Summary
Denne artikkelen beskriver en enkel protein microarray metode for profilering humoral immunreaksjoner til et 7-plex panel av svært renset Clostridium difficile antigener i menneskelig sera. Protokollen kan utvides for fastsettelse av spesifikt antistoff svar i forberedelsene til polyklonale intravenøs immunglobulin.
Abstract
Vi gir en detaljert oversikt over en roman høy gjennomstrømming protein microarray analysen for fastsettelse av anti -Clostridium difficile antistoff nivåer i menneskelig sera og i separate forberedelser av polyklonale intravenøs immunglobulin (IVIg). Protokollen beskriver metodologiske trinnene involvert i prøven forberedelse, utskrift av matriser, analysen prosedyre og dataanalyse. I tillegg kan denne protokollen bli ytterligere utviklet å innlemme forskjellige kliniske prøver inkludert plasma og celle kultur supernatants. Vi viser hvordan protein microarray kan brukes til å angi en kombinasjon av isotype (IgG, IgA, IgM), underklasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) og stammen spesifikke antistoffer mot svært renset hele C. difficile giftstoffer A og B (toxinotype 0, belastning VPI 10463, ribotype 087), gift B fra en C. difficile gift-B-bare uttrykke belastning (CCUG 20309), en forløper form for et B-fragment av binære gift, pCDTb, ribotype-spesifikke hele overflatelaget proteiner (SLPs; 001, 002, 027), og kontrollere proteiner (stivkrampe toxoid og Candida albicans). Under eksperimentet microarrays er analysert med sera fra personer med C. difficile infeksjon (CDI), personer med cystisk fibrose (CF) uten diaré, sunn kontroller (HC), og enkeltpersoner pre og post-IVIg terapi for den behandling av CDI kombinert immunsvikt lidelse og kronisk inflammatorisk demyeliniserende polyradiculopathy. Vi møter betydelige forskjeller i gift nøytralisering efficacies og multi-isotype spesifikt antistoff nivåer mellom pasient grupper, kommersielle preparater av IVIg, og sera før og etter IVIg administrasjon. Også er det en signifikant sammenheng mellom microarray og enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) for Motgiften IgG nivåer i serumprøver. Disse resultatene tyder på at microarray kan bli et lovende verktøy for profilering antistoff Svar å C.difficile antigener i vaccinated eller infiserte mennesker. Med ytterligere raffinement av antigen paneler og en reduksjon i produksjonskostnadene forventer vi at microarray teknologi kan hjelpe optimalisere og velg de mest klinisk nyttig immunotherapies for C. difficile infeksjon i en pasient-spesifikk måte.
Introduction
Denne protokollen beskriver utvikling og validering av en roman og tilpassede protein microarray analysen for påvisning og semi kvantifisering av bakteriell belastning og isotype-spesifikke antistoffer Svar å C. difficile antigener. Vi kunne bruke våre C. difficile-spesifikke microarray analysen som et lovende nytt verktøy for den kompositoriske bioanalysis spesifikt antistoff innhold i pasienten sera1,2, forberedelser av IVIg3, og Identifikasjon av antistoff særegenheter som samsvarer med dårlige resultater i CDI4. Vi viser hvordan biobanked serumprøver og kommersielle preparater av IVIg kan analyseres på microarray lysbilder, slik at høy kvalitet reproduserbar profilering av C. difficile patogen-spesifikke antistoffer svar i denne analysen.
