Summary
Este artículo describe un método de microarrays de la proteína simple para perfiles de respuesta inmune humoral a un panel de 7-plex de altamente purificaron antígenos de Clostridium difficile en suero humano. El protocolo puede ampliarse para la determinación de las respuestas de anticuerpos específicos en los preparados de inmunoglobulina intravenosa policlonal.
Abstract
Le ofrecemos una descripción detallada de un análisis de microarray de la novela de alto rendimiento de proteína para la determinación de anti -Clostridium difficile los niveles de anticuerpos en suero humano y en preparaciones separadas de inmunoglobulina policlonal intravenosa (IgIV). El protocolo describe los pasos metodológicos involucrados en la preparación de muestras, impresión de matrices, procedimiento de ensayo y análisis de datos. Además, este protocolo podría ser desarrollado para incorporar diversas muestras clínicas incluyendo plasma y sobrenadantes de cultivo de células. Mostramos cómo microarrays de la proteína se pueden utilizar para determinar una combinación de isotipo (IgG, IgA, IgM), subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), y anticuerpos específicos de cepa altamente purificaron toda C. difficile toxinas A y B (toxinotype 0, tensión VPI 10463, ribotipo 087), la toxina B de una C. difficile toxina B-sólo expresando su cepa (CCUG 20309), una forma precursora de un fragmento de B de la toxina binaria, pCDTb, proteínas específicas ribotype de toda la superficie de la capa (PHL, 001, 002, 027) y control de las proteínas (tétanos tetánico y Candida albicans). Durante el experimento, microarrays están sondeados con sueros de individuos con infección por C. difficile (CDI), las personas con fibrosis quística (FQ) sin diarrea, controles sanos (HC) y de individuos pre- y post-IgIV tratamiento para la tratamiento de la CDI, el trastorno de inmunodeficiencia combinada y Polirradiculopatía desmielinizante inflamatoria crónica. Encontramos diferencias significativas en eficacia de neutralización de la toxina y los niveles de anticuerpos específicos de isotipo multi entre los grupos de pacientes, preparados comerciales de IVIg y sera antes y después administración de IVIg. También, hay una correlación significativa entre el microarray y análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) para los niveles de antitoxina IgG en muestras de suero. Estos resultados sugieren eso microarray podría convertirse en una herramienta prometedora para perfilar las respuestas del anticuerpo a los antígenos de C.difficile en seres humanos infectados o vacunados. Con el mayor refinamiento de los paneles de antígeno y una reducción en los costos de producción, esperamos que la tecnología de microarrays puede ayudar a optimizar y seleccionar las inmunoterapias más clínicamente útiles para la infección de C. difficile en un modo específico para cada paciente.
Introduction
Este protocolo describe el desarrollo y validación de un ensayo de microarray de proteínas novedosas y personalizadas para la detección y semi-cuantificación de cepa bacteriana y las respuestas de anticuerpos isotipo-específicos a los antígenos de C. difficile . Utilizamos con éxito nuestro C. difficile-análisis de microarrays específicas como una nueva herramienta prometedora para el Bioanálisis composición de contenido de anticuerpos específicos en el suero del paciente1,2, preparaciones de IVIg3, y identificación de especificidades de anticuerpos que se correlacionan con resultados deficientes en el CDI4. Demostramos cómo biobanked sueros y preparados comerciales de IVIg pueden ser analizadas en microarray diapositivas, permitiendo alta calidad reproducible de perfiles de las respuestas de anticuerpos patógenos específicos de C. difficile en este ensayo.
