을 위한 소설과 맞춤형 단백질 microarray 분석 결과의 검증 및 세균성 긴장 및 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 항 체 isotype-특정 응답의 반 정량화에 설명합니다. 우리는 성공적으로 우리의 C. 남과 어울리지 않는 사용-특정 항 체 환자 세라1,2, IVIg3, 준비에에서 콘텐츠 구성 bioanalysis 유망한 새로운 툴으로 서 분석 결과 특정 microarray 및 CDI4가난한 결과 연관 항 체 특이성의 식별. 시연 어떻게 biobanked 혈 청 샘플 및 IVIg의 상업적인 준비 microarray 슬라이드에 분석 될 수 있다 C. 남과 어울리지 않는 병원 체 특정 항 체 반응을이 분석 결과의 높은-품질 프로 파일링를 재현할 수 있도록 합니다.
많은 건강 한 아이 들 및 성인 있고 C. 남과 어울리지 않는 독 소 A에 감지 혈 청 IgG와 IgA 항 체 B5,6. 이러한 초기와 성인에서 C. 남과 어울리지 않 는 노출 다음 중 과도 노출 다음 발생 생각 된다. 이러한 이유로, polyclonal IVIg 되었습니다 재발 및 fulminant CDI7,,89치료에 오프 라벨을 사용. 그러나, 그것의 확실 한 역할 그리고 행동의 모드 불분명 남아 있습니다. 몇 가지 연구는 C. 남과 어울리지 않는 독 소를 체액 면역 반응에서 역할을 질병 프레 젠 테이 션 및 결과 나타났습니다. 특히, 무 증상 환자 증상 질병10을 개발 하는 환자에 비해는 증가 혈 청 항 독 소 A IgG 농도 표시. 명백한 협회 중간 항 독 소 A IgG titers 및 30 일 모든 원인 사망11보고 되었습니다. 여러 보고서 또한 독 소 A, B, 그리고 여러 비 독 소 항 (Cwp66, Cwp84, 플, FliD, 및 표면 층 단백질 (SLPs)) 재발과 항 체 응답에 대 한 보호와 연결을 계시 했다12,13 , 14 , 15. 이러한 관측을가 했다가 개발의 첫 번째 수동 immunotherapy 마약 대상 C. 남과 어울리지 않는 독 소 B (bezlotuxumab)는 최근 미국 식품 의약품 안전 청 및 유럽 의약품에 의해 승인 되었습니다 재발 CDI16의 예방을 위한 기관. 사 독 소 또는 재조합 독 소 조각을 사용 하 여 예방 접종 전략은 또한 현재 개발17,,1819에서. 이러한 새로운 치료 접근 의심할 여 지 없이 큰 샘플 크기에 여러 항 원에 체액 성 면역 반응 평가 대 한 요구를 자극할 것 이다.
오늘날, 세균성 긴장 및 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 항 체 isotype-특정 응답을 동시에 평가 가능 상업적으로 사용 가능한 높은 처리량 분석 실험의 주목할 만한 부족이 있다. 미래 연구 및 임상 응용을 촉진 하기 위하여 이러한 분석을 개발 하는 충족 되지 필요가 있다. 단백질 microarrays는 현미경 슬라이드 기반 표면에 반점의 공간적 조직 배열로20 접촉 또는 비 접촉 될 수 있는 로봇 시스템을 사용 하 여 개별적으로 순화 된 단백질의 많은 수를 무력화 하는 방법 인쇄 도구21. 관광 명소는 세포 lysates, 항 체, 조직 homogenates, 내 인 성 또는 재조합 형 단백질 또는 펩 티 드, 체액 또는 약물22,23등 복잡 한 혼합물을 나타낼 수 있습니다.
단백질 microarray 기술 표준 사내 ELISA 뚜렷한 장점이 안티-C. 남과 어울리지 않는 항 체 응답을 평가 하기 위해 전통적으로 사용 된 기술을 제공 합니다. 이들은 다양 한 단백질 목표, 항 원, 예제 및 시 약에 대 한 요구 사항 감소 볼륨의 더 광범위 한 패널에 대 한 멀티-isotype-특정 항 체를 탐지 하기 위한 용량 증가 및 더 큰 통합 향상된 된 능력 기술 복제 뿐만 아니라 여러 내부 품질 관리 (QC)의 수1를 측정합니다. Microarrays는 따라서 더 정확한, 과민 하 고 재현할 수 있고 큰 동적 범위. 이러한 요인 microarrays는 저렴 하 고 잠재적으로 유리한 대안 ELISAs 알려진된 단백질의 대규모 검색에 대 한 확인합니다. 그러나, microarray 기술의 단점 매우 순화 된 항 원의 패널 구축 및 기술 플랫폼을 설정 관련 된 큰 초기 비용에서 주로 유래한 다.