Mange friske barn og voksne har synlig serum IgG og IgA antistoffer mot C. difficile giftstoffer A og B5,6. Dette antas å oppstå etter forbigående eksponering under barndom og etter eksponering for C. difficile i voksen alder. Derfor polyklonale IVIg har vært brukt av etiketter til å behandle både tilbakevendende og fulminant CDI7,8,9. Sin definitive rolle og virkemåte er imidlertid uklart. Flere studier har vist at humoral immunrespons for C. difficile giftstoffer spiller en rolle i sykdom presentasjon og utfallet. Spesielt viser asymptomatisk pasienter en økt serum anti-gift A IgG konsentrasjon sammenlignet med pasienter som utvikler symptomatisk sykdom10. En påviselig forening er rapportert for median anti-gift A IgG titers og 30-dagers helt forårsake dødelighet11. Flere rapporter har også avdekket en tilknytning til beskyttelse mot regelmessighet og antistoff Svar å toksin A, B og flere ikke-toksin antigener (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD og overflatelag proteiner (SLPs))12,13 , 14 , 15. disse observasjonene har påvirket utviklingen av første passiv immunterapi narkotika målretting C. difficile giften B (bezlotuxumab), som er nylig godkjent av US Food, Drug Administration og europeiske legemidler Kontoret for forebygging av tilbakevendende CDI16. Vaksinasjon strategies bruke deaktivert giftstoffer eller rekombinante gift fragmenter er også under utvikling17,18,19. Disse nye terapeutiske metoder vil utvilsomt stimulere behovet for evaluering av humoral immunreaksjoner mot flere antigener i store utvalgene.
I dag, er det en betydelig mangel av kommersielt tilgjengelig høy gjennomstrømming analyser kan samtidig vurdere bakterielle belastningen og isotype-spesifikke antistoffer Svar å C. difficile antigener. Det er et udekket behov for å utvikle slike analyser for å lette fremtidig forskningsinnsats og kliniske applikasjoner. Protein microarrays er en metode for å nakkens stort antall individuelt renset proteiner som en romlig organisert rekke flekker på en mikroskopisk lysbilde-baserte overflate ved hjelp av en robot-system, som kan være enten en kontakt20 eller en ikke-kontakt utskrift verktøyet21. Flekker kan representere komplekse blandinger som celle lysates, antistoffer, vev homogenates, endogen eller rekombinante proteiner eller peptider, kroppsvæsker eller narkotika22,23.
Protein microarray teknologi gir forskjellige fordeler over standard in-house ELISA teknikker, som har tradisjonelt blitt brukt til å vurdere anti -C. difficile antistoff svar. Disse inkluderer en økt kapasitet for å oppdage en rekke multi-isotype-spesifikke antistoffer mot et mer omfattende panel av protein mål, redusert volumkrav til antigener, eksempler og reagenser, og en forbedret evne til å inkludere en større antall tekniske gjentak, i tillegg til flere interne kvalitetskontroll (QC) måler1. Microarrays har derfor mer følsomme og nøyaktige reproduserbare og et større dynamisk område. Disse faktorene gjør microarrays en billigere og potensielt gunstig alternativ til ELISAs for store påvisning av kjente proteiner. Men ulempene microarray teknologi føre hovedsakelig fra store forhånd kostnadene forbundet med å etablere et panel av høyrenset antigener og sette opp den teknologisk plattformen.
Protein microarrays har blitt brukt de siste to tiårene som en diagnostisk og grunnleggende forskningsverktøy i kliniske applikasjoner. Bestemte programmer inkluderer protein uttrykk profilering, studiet av enzym-underlaget relasjoner, biomarkør screening, analyse av vert-mikrobe interaksjoner, og profilering antistoff spesifisitet23,24, 25,26,27,28. Mange nye patogen protein/antigen microarrays er etablert, inkludert malaria (Plasmodium)29, HIV-130, influensa31, alvorlig akutt åndedretts syndrom (SARS)32, viral hemoragisk feber33 , herpesviruses34og tuberkulose35.
Nåværende protokollen gjelder etableringen av en enkel drift C. difficile reaktive antigen microarray analysen, som muliggjør nøyaktig, presis og spesifikk kvantifisering av multi-isotype og stammen spesifikke antistoffer svar på C. difficile antigener i sera og polyklonale IVIg. Her, inkludere vi representant resultatene gjelder en akseptabel microarray analysen ytelse i forhold til ELISA samt analysen presisjon og reproduserbarhet profiler. Denne analysen kan utvikles profilen andre kliniske prøver og setter en ny standard for forskning i molekylær grunnlaget for CDI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjør en Microarray Plate
- Fortynne C. difficile antigener med en utskrift buffer [PBS-Tween-trehalose (50 mM)] på optimal konsentrasjon (som var forhåndsdefinerte før pasienten sera): gift en (200 µg/mL) og gift B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), og renset innfødt hele SLPs avledet fra ribotypes 001 og 002 027 (200 µg/mL).