Muchos niños y adultos sanos tienen anticuerpos IgG e IgA sérica detectable las toxinas de C. difficile A y B5,6. Éstos se piensan para presentarse después de la exposición transitoria durante la infancia y después de la exposición a C. difficile en la edad adulta. Por esta razón, inmunoglobulina policlonal intravenosa ha sido utilizado apagado-etiquete para tratar recurrentes y fulminante CDI7,8,9. Sin embargo, su papel definitivo y modo de acción está claro. Varios estudios han demostrado que la respuesta inmunitaria humoral a las toxinas de C. difficile desempeña un papel en la presentación de la enfermedad y el resultado. En concreto, pacientes asintomáticos muestran una mayor concentración del suero antitoxina A IgG en comparación con los pacientes que desarrollan enfermedad sintomática10. Una asociación demostrable se ha divulgado para mediana antitoxina IgG A títulos y todas las causas mortalidad a 30 días11. Varios informes también han revelado una asociación con una protección contra respuestas recurrencia y anticuerpos a la toxina A, B y varios antígenos no toxina (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD y proteínas de la capa superficial (SLPs))12,13 , 14 , 15. estas observaciones han estimulado el desarrollo de la primera inmunoterapia pasiva de drogas dirigida a C. difficile toxina B (bezlotuxumab), que recientemente ha sido aprobado por el alimento y administración de drogas y los medicamentos europeos Agencia para la prevención de la recurrente de la CDI16. Estrategias de vacunación con toxinas inactivadas o fragmentos de toxina recombinante también están actualmente bajo desarrollo17,18,19. Estos nuevos enfoques terapéuticos sin duda estimulará el requisito para la evaluación de la respuesta inmune humoral a múltiples antígenos en tamaños de muestra grandes.
Hoy en día, hay una notable falta de ensayos de alto rendimiento disponibles en el mercado capaz de evaluar simultáneamente la cepa bacteriana y las respuestas de anticuerpos isotipo-específicos a los antígenos de C. difficile . Hay una necesidad para el desarrollo de estos ensayos para facilitar esfuerzos de futuras investigaciones y aplicaciones clínicas. Microarrays de la proteína son un método para inmovilizar grandes cantidades de proteínas purificadas individualmente como una matriz espacial organizada de puntos sobre una superficie microscópica basada en diapositivas utilizando un sistema robótico, que puede ser un20 de contacto o sin contacto herramienta21de la impresión. Los puntos pueden representar mezclas complejas como los lysates de la célula, los anticuerpos, homogenados de tejido, proteínas endógenas o recombinantes o péptidos, fluidos corporales o drogas22,23.
Tecnología de microarrays de proteínas ofrece distintas ventajas sobre ELISA interna estándar técnicas, que tradicionalmente se han utilizado para evaluar las respuestas de anticuerpos de anti -C. difficile . Estos incluyen un aumento de la capacidad para detectar una gama de los multi-isotipo-específicos anticuerpos contra un panel más amplio de objetivos de la proteína, volumen reducido requisitos para antígenos, las muestras y reactivos y una mayor capacidad para incorporar una mayor número de repeticiones técnicas, además de múltiples control interno de calidad (QC) mide1. Microarrays son por lo tanto más sensibles, precisos y reproducibles y tener un mayor rango dinámico. Estos factores hacen microarrays una alternativa más barata y potencialmente favorable a ELISA para la detección a gran escala de las proteínas conocidas. Sin embargo, desventajas de la tecnología de microarrays resultan principalmente de los grandes costos iniciales asociados con establecer un panel de antígenos altamente purificados y configuración de la plataforma tecnológica.
Microarrays de la proteína se han utilizado en las últimas dos décadas como una herramienta de diagnóstico investigación básica en aplicaciones clínicas. Aplicaciones específicas incluyen la expresión de la proteína de perfiles, el estudio de las relaciones enzima-sustrato, investigación de biomarcadores, análisis de las interacciones huésped-microbio y perfiles de anticuerpos de especificidad de23,24, 2526,de,27,28. Se han establecido muchos nuevos microarrays de proteínas antígeno patógeno, incluyendo la malaria (Plasmodium)29,30de VIH-1, influenza31, síndrome respiratorio agudo severo (SARS)32, fiebre hemorrágica viral33 , herpesviruses34y35de la tuberculosis.
El presente Protocolo se relaciona con el establecimiento de un fácil funcionamiento C. difficile reactivo antígeno microarray ensayo, que permite la cuantificación exacta, precisa y específica de multi-isotipo y las respuestas de anticuerpos específicos de cepa a C. difficile antígenos en suero e inmunoglobulina intravenosa policlonal. En este documento, se incluyen resultados representativos pertenecientes a un funcionamiento de ensayo de microarray aceptable comparado con ELISA, así como análisis de precisión y reproducibilidad perfiles. Este análisis podrían desarrollarse aún más para otras muestras clínicas de perfil y establece un nuevo estándar para la investigación en bases moleculares de la CDI.