단백질 microarrays 임상 응용 프로그램에 진단 및 기본 연구 공구로 지난 2 년간 광범위 하 게 사용 되었습니다. 단백질 발현 프로 파일링, 효소-기질 관계, 바이오 마커 검사, 호스트-미생물 상호작용의 분석의 연구 및 항 체 특이성23,24, 프로 파일링을 포함 하는 특정 응용 프로그램 25,26,,2728. 말라리아 (변형 체)29, 에이즈-130,31독감, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)32, 바이러스 성 출혈 성 열33 포함 하 여 많은 새로운 병원 체 단백질/항 microarrays 설립 되었습니다. , herpesviruses34및 결핵35.
현재 프로토콜 쉬운 운영 C. 남과 어울리지 않 는 반응 항 원 microarray 분석 결과, 멀티 isotype 및 c.에 대 한 스트레인 특정 항 체 응답의 정밀, 정확 하 고 특정 정량화를 가능 하 게의 설립에 관한 남과 어울리지 않는 세라와 IVIg polyclonal 항 원. 여기, 우리는 프로필 ELISA 분석 결과 정밀도 및 재현성에 비해 허용 microarray 분석 결과 성능에 관한 대표적인 결과 포함 합니다. 이 분석 결과 다른 임상 샘플 프로 파일링에 더 개발 될 수 있습니다 고 CDI의 분자 기준으로 연구에 대 한 새로운 표준을 설정 합니다.
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Protocol
1. 준비 Microarray 플레이트
- (이 환자 세라를 실행 하기 전에 미리 정의 된) 최적 농도에서 인쇄 버퍼 [PBS-트윈-트 레 할 로스 (50mm)] C. 남과 어울리지 않는 항 원 희석: 독 소는 (200 µ g/mL) 및 독 소 B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL), 및 순화 된 네이티브 전체 SLPs ribotypes 001, 002, 027 (200 µ g/mL)에서 파생 된.
참고: 독 소 B 독 소 B 표현 스트레인 CCUG 20309 (90 µ g/mL)에서 얻은 것입니다.- 긍정적인 컨트롤, C. albicans, 및 100 µ g/mL에서 인쇄 버퍼와 파상풍 사망 toxoid lysates 희석. 마지막으로, 일치 시험된 항 체 isotype 직렬, 10 희석 한 교정 커브를 생성 인쇄 버퍼에 걸쳐 50 µ g/mL에서 시작 순화 인간 면역 글로불린 희석.
- 384 잘 격판덮개로 인쇄 버퍼에 희석의 10 µ L를 전송 합니다.
- 커버 플레이트 플레이트 물개 및 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기와.
2. 인쇄 연락처 로봇 배열
- 열 휴대용 가스 버너 3 x 2 각 s를 사용 하 여 실리콘 핀 하 고 깨끗 한 물 3 x 3 s에 린스.
- arrayer의 로드 카트리지에 microarray 접시를 놓습니다.
- Aminosilane 슬라이드 슬라이드 트레이에 놓습니다.
참고: 슬라이드 트레이 27 슬라이드를 저장할 수: 9 슬라이드의 세 행. 슬라이드 아래쪽 행의 왼쪽에서 시작 하는 세로 방향으로 배열 되 고 공간의 나머지 빈 슬라이드에 슬라이드 트레이에서 모든 구멍 커버는 되도록 덮여 있다.- 확인 누르고 진공 켜져 있고 모든 슬라이드는 보안 확인. 인쇄를 시작 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 습 한 환경에서 슬라이드를 둡니다.
참고: aminosilane 슬라이드는 방 습 제로 밀봉된 주머니에 제공 됩니다. 일단, 어떤 사용 되지 않는 슬라이드 만료 날짜까지 저장용 desiccator에 즉시 반환 되어야 합니다.
- 확인 누르고 진공 켜져 있고 모든 슬라이드는 보안 확인. 인쇄를 시작 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 습 한 환경에서 슬라이드를 둡니다.
- Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원 인쇄에 적합 한 인쇄 프로그램을 설정 합니다. TAS 응용 프로그램 제품군을 실행 하 고 ' 내 Gridding 실행 ' 디렉터리에서 필요한 인쇄 실행된 매개 변수 파일을 엽니다. 모든 Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원에 quadruplicate 인쇄 Clostridium 남과 어울리지 않 는 파일을 선택 합니다.
- 주 창에 MicroArray 아이콘을 두 번 클릭 시 3 탭 창 라는 'MicroArraying 파라미터' 표시 됩니다. 세 개의 탭은 "원본," "대상"과 "옵션." "소스" 탭 내용을 microarray 접시에서 사용 되는 샘플의 수를 나타냅니다. "대상" 탭 어떻게 슬라이드는 로드, 배열 슬라이드 인쇄 하 고 슬라이드 레이아웃 (16 하위 형식) 편집의 세부 정보를 표시 합니다. "옵션" 탭에는 세척 프로토콜 및 도구 사용된 예를 보여 줍니다. 모든 완성 된 샘플 후 씻어. 다른 샘플 사이 어떤 상호 오염 든 지 피하기 위하여 샘플 사이의 실리콘 핀을 청소 하십시오.
- 프로그래밍 옵션은 옵션 아래에 있는 > TAS 스위트 도구 모음에서 환경 설정을 실행. 통해이 섹션에서 작업을 9 탭이 있습니다 그리고 당신이 완전 한 하나의 탭에 클릭 하 여 다음 이동. "확인" 버튼을 클릭 하면 "실행 환경 설정." 밖으로 이동 됩니다. "실행 환경 설정"의 "일반" 탭에서 어떻게 악기는 프로그램이 시작 될 때 동작에 관련 된이 섹션에서 사용할 수 있는 확인란 수가 있다. "실행의 시작 전에 프라임 목욕" 확인란을 모든 3 개의 세척 스테이션 실행된 시작 전에 짧은 못쓰게 시퀀스를 받게 될 것 이다. 첫 번째 소스 방문 전에 확인 "실행의 시작에 세척" 상자, 핀 도구 세척 될 것 이다. "세척 실행의 끝에" 체크 박스를 선택 후 마지막 소스 방문 핀 도구 세척 될 것 이다. 사용자는 세척 주기의 수를 설정할 수 있습니다. "실행 환경 설정"의 "기후" 탭에는 습기를 시작 합니다. 우리가 사용 하는 설정에는 다음과 같습니다: 율 55%, 최소 습도 55%, 대상 습도 60% 실행 시작 속도 55%. 대상 습도 도달 했습니다, 그렇지 않으면 관광 명소 잘못 된 크기 및 도서관 것 이다 급속 하 게 증발 때까지 실행을 시작 하지 마십시오.
- TAS의 메뉴 모음에서 녹색 이동 버튼을 클릭 합니다. 실행을 시작 하 고 주기적으로 특정 다 수 인쇄 실행 하는 동안 arrayer는 확인 합니다.
참고: 수 있습니다 각 슬라이드에 병렬로 15 샘플의 분석을 한 하위 부정적인 컨트롤으로 사용 됩니다. 배열의 디자인 인쇄 된 단백질 (항 원)의 수에 의해 결정 되 고 인쇄 된 생물의 수 복제 합니다.
참고: 각 샘플 인쇄 후 머리 진행 세척 목욕 증류수 및 0.002% 포함 하는 2 개의 세척 목욕으로 핀을 여러 찍기 수 있도록 1.5 트윈 20 각 목욕에 s 뒤에 핀 초 순수한 물으로 헹 구 고 건조에 핀 4 주요 워시 역 s.
3입니다. 스토리지 배열
- 인쇄 된 슬라이드는 desiccator에서 실내 온도에 밤새 껏 저장 하십시오.
참고: 인쇄 된 슬라이드는 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.
4. 배열 검색
- 조심 스럽게 16 다 잘 실 형식의 슬라이드 홀더 인쇄 슬라이드 장소.
참고: 챔버, 약 7.5 m m의 깊이 갖는 혼합 및 세척 단계 볼륨 비율에 관대 한 표면 제공. - 모든 시 약을 사용 하기 전에 실내 온도를 따뜻하게 수 있습니다. 달리 지정 하지 않는 한 실 온에서 모든 다음 단계를 수행 합니다.