Merk: Gift B er Hentet fra en gift B-uttrykke belastning CCUG 20309 (90 µg/mL).- Fortynne positiv kontrollene, lysates C. albicansog stivkrampe toxoid med utskrift bufferen på 100 µg/mL. Til slutt, fortynne den renset menneskelige immunglobulin matchende testet antistoff isotype serielt, starter på 50 µg/mL over 10 fortynninger i utskrift bufferen til å opprette en kalibreringskurven.
- Overfør 10 µL av fortynninger i utskrift bufferen til en 384-vel plate.
- Dekk platen med en plate sel og sentrifuge 300 x g for 5 min.
2. skrive ut matriser med en kontakt Robot
- Varme silisium pin bruker håndholdt gass-brenner 3 x 2 s hver og skyll i rent vann 3 x 3 s hver.
- Plass microarray platen i lasting patronen av arrayer.
- Plass aminosilane lysbilder på lysbildet skuffen.
Merk: Skuffen lysbildet kan holde 27 lysbilder: tre rader med ni lysbilder. Lysbildene ordnes i stående retning fra venstre side av nederste rad og resten av mellomrom er dekket med tomme lysbilder å sikre at alle hullene på lysbildet skuffen er dekket.- Trykk på OK , og kontroller at et vakuum er aktivert og alle lysbildene er sikre. La lysbildene i et fuktig miljø for minst 1 time før utskriften.
Merk: Aminosilane lysbildene er gitt i en forseglet pose med fuktighet. Når åpnet, skal ubrukte lysbilder returneres umiddelbart til desiccator for lagring til utløpsdatoen.
- Trykk på OK , og kontroller at et vakuum er aktivert og alle lysbildene er sikre. La lysbildene i et fuktig miljø for minst 1 time før utskriften.
- Definer passende utskrift programmet skrive ut Clostridium difficile antigener. Start forretningssystemet TAS og åpne filen må kjøre utskriftsparametere fra mappen 'Mine Gridding kjører'. Velg Clostridium difficile fil for utskrift av alle Clostridium difficile antigener i quadruplicate.
- Ved å dobbeltklikke på ikonet MicroArray hovedvinduet vises et tre-tabbed vindu kalt 'MicroArraying parametre'. I de tre kategoriene er "Kilden", "Mål" og "Alternativer". Kategorien "Source" viser detaljer antall prøver som brukes i microarray platen. I "Mål"-kategorien viser detaljer om hvordan lysbildene skal lastes, matrisen skal skrives på lysbildet og redigere lysbildeoppsettet (16 subarray formater). "Alternativer"-kategorien viser detaljer om vask protokollen og verktøyet skal brukes f.eks. vaskes etter hvert fullførte prøven. Rengjør silisium pin mellom prøver å unngå noen krysskontaminering mellom ulike eksempler.
- De programmering alternativene finnes under Alternativer > kjøre valg på verktøylinjen TAS Application Suite. Det er 9 tabs å arbeide gjennom i denne delen som du fullført ett faneblad flytte til neste ved å klikke den. Klikke på "OK" knappen tar deg ut av "Kjøre innstillinger." I kategorien "Generelt" i "Kjør preferences" finnes det en rekke avmerkingsbokser under denne delen for hvordan instrumentet vil oppføre seg når et program startes. Sjekk boksen "Prime bad før starten av løpe" alle tre vaskestasjoner vil gjennomgå en kort grunning sekvens før kjøre begynnelsen. Sjekk "Vaske starten av løpe" boksen pin verktøyet vil bli vasket før den første kilden besøker. Merk "Vaske på slutt av løpet", pin verktøyet vil bli vasket etter siste kilden. Brukeren kan angi antall vask sykluser. I kategorien "Klima" "Kjør innstillinger" starte luftfukting. Innstillingen vi bruker er som følger: begynnerlønn 55%, kjører rate 55%, minimum fuktighet 55%, målet fuktighet 60%. Ikke start Kjør til målet luftfuktigheten er nådd, ellers stedene vil være feil størrelse og biblioteket vil raskt fordampe.
- I menyen stang av TAS, klikk den grønne Start-knappen. Start Kjør, og jevnlig se arrayer under utskriften skal visse alt er OK.