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Protocol
1. preparar una placa de microchips
- Diluir los antígenos de C. difficile con un tampón de impresión [PBS-Tween-trehalosa (50 mM)] a la concentración óptima (que estaba predefinida antes de ejecutar el suero del paciente): toxina (200 μg/mL) y la toxina B (100 μg/mL), pCDTb (200 μg/mL) y natural purificada SLP todo deriva de Benito 001, 002 y 027 (200 μg/mL).
Nota: La toxina B se obtuvo de una toxina B-expresión cepa CCUG 20309 (90 μg/mL).- Diluir los controles positivos, lisados de C. albicansy toxoide tetánico con el tampón de impresión a 100 μg/mL. Por último, diluir la inmunoglobulina humana purificada que empareja el isotipo de anticuerpo probado en serie, a partir de 50 μg/mL a través de 10 diluciones en el buffer de impresión para crear una curva de calibración.
- Transferir 10 μl de las diluciones en el búfer de impresión en una placa de 384 pozos.
- Cubra la placa con un sello de placa y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
2. impresión de matrices con un Robot contacto
- Calor el pin de silicio usando el quemador de gas de mano 3 x 2 s cada y enjuague en agua limpia 3 x 3 s cada uno.
- Coloque la placa de microarrays en el cartucho de carga de la arrayer.
- Coloque el aminosilane los portaobjetos en la bandeja portaobjetos.
Nota: La bandeja de diapositivas puede contener 27 diapositivas: tres hileras de nueve diapositivas. Las diapositivas están dispuestas en orientación vertical, a partir de la parte izquierda de la fila inferior y el resto de los espacios se cubren con diapositivas en blanco para asegurarse de que están cubiertos todos los agujeros en la bandeja portaobjetos.- Pulse Aceptar y compruebe que se ha encendido un vacío y todas las diapositivas seguras. Dejo las diapositivas en el ambiente húmedo durante al menos 1 h antes de comenzar la impresión.
Nota: Las diapositivas de aminosilane vienen en una bolsa sellada con desecante. Una vez abierto, cualquier diapositivas no utilizados deben devolverse inmediatamente en el desecador para almacenamiento hasta la fecha de caducidad.
- Pulse Aceptar y compruebe que se ha encendido un vacío y todas las diapositivas seguras. Dejo las diapositivas en el ambiente húmedo durante al menos 1 h antes de comenzar la impresión.
- Establecer el programa de impresión adecuado para imprimir antígenos de Clostridium difficile . Lanzamiento de la Suite de aplicaciones de TAS y abra el archivo de parámetros de funcionamiento impresión requiere desde el directorio 'Mi red funciona'. Seleccione el archivo de Clostridium difficile para la impresión de todos los antígenos de Clostridium difficile por cuadruplicado.
- Al hacer doble clic en el icono de MicroArray de la ventana principal aparecerá una ventana con tres pestañas llamado 'parámetros de MicroArraying'. Los tres son "Fuente", "Objetivo" y "Opciones". La ficha "Fuente" muestra detalles del número de muestras utilizado en la placa de microarrays. La pestaña "Destino" muestra detalles de cómo son las diapositivas que cargarse, cuando la matriz se deben imprimir en la diapositiva y editar el diseño de la diapositiva (16 formatos de submatriz). La pestaña de "Opciones" muestra detalles del Protocolo de lavado y de herramienta para ser usada por ejemplo. Lave después de cada muestra completa. Limpiar el pin de silicio entre muestras para evitar cualquier contaminación cruzada entre muestras.
- Las opciones de programación se encuentran en Opciones > Preferencias de ejecutar en la barra de herramientas de la Suite de aplicaciones de TAS. Hay 9 fichas para trabajar a través de esta sección y que completa una ficha pasar a la siguiente haciendo clic en él. Clic el el botón "OK" le llevará fuera de «Ejecutar preferencias.» En la pestaña "General" de las "preferencias de ejecución", hay un número de casillas de verificación disponibles bajo esta sección relativa a cómo se comportará el instrumento cuando se inicia un programa. Marque la casilla de "Baño de primer antes de comienzo de ejecución", todas las estaciones de lavado de tres serán sometido a una secuencia de oscurecimiento corto antes del comienzo de ejecución. Marque la casilla de "Lavar a Inicio de gestión", la herramienta pin va a lavarse antes de visita de la primera fuente. Casilla "Lavado final de carrera", la herramienta pin va a lavarse después de visitar la última fuente. El usuario puede establecer el número de ciclos de lavado. En la pestaña de "Clima" de las "preferencias de ejecución", comenzar la humidificación. La configuración que utilizamos son los siguientes: Inicio tasa de 55%, ejecutar tasa de 55%, mínima humedad 55%, objetivo humedad 60%. No arranque la carrera hasta que ha alcanzado la humedad del destino, de lo contrario los puntos será el tamaño incorrecto y la biblioteca se evaporará rápidamente.