- 필터링 된 5% 소 혈 청 알 부 민 트윈 (BSAT; 사용 필터 주사기 0.2 µ m) 각 블록, 슬라이드, 커버와 함께 1 시간 동안 흔들어 그들을 품 어를 100 µ L를 추가 합니다.
- 슬라이드 5 x 1 분 인산 염 버퍼의 120 µ L에 트윈 20 식 염 수 세척 (PBST; 0.1% 트윈) 동요와 당. 슬라이드를 밖으로 건조 하지 마십시오.
- 20 분 동안 얼음에 혈 청 샘플을 해 동 하 고 배경 구성 요소 감소와 희석제를 상업적으로 사용할 수 있는 항 체와 각 샘플을 희석 ( 재료의 표참조).
- 표 2와 같이 테스트 면역 글로불린에 따라 혈 청 샘플의 희석을 최적화 합니다.
- 하나, 부정적인 컨트롤;로 사용 될 것입니다를 제외 하 고 모든 블록을 희석된 혈 청 샘플의 100 µ L를 전송 이 블록에만 항 체 희석제의 100 µ L를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 부드러운 동요와 함께 슬라이드를 품 어.
- PBST의 120 µ L에서 슬라이드 5 x 3 분을 세척 (0.1% 트윈) 동요와 당.
- biotinylated 염소 반대로 인간 항 체 항 체 희석제로 희석의 100 µ L를 추가 합니다.
- 표 2에 설명 된 대로 테스트 면역 글로불린에 따라 이차 항 체의 희석을 최적화 합니다. 슬라이드 커버 하 고 1 시간 동안 부드러운 흔들어으로 그들을 품 어.
- 잘 흔들어 당 PBST의 120 µ L에서 슬라이드 5 x 3 분을 씻어.
- 각 블록 5 %BSA 1: 2000에서 희석 streptavidin Cy5의 100 µ L를 추가 합니다. 부드러운 동요와 15 분 동안 흔들어 동안 빛에서 그들을 보호 하기 위해 호 일 슬라이드 커버.
- 슬라이드 5 x 1 분 각 120 µ L에서 PBST의를 씻고 잘 떨고, 당 각 PBS에 1 분의 2 세척만 떨고 다음.
- 그들을 건조 300g x 5 분에 대 한 슬라이드를 회전 합니다.
- 실내 온도에 전송 및 저장에 대 한 어두운 상자에 슬라이드를 유지.
- 프로 빙 후 신호 일관성을 보장 하기 위해 즉시 배열 검사를 진행 합니다.
참고: 그러나, 탐지 슬라이드 수 어둠 속에 저장 되며 프로 빙에서 1 주일 이내 스캔.
5. 배열 검색
- 레이저 스캐너에 전환 ( 재료의 표참조) 워밍업 레이저 스캔 하기 전에 30 분. 스캐너 소프트웨어를 업로드 하 고 스캐너를 컴퓨터에 연결 합니다.
- 플레이 빛 녹색 변할 때까지 슬라이드 인쇄 된 쪽 얼굴을 스캐너에 놓습니다.
- 설정 단추를 누르고 다음 설정을 조정 할 때 다음과 같은 슬라이드를 스캔: 스캔 모드, 중간; 수집, 635만; 수집 모드, 수동; 이득, 20; 전력, 낮은; 슬라이드 유형, 레이블 없는 슬라이드; 초점, 자동 초점입니다. 자동 스크롤을 끄고 픽셀 크기 10와 35 스캔 바코드 읽기 설정.
- 여러 이미지를 TIFF 형식 16 비트 회색조로 결과 이미지를 저장 합니다. 가져오기 격자 단추를 누르고 적절 한 배열 목록 선택.
참고: 배열 목록 크기와 배열의의 위치와 각 기능 표시기와 관련 된 인쇄 된 물질의 이름을 설명 합니다.- 슬라이드에 반점에 그리드를 정렬 합니다.
- 각 명소의 형광 신호 강도 측정 하 고 GenePix 결과 (GPR)를 호출 하는 텍스트 형식으로 결과 저장을 정량화 과정 버튼을 눌러 이미지를 분석 합니다.
참고: GPR 파일 배열에 항 원 대상의 현지화 및 식별 변수를 포함 하 고 또한 항 체 바인딩을 나타내는 로컬 배경과 중간 형광 강도 신호 각 자리 값.
6. 데이터 분석
- 배경 빼기 라는 역 상 단백질 배열 (RPPA) 분석기, 크 랑36R 통계 언어 모듈 무료 microarray 분석 소프트웨어를 사용 하 여 후 각 항의 복제에 대 한 중앙값을 계산 합니다.