Merk: Dette kan analyse av 15 prøver parallelt på hvert lysbilde som en subarray brukes som en negativ kontroll. Utformingen av subarrays bestemmes av antall utskrevne proteiner (antigener) og antall utskrevne biologisk replikerer.
Merk: Etter hver prøve, hodet beveger seg mot vasking bad å tillate flere dipping i pin i to vask Bad som inneholder destillert vann og 0,002% mellom 20 for 1.5 s i hver bath, fulgt av skylling pin med svært rent vann og tørking pinnen i viktigste vask stasjonen for 4 s.
3. lagring av arrayene
- Holde utskrevne lysbildene lagret over natten i romtemperatur i desiccator.
Merk: Utskrevne lysbildene kan lagres i opptil en uke.
4. matrise undersøkelser
- Forsiktig plassere utskrevne lysbildene i lysbildet innehaver av 16 flere godt kamre format.
Merk: Chambers, har en dybde på ca 7,5 mm, gir en sjenerøs overflate å volumkontrollen å lette miksing og vaske trinnene. - La reagenser til varm til romtemperatur før bruk. Hvis angitt, kan du utføre alle følgende trinn ved romtemperatur.
- Legg 100 µL av filtrerte 5% bovin serum albumin tween (BSAT, bruk et 0,2 µm sprøyte filter) for hver enkelt blokk, dekke lysbildene og ruge dem med skjelvende 1t.
- Vaske lysbildene 5 x 1 min hver i 120 µL av fosfat bufret saltvann med mellom 20 (PBST; 0,1% mellom) per godt med risting. Ikke la lysbildene tørke ut.
- Tine serumprøver på is 20 min og fortynne hvert utvalg med et kommersielt tilgjengelig antistoff fortynningsmiddel med bakgrunn reduserer komponent (se Tabell for materiale).
- Optimalisere fortynning av serumprøver ifølge testet immunglobulin som vist i tabell 2.
- Overføre 100 µL av utvannet serum prøvene til alle blokkene unntatt en, som vil bli brukt som en negativ kontroll; denne blokken, legge 100 µL antistoff fortynningsmiddel bare. Inkuber lysbildene med mild agitasjon 1t.
- Vaske lysbildene 5 x 3 minutter hver i 120 µL av PBST (0,1% mellom) per godt med risting.
- Legg 100 µL av et biotinylated geit anti-antistoff fortynnet med antistoff fortynner.
- Optimalisere fortynning av sekundær antistoffer ifølge testet immunglobulin som beskrevet i tabell 2. Dekker lysbildene og ruge dem med mild skjelvende 1t.
- Vask lysbildene 5 x 3 minutter hver i 120 µL av PBST per godt med risting.
- Legge til 100 µL av streptavidin Cy5 i hver blokk utvannet på 1:2000 i 5% BSA. Lokk glir med folie å beskytte dem mot lys mens risting i 15 min med mild agitasjon.
- Vask lysbildene 5 x 1 min hver i 120 µL av PBST per godt med risting, etterfulgt av 2 vasker 1 min hver i PBS bare med skjelvende.
- Spinne lysbilder for 5 min på 300 x g å tørke.
- Holde lysbildene i en mørk for transport og lagring ved romtemperatur.
- Fortsett å skanne arrayene umiddelbart for å sikre signal konsistens etter undersøkelser.
Merk: Men probed lysbilder kan lagres i mørket og skannet innen en uke fra undersøkelser.
5. skanning arrayene
- Slå på laser skanneren (se Tabell for materiale) 30 min før skanning å varme opp laser. Last opp skannerprogramvaren og koble datamaskinen til skanneren.
- Plasser et lysbilde med utskriftssiden ansiktet opp i skanneren til spille lyset slår lyser grønt.
- Trykk på Innstillinger og justere følgende innstillinger når du skanner lysbildene som følger: skannemodus, Median; Oppkjøpet, 635 Vinningen måte, manuell; Gevinst, 20; Strøm, lav; Skyv Type, umerkede lysbildet. Fokus, autofokus. Deaktivere automatisk rulling og stille Barcode Reading Pixel størrelse 10 og skanne 35.