- En la barra de menú de la TAS, haga clic en el botón ir. Iniciar el funcionamiento y observar periódicamente arrayer durante la tirada que seguro todo está bien.
Nota: Esto permite el análisis de 15 muestras en paralelo en cada diapositiva como una submatriz se utiliza como un control negativo. El diseño de submatrices se determina por el número de las impresas proteínas (antígenos) y el número de la biológica impreso Replica.
Nota: Después de imprimir cada muestra, la cabeza se mueve hacia los baños de lavado para permitir la inmersión múltiples del perno en dos baños de lavado con agua destilada y 0.002% Tween 20 para 1.5 s en cada baño, seguido por el pin con agua ultra pura de enjuagar y secar el pasador en la estación de lavado para 4 s.
3. almacenamiento de las matrices
- Mantenga las diapositivas impresas almacenadas durante la noche a temperatura ambiente en el desecador.
Nota: Las diapositivas impresas pueden almacenarse hasta por una semana.
4. matriz de sondeo
- Coloque cuidadosamente las diapositivas impresas en un soporte de diapositiva del formato de 16 cámaras múltiples bien.
Nota: Las cámaras, con una profundidad de aproximadamente 7.5 mm, ofrecen una superficie generosa relación para facilitar la mezcla y pasos de lavado. - Permitir que todos los reactivos a temperatura ambiente antes de usar. A menos que se especifique lo contrario, realizar los siguientes pasos a temperatura ambiente.
- Añada 100 μl del filtrado interpolación 5% albúmina de suero bovino (BSAT; uso un filtro de jeringa 0,2 μm) para cada bloque, cubrir las diapositivas e incubar con agitación durante 1 hora.
- Lavar los portaobjetos 5 x 1 min cada uno en 120 μl de tampón fosfato salina con Tween 20 (SAFT; 0,1% Tween) por pozo con agitación. No deje que los portaobjetos secar.
- Descongelar las muestras de suero en el hielo por 20 min y diluir cada muestra con un anticuerpo comercial diluyente con el fondo de reducción de componente (véase Tabla de materiales).
- Optimizar la dilución de las muestras de suero según la inmunoglobulina probada como se muestra en la tabla 2.
- Transferir 100 μl de las muestras de suero diluido a todos los bloques excepto uno, que se utilizará como control negativo; a este bloque, añada 100 μl de diluyente de anticuerpos solamente. Incube los portaobjetos con agitación suave durante 1 hora.
- Lavar los portaobjetos 5 x 3 minutos cada uno en 120 μl de SAFT (0,1% Tween) por pozo con agitación.
- Añada 100 μl de un anticuerpo de antihumano de cabra biotinilado diluido con diluyente de anticuerpos.
- Optimizar la dilución del anticuerpo secundario según la inmunoglobulina probado como se describe en la tabla 2. Cubrir las diapositivas e incubar con agitación suave durante 1 hora.
- Lave los portaobjetos 5 x 3 minutos cada uno en 120 μl de SAFT bien con agitación.
- Añada 100 μl de estreptavidina Cy5 a cada bloque diluido al 1: 2000 en 5% de BSA. Cubrir el portaobjetos con papel de aluminio para protegerlos de la luz mientras que la agitación por 15 min con agitación suave.
- Lave las diapositivas 5 x 1 min cada uno en 120 μl de SAFT por pozo con agitación, seguido de 2 lavados de 1 min en PBS con agitación.
- Girar los portaobjetos durante 5 min a 300 x g para secarlas.
- Mantenga los portaobjetos en una caja oscura para transporte y almacenamiento a temperatura ambiente.
- Proceder a escanear los arreglos inmediatamente para asegurar la consistencia de la señal después de sondeo.
Nota: Sin embargo, sondeados diapositivas pueden almacenarse en la oscuridad y analizados dentro de una semana de ataques potenciales.