- 표준 곡선을 플롯 하 고 각 항 원 항 체 수준을 계산 하 상업 과학 그래프 및 통계 소프트웨어 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 면역 글로불린 표준 곡선을 기준으로 신호 보간.
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Representative Results
그림 1 설명된 프로토콜의 주요 단계를 설명 하는 순서도를 보여 줍니다. 그림 2 는 상당한 사이 계약 microarray ELISA IgG와 IgA 항 독 소 A와 B 환자 테스트 세라 수준을 보여주는 Spearman 상관 관계 테스트. 그림 3 설사 없이 CF 환자, 설사, CDI 환자와 HC에서 독 소 A, B, 독 소 및 이진 독 (pCDTb)에 대 한 특정 항 체 응답 차동 IgG와 IgA 항 체-클래스를 보여준다. 그림 4 는 C. 남과 어울리지 않는 항 독 소 중화 항 체 응답 환자 세라. 그림 5 ( C. 남과 어울리지 않는 독 소 및 Slp)에 대하여 면역 반응성 IVIg의 중화 효과 ( C. 남과 어울리지 않는 독 소)에 대해 보여 줍니다. 그림 6 ( C. 남과 어울리지 않는 독 소 및 Slp)에 대하여 면역 반응 및 환자 세라 사전 및 포스트 IVIg 관리 ( C. 남과 어울리지 않는 독 소)에 대 한 중화 효과 보여 줍니다. 표 1 허용 내부 및 남북 assay의 계수 테스트 세라를 사용 하 여 microarray의 다양성을 보여준다. 표 2 에서는 세라와 2 차 항 체에 대 한 최적화 된 희석으로 순화 된 단백질의 관련 농도 함께이 연구에 사용 된 면역 글로불린의 목록을 보여 줍니다.
그림 1 : Microarray 프로토콜에 관련 된 주요 단계에 대 한 일반적인 개요. 첫 번째 단계는 항 원 및 컨트롤의 준비 합니다. 다음 샘플 희석 aminosilane 슬라이드에 quadruplicates에 인쇄 준비 384-접시에 전송 됩니다. 건조 하 고 슬라이드의 차단, 배열 환자 세라와 함께 알을 품는. 씻은 후 추가, 지정된 isotype의 biotinylated 안티 인간 면역 글로불린 (Ig) 추가 됩니다. 최종 세척 및 건조 단계 후 슬라이드를 검색 하 고 결과 이미지 microarray 이미지 분석 소프트웨어와 함께 처리 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Microarray 및 ELISA 결과 간의 상관 관계. Spearman 상관 계수는 두 플랫폼 간의 계약의 수준을 평가 하기 위해 사용 되었다. 때 내부 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), A로 microarray 성능 비교. 좋은 상관 계수 A의 독 소에 대 한 관찰 되었다 (r = 0.7051; P < 0.0001), B. 그리고 독 소 B에 적당히 좋은 상관 관계 (r = 0.5809; P < 0.0001). 전체 ELISA 프로토콜 되었습니다37다른 상세한. 이 그림 Negm 외 에서 재 인 쇄 되었습니다. 1 허가입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Isotype-특정 항 체 응답 Clostridium 남과 어울리지 않 는 독 소. 이 이미지는 혈 청 항 독 소 IgG와 IgA 응답 (toxinotype 0, 스트레인 VPI 10463, 087 ribotype; 200 µ g/mL, 독 소 B 100 µ g/mL에서 독 소 A), 뿌리 독 B (C. 남과 어울리지 않는 독 소 B 생산 스트레인 CCUG 20309; 독 소 B 90 µ g/mL)와 B의 선구자 형태 이진 독 소, pCDTb (200 µ g/mL), 낭 성 섬유 증 (CF) 없이 설사, C. 감염과 (CDI)와 설사, 환자와 환자와 건강 한 컨트롤 (HC)의 조각. IgG와 IgA에 대 한 혈 청 희석은 1: 500, 1: 100, 각각. 그룹 간의 차이 여러 반응에 대 한 던의 포스트 hoc 테스트 다음 Kruskal-월리스 테스트를 사용 하 여 평가 됐다. HC와 비교 (n = 17)와 증상 CDI와 환자 (n = 16), 성인 CF 환자 (n = 16) 전시 하는 상당히 높은 수준의 혈 청 IgA 항 독 소 A의 및 B 수준; P 0.05입니다. 동일한 패턴 극복 IgG에 대 한 제외 하 고 그룹 사이 항 독 소 A IgG 수준에 차이가 없었다. 상자와 수염 음모 중앙값, 범위, 및 quartiles를 나타냅니다. P ≤0.0001; P ≤0.01; P 0.05입니다. 표준화 된 신호 면역 글로불린 표준 곡선을 정규화 됩니다. 이 모나 외 에서 재 인 쇄 되었습니다. 2 허가입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 중화 방 청 항 체 신진대사를 C. 남과 어울리지 않 는 독 소 A와 B 환자 세라에. 이 그림에서는 보호 중화 항 체 (NAb) 응답 C. 남과 어울리지 않는 독 소 A와 B [toxinotype 0, 스트레인 VPI 10463, 087, ribotype 50% 치 사 량 (LD50) 사용]에 세라 (1: 100 희석; 독 A 2.5 ng/mL, 독 소 B 0.5 ng/mL)는 HC에서 설사, 하지 않고 CF와 환자 및 설사와 CDI와 환자. CF 환자에서 세라 세라 HC (독 소 A와 B)에서 CDI (독 소 A)을 가진 환자에서와 비교해 상당히 강한 보호 항 독 소 NAb 응답 전시. 그룹 간의 차이 여러 반응에 대 한 던의 포스트 hoc 테스트 다음 Kruskal-월리스 테스트를 사용 하 여 평가 됐다. 상자와 수염 음모 중앙값, 범위, 및 quartiles를 나타냅니다. P ≤0.01; P 0.05입니다. 이 모나 외 에서 재 인 쇄 되었습니다. 2 허가입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 면역 반응 및 C.difficile 항 원에 IVIg의 효과 중화. A. 이 이미지에서는 멀티 isotype의 반응성 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 특정 항 체 상업 정 맥 면역 글로불린 (IVIg) 준비. 열 지도 7 C. 남과 어울리지 않 는 항 [독 소는 (200 µ g에 ( 재료의 표참조) 3 상용 준비에 특정 항 체 isotypes (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2, 그리고 IgM)의 레벨을 보여줍니다. /mL), 독 소 B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL), 독 소 B (CCUG 20309; 90 µ g/mL), 표면 층 단백질 (SLPs) 001, 002, 027 (모든 200 µ g/mL)] 단백질 microarray 기술을 사용 하 여. 열 지도의 색상 코드는 다음과 같습니다: 빨간색 (높은) 신호 강도 (낮은) 녹색. 열 지도 대 한 색 눈금에 표시 신호 값은 임의의 형광 단위 (AFU)에서 log2 변형입니다. 제발 참고 표준화 기술자는 AFU는 대체 최근에2신호. 총 IgG, IgG1, IgG2 isotypes 준 독 A, B, 이진 독 (pCDTb), 독 소에 대 한 높은 바인딩 reactivities 및 독 소 B (CCUG 20309). B. 이러한 플롯 표시에 대 한 네이티브 C. 남과 어울리지 않 는 IVIg 중화 효능 전체 독 소 A와 B 그들은 A와 B. C. 남과 어울리지 않는 독 소에 대 한 상용 IVIg 제품의 보호 무력화 효과의 백분율에 게 각 플롯 triplicate 실험 1: 100 희석에의 중간을 나타냅니다. IVIg 준비 1 전시 IVIg 준비 2, 3, 특히 독 대답에 대 한에 비해 낮은 보호 효과 * * * P ≤0.0001; P 0.05 (단방향 분산 분석) 이 그림 Negm 외 에서 수정 되었습니다. 3 허가입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 면역 반응 및 환자의 세라 C. 남과 어울리지 않는 항 원에의 효과 중화. A. 이 그림에서는 C. 남과 어울리지 않 는 단백질에 대 한 항 체 reactivities의 비교 환자 들 세라 IVIg 주입 전후. 열 지도에서는 7 명의 환자에서 혈 청 샘플의 isotypes (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2, 그리고 IgM) 식 수준 7 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 대 한 IVIg 주입 전후 [한 (200 µ g/mL)의 독 소, 독 소 B (100 µ g / mL), pCDTb (200 µ g/mL), 독 소 B (CCUG 20309; 90 µ g/mL), 및 Slp 001, 002, 027 (모든 200 µ g/mL)] 단백질 microarray 기술을 사용 하 여. 