5. Análisis de las matrices
- Encienda el escáner láser (véase Tabla de materiales) 30 min antes de la exploración para calentar el láser. Cargar el software del escáner y conectar el ordenador con el escáner.
- Colocar un portaobjetos con la cara impresa boca arriba en el escáner hasta que encienda la luz de juego verde.
- Presione el botón de configuración y ajuste la siguiente configuración al escanear las diapositivas siguientes: modo de escaneo, mediana; Adquisición, 635 Modo de adquisición, Manual; Ganancia, 20; Potencia, bajo; Tipo de diapositiva, diapositiva sin etiqueta; Foco, foco Auto. Desactivar desplazamiento automático y establezca Barcode Reading en Pixel tamaño 10 y 35 de la exploración.
- Guarde las imágenes resultantes como escala de grises de 16 bits múltiples formato de imagen TIFF. Presione el botón de la Red de importación y seleccione la lista correspondiente de la matriz.
Nota: La lista de la matriz describe el tamaño y la posición de submatrices y los nombres de las sustancias impresos relacionados con cada indicador de función.- Alinear la cuadrícula a los puntos de la diapositiva.
- Analizar las imágenes pulsando el botón proceso de cuantificación para medir las intensidades de la señal de fluorescencia de cada lugar y guardar los resultados en un formato de texto denominado GenePix resultados (GPR).
Nota: El archivo GPR contiene las variables de localización e identificación de los objetivos de antígeno en la matriz y también el fondo local que representa la Unión de anticuerpos y la intensidad de fluorescencia media señal los valores de cada punto.
6. Análisis de datos
- Calcular la mediana para las repeticiones de cada antígeno después de sustracción de fondo utilizando un software de análisis de microarrays libre llamado analizador de fase inversa proteína matriz (RPPA), un módulo en el lenguaje estadístico R en CRAN36.
- Trazar la curva de estándar e interpolar las señales de cada antígeno en relación con la curva estándar de inmunoglobulina utilizando software estadístico y graficación científica comercial (véase Tabla de materiales) para calcular los niveles de anticuerpos.
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Representative Results
La figura 1 muestra un diagrama de flujo que describe los principales pasos en el protocolo descrito. La figura 2 muestra pruebas de correlación de Spearman demostrar acuerdo entre microarray y ELISA para IgG e IgA los niveles A y B en los sueros de pacientes de prueba. La figura 3 muestra diferencial IgG e IgA anticuerpos clase las respuestas de anticuerpos específicos a la toxina A y toxina B toxina binaria (pCDTb) en pacientes con FQ sin diarrea, CDI pacientes con diarrea y en HC. La figura 4 muestra la antitoxina de C. difficile neutralizando las respuestas del anticuerpo en el suero del paciente. La figura 5 muestra la reactividad inmune (contra las toxinas de C. difficile y SLP) y el efecto neutralizante (contra las toxinas de C. difficile ) de IgIV. La figura 6 muestra la reactividad inmune (contra las toxinas de C. difficile y SLP) y el efecto neutralizante (contra las toxinas de C. difficile ) de los sueros de pacientes pre- y post IVIg administración. La tabla 1 muestra aceptables intra e inter ensayo los coeficientes de variabilidad de microarray utilizando sueros problema. La tabla 2 muestra una lista de las inmunoglobulinas utilizados en este estudio con las concentraciones de proteínas purificadas como diluciones optimizadas para sueros y los anticuerpos secundarios.