열 지도의 색상 코드는 다음과 같습니다: 빨간색 (높은) 신호 강도 (낮은) 녹색. 열 지도 대 한 색 눈금에 표시 하는 신호 값은 log2는 AFU에서 변형. 표준화 된 신호2는 AFU는 대체 최근에 note 하시기 바랍니다. 독 소 A, B, 독 소 및 pCDTb 총 IgG, IgG1, IgG2, 및 IgG3 reactivities의 포스트 주입 향상이 있었습니다. B.이 화면은 IgG 응답 독 소 A, B, 독 소 및 이진 독 소 (pCDTb), 사전 및 게시물 IVIg 관리. 모든 독 소에 대 한 총 IgG 레벨 표시 (Wilcoxon 서명 순위 테스트를 사용 하 여) IVIg 관리에 따라 크게 증가. 각 플롯 나타냅니다 triplicate 실험의 중간 1시 10분 희석. C. 이러한 플롯에 대 한 네이티브 C. 남과 어울리지 않 는 중화 효과 보여 독 소 A와 B IVIg 관리 다음. 사전 및 포스트 주입 중화 항 체 활동의 비교 IVIg 혼합 네이티브에 대 한 후 향상 된 보호 효과 보여주는 A와 B. C. 남과 어울리지 않는 독 소 각 플롯 나타냅니다 triplicate 실험의 중간 1시 10분 희석. 독 소 A와 B에 대 한 보호 효과가 크게 증가 (Wilcoxon 서명 순위 테스트를 사용 하 여) 환자 세라 테스트 게시물 IVIg 주입 지적 했다. 이 그림 Negm 외에서 재 인 쇄 되었습니다. 3 허가입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
재현성 | 독 소 A | 독 소 B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | 독 소 B CCUG 20309 | pCDTb |
내부 분석 결과 | 7.70% | 6.40% | 7.40% | 5.10% | 7.60% | 7% | 3.70% |
간 분석 결과 | 9.10% | 9.10% | 7.40% | 11.20% | 12.8 | 9.70% | 12.50% |
표 1: Microarray 내부 분석 결과 및 간 분석 결과 정밀 1. Microarray 내부 및 남북 assay variabilities 7 환자의 혈 청을 사용 하 여 계산 했다. 동일한 샘플은 각각 두 개의 독립적인 시간 지점에서 두 슬라이드에 분석 했다. 모든 항 원 (n = 7 테스트 및 n = 2 컨트롤) 각 배열에 5 복제에서 목격 됐다.
순화 된 단백질 농도 | 혈 청 희석 | 이차 항 체 희석 | |
IgG | 50 μ g/ml | 1/500 | 1/20000 |
IgG1 | 200 μ g/ml | 1/100 | 1/5000 |
IgG2 | 200 μ g/ml | 1/100 | 1/10000 |
IgG3 | 200 μ g/ml | 1/100 | 1/5000 |
IgG4 | 200 μ g/ml | 1/100 | 1/5000 |
IgA | 50 μ g/ml | 1/100 | 1/5000 |
IgA1 | 200 μ g/ml | 1/100 | 1/10000 |
IgA2 | 200 μ g/ml | 1/100 | 1/5000 |
IgM | 50 μ g/ml | 1/500 | 1/20000 |
표 2: 이 연구에 사용 된 면역 글로불린의 목록. Igs는 관련 정제 단백질 농도 (µ g/mL)와 희석 혈 청 및 이차 항 체에 대 한 표시 됩니다.
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Discussion
이 프로토콜에서 우리는 microarray C. 남과 어울리지 않 는 단백질 항 원 환자 세라 (그림 3 과 6)와 IVIg (그림 5)의 상업적인 준비에 체액 성 면역 응답을 정의 하기 위한 적합 한 플랫폼입니다 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 microarray 기술은 기존의 ELISA (그림 2)에 비교 될 때 잘 수행 하 고 내부 및 남북 assay variabilities 정밀 ( 의 허용 한계 내로 우수한 재현성을 보여줍니다 증명 하고있다 표 1).
중요 한 단계:
어떤 성공적인 항 원 microarray 플랫폼을 구축할 때 중요 한 단계 수를 다음 합니다. 처음에, 그것은 매우 품질 실험을 실행 하는 것이 중요입니다. 품질 관리 실험에서 서로 다른 매개 변수 평가 되어야 한다, 적절 한 표면 화학, 인쇄 버퍼, 블로킹 버퍼, 혈 청 샘플 및 이차 항 체의 희석의 선택과 같은. 이 실험은 잘 검증 되 고 신뢰할 수 있는 기술38,39제공의 목적으로 수행 되어야 합니다.
적당 한 단백질의 동원 정지 과정의 선택이이 연구에서 보듯이 테스트 aminosilane 슬라이드의 고품질 성능을 보장 하는 microarray 분석에서 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 정기적이 고 원형 자리 형태학, 높고 특정 신호 강도, 그리고 분명 배경 관찰 하는 것이 결정적 이다. Microarray 성능에 영향을 미치는 또 다른 요소는 균일 하 고 일반 명소 슬라이드에 생산 원하는 표면 화학을 달성 하는 것도 중요 인쇄 버퍼.
그것은 이렇게 하면 최적의 크기와 인쇄 하는 자리를의 모양으로 인쇄에 대 한 올바른 설정을 선택 해야 합니다. 예를 들어 습도 수준 유지 되어야 한다 약 55%, 인쇄 중 습도 없이 microarray 챔버에 증발의 비율은 증가 되 고 적은 명소 인쇄 됩니다 때문에.
비 특정 단백질 바인딩은 추가 요소에 영향을 미치는 배경 및 현장 신호; 따라서, 블로킹 버퍼의 적절 한 선택 어떤 비 특정 바인딩, 향상 된 감도 및39의 배열 데이터 정확성을 줄일 수 있습니다.
수정 및 문제 해결:
항 원 및 혈 청 샘플 해야 aliquoted 냉장고에 작은 스토리지 튜브에 저장 방지 하는 데 도움이 사용까지 배열의 신호 강도 저하 수 있습니다 여러 동결-해 동 주기를 반복. 성공적인 실험의 기회를 향상 시키기 위해, 모든 시 약 신선한 준비 되어야 하 고 필터링 할. 인쇄 하 고 설정이 필요 확인 하기 전에 arrayer를 청소. 또한, 슬라이드 홀더 배경 잡음을 최소화 하기 위해 청결 한 유지 되어야 한다.
제한 사항:
단백질 microarrays의 응용 프로그램은 현재 단백질 microarray 제작에 표면 화학에 대 한 엄격한 수요에 의해 방해 된다. 여기 단백질 분자의 화학 및 물리적 특성에 있는 중대 한 변이 단백질 및 항 체 분자40의 다른 클래스에 대 한 사용자 지정 디자인 독특한 표면 화학을 필요로합니다. 다른 기술 과제 같은 기술의 광범위 한 구현 등 고가의 특수 장비 및 유지 보수 비용, 복잡 한 데이터 분석, 상대 배려 뿐 아니라 할당 된 벤치-공간, 소프트웨어에 대 한 필요 단백질 정량화, 그리고 비판적으로 순화 된 항 원에 대 한 액세스.
기존/대체 방법에 관하여 방법의 중요성:
Microarray 기술 ELISA, Meso 스케일 검색, 또는 Luminex immunoassays 원리에서 유사 하지만 사용자 정의할 수, 통계적 인 힘을 달성 하기 위해 확장할 수 있습니다, 유일한 microliter 귀중 한 샘플의 수량에 의존 있으며 화면 세라 수 여러 단백질 reactivities에 대 한. 그것은 따라서 대규모, 역사적 혈 청 은행 및 바이오 마커 발견과 심사에 특히 적합 합니다.
미래의 응용 프로그램 또는 방법의 방향:
향후 다른 샘플 (셀 supernatants)에 대 한 분석 결과 사용 하 여 분석 결과 전조 도구로 환자 계층에 대 한 이중 패션에 큰 무리를 사용 하 여 외부 유효성 검사 잠재적인 생체 최적화 쪽으로 이동 하 고 예측 하 고 최적화 immunotherapy (mAb, 백신)에 대 한 응답. 미래에, microarray 기술 병원 설정 유용한 진단 도구 또는 시간의 기간 동안 약물 치료 계획을 모니터링 하는 데에 사용 될 수 있습니다.
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Disclosures
없음입니다.
Acknowledgments
이 연구는 헤르메스 친목 올라요 Negm 타 냐 모나 고 노팅엄 소화 질환 센터와 NIHR 노팅엄 소화 질병 생물 의학 연구 센터에서 별도 자금을 통해 지원 했다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
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