Figura 1 : Visión general de los principales pasos en el protocolo del microarray. El primer paso es la preparación de los antígenos y los controles. Las diluciones de muestra subsecuente se transfieren a una placa de 384 en la preparación para la impresión en quadruplicates en las diapositivas aminosilane. Después de secado y de bloqueo de diapositivas, los arreglos de discos se incuban con suero del paciente. Después de otro lavado, se agrega la inmunoglobulina humana de biotinilado (Ig) del isotipo especificado. Después del lavado final y pasos de secado, las diapositivas se escanean y las imágenes resultantes del procesan con un software de análisis de imagen de microarrays. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Correlación entre resultados de ELISA y microarrays. El coeficiente de correlación de Spearman se utilizó para evaluar el grado de acuerdo entre las dos plataformas. Al comparar el rendimiento de microarray con un análisis de la propia enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA), A. un buen coeficiente de correlación fue observado para la toxina A (r = 0.7051; P < 0.0001), B. y una moderadamente buena correlación para la toxina B (r = 0.5809; P < 0.0001). El protocolo completo de ELISA ha sido detallada en otra parte37. Esta figura ha sido reimpreso de Negm et al. 1 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: respuestas de anticuerpos específicos de isotipo para Clostridium difficile toxinas. Esta imagen siembra el suero antitoxina IgG e IgA respuestas (toxinotype 0, tensión VPI 10463, ribotipo 087; toxina A 200 μg/ml, la toxina B en 100 μg/mL), la toxina B (toxina deC. difficile productoras de B cepa CCUG 20309; toxina B a 90 μg/mL) y la forma de precursores de a B fragmento de la toxina binaria, pCDTb (200 μg/mL), en pacientes con fibrosis quística (FQ) sin diarrea, pacientes con infección por C. difficile (CDI) con diarrea y en controles sanos (HC). La dilución del suero de IgG e IgA son 1: 500 y 1: 100, respectivamente. Las diferencias entre los grupos se evaluaron con la prueba de Kruskal-Wallis seguida del test post-hoc de Dunn para múltiples respuestas. En comparación con el HC (n = 17) y los pacientes con CDI sintomática (n = 16), los pacientes adultos con FQ (n = 16) exhiben niveles significativamente más altos de suero IgA anti-toxina A y B; P ≤0. 05. El mismo patrón prevaleció para IgG, excepto en que no hubo diferencias en los niveles de anti-toxinas A IgG entre los grupos. Los diagramas de caja y bigote representan la mediana, rango y cuartiles. P ≤0.0001; P ≤0. 01; P ≤0. 05. Las señales estandarizadas se normalizan a la curva estándar de inmunoglobulina. Esta figura ha sido reimpreso de Monaghan et al. 2 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: efficacies de anticuerpo neutralizante para C. difficile las toxinas A y B en los sueros de los pacientes. Esta figura muestra los anticuerpos neutralizantes protectores (NAb) respuestas a C. difficile toxinas A y B [0, tensión VPI 10463, ribotipo 087, toxinotype en una 50% la dosis letal (DL50)] en el suero (dilución 1: 100; toxina A 2.5 ng/mL, la toxina B 0,5 ng/mL) de lo HC , los pacientes con FQ sin diarrea y los pacientes con CDI con diarrea. Los sueros de pacientes con FQ exhibieron significativamente más fuerte contra la toxina NAb respuestas protectoras en comparación con los sueros de la HC (toxinas A y B) y de los pacientes con CDI (toxina A). Las diferencias entre los grupos se evaluaron con la prueba de Kruskal-Wallis seguida del test post-hoc de Dunn para múltiples respuestas. Los diagramas de caja y bigote representan la mediana, rango y cuartiles. P ≤0. 01; P ≤0. 05. Esta figura ha sido reimpreso de Monaghan et al. 2 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Reactividad inmune y neutralizar el efecto de la IgIV a C.difficile antígenos. A. esta imagen muestra la reactividad del isotipo de múltiples anticuerpos a los antígenos de C. difficile en preparaciones comerciales de la inmunoglobulina intravenosa (IgIV). El mapa ilustra los niveles de isotipos de anticuerpos específicos (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 e IgM) en tres preparaciones comercialmente disponibles (véase Tabla de materiales) contra los antígenos de C. difficile siete [toxina (200 μg /mL), la toxina B (100 μg/mL), pCDTb (200 μg/mL) la toxina B (CCUG 20309; 90 μg/mL) y la superficie de las proteínas de la capa (SLPs) 001, 002 y 027 (los 200 μg/mL)] utilizando la tecnología de microarrays de proteínas. El código de color del mapa de calor es el siguiente: verde (bajo) a la intensidad de la señal roja (alto). Los valores de la señal representados en la escala de color para el mapa de calor son log2 transformado de las unidades de fluorescencia arbitraria (AFU). Por favor nota que la AFU, últimamente ha sido reemplazado por el descriptor estandarizado señales de2. Los isotipos de IgG, IgG1 e IgG2 total dieron el más alto reactividades de Unión contra la toxina, la toxina B, toxina binaria (pCDTb) y la toxina B (CCUG 20309). B. estas parcelas muestran toda la eficacia de la neutralización de inmunoglobulina intravenosa contra el nativo C. difficile toxinas A y B. Dan el porcentaje del efecto protector de la neutralización de productos comerciales de inmunoglobulina intravenosa contra C. difficile toxinas A y B. Cada diagrama representa la mediana de los experimentos por triplicado en dilución 1: 100. Preparación de la IgIV 1 exhibe el menor efecto protector frente a los preparados de IgIV 2 y 3, particularmente contra la toxina A. *** P ≤0.0001; P ≤0. 05 (análisis de varianza unidireccional). Esta figura ha sido modificada desde Negm et al. 3 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Reactividad inmune y neutralizar el efecto de los sueros del paciente a los antígenos de C. difficile . A. esta figura muestra una comparación de reactividades de anticuerpos contra las proteínas de C. difficile en sueros de pacientes antes y después de la infusión de IgIV. El mapa ilustra el nivel de expresión de los isotipos (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 e IgM) en sueros en siete pacientes antes y después de la infusión de IgIV contra siete antígenos de C. difficile [(200 μg/mL) la toxina, la toxina B (100 μg / mL), pCDTb (200 μg/mL) la toxina B (CCUG 20309; 90 μg/mL) y SLP 001, 002 y 027 (los 200 μg/mL)] utilizando la tecnología de microarrays de proteínas. El código de color del mapa de calor es el siguiente: verde (bajo) a la intensidad de la señal roja (alto). Los valores de la señal representados en la escala de color para el mapa de calor son log2-transformado de la AFU. Tenga en cuenta que la AFU, últimamente ha sido reemplazado por señales estandarizadas2. Hubo una mejora después de la infusión de las reactividades total de IgG, IgG1, IgG2 e IgG3 a la toxina A y toxina B pCDTb. B. esta imagen muestra las respuestas de IgG a toxina, toxina B y toxina binaria (pCDTb), pre- y post-IgIV administración. Los niveles de IgG total contra todas las toxinas muestran un aumento significativo después de la administración de IVIg (usando el Wilcoxon firmar-alinea la prueba). Cada diagrama representa la mediana de los experimentos por triplicado en el 1:10 dilución. C. Estos diagramas muestran el efecto de neutralización contra nativos C. difficile toxinas A y B tras la administración de IVIg. Una comparación de las actividades del anticuerpo neutralizante pre y post infusión muestra un mayor efecto protector después de las infusiones de inmunoglobulina intravenosa contra el nativo de C. difficile toxinas A y B. Cada diagrama representa la mediana de los experimentos por triplicado en el 1:10 dilución. Se observó un aumento significativo en el efecto protector contra las toxinas A y B en la infusión de suero del paciente prueba post IVIg (usando el Wilcoxon firmar-alinea la prueba). Esta figura ha sido reimpreso de Negm et al. 3 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reproducibilidad | Toxina A | Toxina B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | Toxina B CCUG 20309 | b pCDT |
| Inter-ensayo | 7.70% | 6.40% | 7,40% | 5.10% | 7.60% | 7% | 3.70% |
| Inter-ensayo | 9.10% | 9.10% | 7,40% | 11.20% | 12.8 | 9.70% | 12.50% |
Tabla 1: precisión intraensayo e Inter-ensayo de Microarray 1. microarrays variabilidades intra e inter - ensayo se calcularon usando los sueros de 7 pacientes. Se analizaron muestras idénticas en cada uno de los dos portaobjetos en dos momentos independientes. Todos los antígenos (n = 7 prueba y n = 2 controles) fueron vistos en repeticiones de cinco en cada arreglo de discos.
| Concentración de la proteína purificada | Dilución de suero | Dilución del anticuerpo secundario | |
| De igG | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
| IgG1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgG3 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG4 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA | 50 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgA2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgM | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
Tabla 2: lista de inmunoglobulinas utilizados en este estudio. El Igs se muestran con las concentraciones de las proteínas purificadas (μg/mL) y las diluciones de suero y anticuerpos secundarios.
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Discussion
En este protocolo, hemos demostrado que eso microarray es una plataforma adecuada para la definición de respuesta inmune humoral a antígenos de la proteína de C. difficile en el suero del paciente (figuras 3 y 6) y preparados comerciales de IgIV (figura 5). También hemos demostrado que la técnica de microarray realiza bien en comparación con ELISA convencional (figura 2) y muestra excelente reproducibilidad, intra e inter ensayo variabilidades caer dentro de límites aceptables de precisión ( Tabla 1).
Pasos críticos:
Debe seguirse una serie de pasos críticos al construir cualquier plataforma de microarrays de antígeno acertado. Inicialmente, es muy importante ejecutar experimentos de control de calidad. En los experimentos de control de calidad, deben ser evaluados diversos parámetros, tales como la selección de la química superficial adecuada impresión buffers, tampones de bloqueo, diluciones de las muestras de suero y los anticuerpos secundarios. Estos experimentos deben realizarse con el objetivo de ofrecer una técnica fiable y validado38,39.
La selección de un proceso de inmovilización de la proteína adecuada es uno de los pasos más importantes en el análisis de microarray, para asegurar un rendimiento de alta calidad de las diapositivas de prueba aminosilane, como se ve en este estudio. Es crucial observar morfología terreno regular y circular, intensidad de señal alta y específica y un fondo claro. Otro factor que afecte al rendimiento de microarrays es el búfer de impresión, que es igualmente importante lograr la química superficial deseada para producir puntos regulares y uniforme en la diapositiva.
Es importante seleccionar la configuración correcta para la impresión de que esto permitirá que el tamaño óptimo y la forma de un punto a ser impreso. Por ejemplo, el nivel de humedad debe mantenerse alrededor 55% durante la impresión, ya que sin humedad se aumenta la velocidad de evaporación en la cámara de microarrays y se imprimen puntos menos.
Unión a proteínas no específica es un factor adicional que afecta el fondo y las señales de punto; por lo tanto, la selección apropiada de una solución amortiguadora de bloqueo podría reducir cualquier atascamiento no específico, llevando a mejoras en la sensibilidad y la precisión de la matriz de datos39.
Modificaciones y resolución de problemas:
Antígenos y las muestras de suero deben ser alícuotas y almacenados en tubos de almacenamiento de información más pequeños en el congelador hasta su uso, que ayuda a evitar repetir varios ciclos de hielo-deshielo, que pueden deteriorar la fuerza de la señal de la matriz. Para mejorar las posibilidades de un experimento exitoso, todos los reactivos deben prepararse frescos y filtrados. Limpieza a la arrayer antes de la impresión y comprobación de que los ajustes son necesarios. Además, el soporte de diapositivas debe de mantenerse limpio para minimizar el ruido de fondo.
Limitaciones:
La aplicación de microarrays de proteínas actualmente está obstaculizada por la demanda estricta en la química superficial en la fabricación de microarrays de proteínas. Aquí la gran variación en las propiedades químicas y físicas de las moléculas de proteína requiere un diseño personalizado único química superficial para las diferentes clases de moléculas de proteínas y anticuerpos40. Otros desafíos técnicos que enfrenta la aplicación generalizada de esta tecnología incluyen la necesidad de costosos equipos especializados y software con espacio asignado, así como la consideración de gastos de mantenimiento, análisis de datos complejos, relativa cuantificación de la proteína y críticamente el acceso a antígenos purificados.
Importancia del método con respecto a los métodos existentes y alternativas:
Tecnología de microarrays es similar en principio a ELISA, descubrimiento de escala Meso o inmunoensayos de Luminex, pero es personalizable, puede ampliarse para lograr el poder estadístico, se basa en cantidades solo microlitro de muestras preciosas y tiene la capacidad sera de pantalla para múltiples reactividades de proteína. Por lo tanto es especialmente adecuado para bancos de suero a gran escala, histórica y descubrimiento de biomarker y proyección.
Futuras aplicaciones o indicaciones del método:
Esfuerzos en el futuro serán dirigidos hacia optimizar el análisis de otras muestras (sobrenadantes de células), usando el análisis como una herramienta de pronóstica para la estratificación de los pacientes, desde el exterior validación potenciales biomarcadores en cohortes grandes de una manera doble ciego, y predecir y optimizar la respuesta a la inmunoterapia (mAb, vacunas). En el futuro, la tecnología de microarray podría utilizarse en un entorno hospitalario como una herramienta diagnóstica útil para supervisar un plan de tratamiento durante un período de tiempo.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por una beca de Hermes a Ola Negm y Tanya Monaghan y a través de fondos separados del centro de enfermedades digestivas de Nottingham y el NIHR Nottingham digestivas enfermedades centro de investigación biomédica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
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