- Lagre resulterende bildene som 16-biters gråtone flere bildeformatet TIFF. Trykk knappen Importer rutenett og Velg passende array listen.
Merk: Utvalg listen beskriver størrelsen og plasseringen av subarrays og navnene på de utskrevne stoffene forbundet med hver funksjon-indikator.- Justere rutenettet til flekker på lysbildet.
- Analysere bildene ved å trykke på kvantifisering prosessen for å måle fluorescens signal intensiteter av hver spot og lagre resultatene i et tekstformat som er kalt GenePix resultater (GRP).
Merk: GRP-fil inneholder lokalisering og identifikasjon variablene av antigen målene på matrisen og også median fluorescens intensiteten og lokale bakgrunnen som representerer antistoff bindingen signal verdiene for hver spot.
6. dataanalyse
- Beregne medianen for gjentak av hver antigen etter bakgrunn subtraksjon benytter en gratis microarray analyseprogramvare alarmert omvendt fase protein matrise (RPPA) analysator, en modul i R statistiske språket på CRAN36.
- Plot standardkurven og interpolere signaler om hver antigen i forhold til immunglobulin standardkurven bruke kommersielle vitenskapelige grafer og statistikk programvare (se Tabell of Materials) til å beregne antistoff nivåene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer et flytskjema som beskriver de viktigste trinnene i beskrevet protokollen. Figur 2 viser Spearman korrelasjon tester viser betydelig avtale mellom microarray og ELISA for IgG og IgA anti-gift A og B nivåer i pasienten test sera. Figur 3 viser differensial IgG og IgA antistoff-klassen spesifikt antistoff Svar å toksin A, gift B og binære gift (pCDTb) i pasienter med CF uten diaré, CDI pasienter med diaré og HC. Figur 4 viser C. difficile Motgiften nøytralisere antistoff svar i pasienten sera. Figur 5 viser immun reaktivitet (mot C. difficile giftstoffer og SLPs) og nøytraliserende virkning (mot C. difficile giftstoffer) av IVIg. Figur 6 viser immun reaktivitet (mot C. difficile giftstoffer og SLPs) og nøytraliserende virkning (mot C. difficile giftstoffer) av pasienten sera pre og post-IVIg administrasjon. Tabell 1 viser akseptabel intra - og inter - assay koeffisientene til variasjon av microarray bruker test sera. Tabell 2 viser en liste over immunglobuliner brukt i denne studien med relevante konsentrasjoner av renset proteiner som optimalisert fortynninger for sera og sekundære antistoffer.
Figur 1 : Generell oversikt over hovedtrinnene som er involvert i microarray protokollen. Det første trinnet er utarbeidelse av antigener og kontroller. De påfølgende eksempel fortynninger overføres til en 384-plate i beredskap for utskrift i quadruplicates på aminosilane lysbildene. Etter tørking og blokkering av lysbilder, arrayene er ruges med pasienten sera. Etter ytterligere vask, legges biotinylated anti-immunglobulin (Ig) av den angitte isotype. Etter siste vasking og tørking trinn, lysbildene er skannet og resulterende bildene behandles med et microarray analyseprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Sammenhengen mellom microarray og ELISA resultater. Korrelasjonskoeffisienten Spearman ble brukt til å vurdere avtale mellom de to plattformene. Når du sammenligner microarray ytelsen med internt koblede enzym-immunosorbent analysen (ELISA), A. en god korrelasjonskoeffisient ble observert i gift A (r = 0.7051; P < 0,0001), B. og en middels gode sammenheng for gift B (r = 0.5809; P < 0,0001). Full ELISA protokollen er detaljert andre steder37. Dette tallet har blitt reprinted fra Negm et al. 1 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Isotype-spesifikke antistoffer Svar å Clostridium difficile giftstoffer. Dette bildet sår serum anti-gift IgG og IgA svarene (toxinotype 0, belastning VPI 10463, ribotype 087, gift A på 200 µg/mL, gift B på 100 µg/mL), gift B (C. difficile gift B-produserende belastning CCUG 20309, gift B på 90 µg/mL) og forløper form av en B fragment av binære gift, pCDTb (200 µg/mL), hos pasienter med cystisk fibrose (CF) uten diaré, pasienter med C. difficile infeksjon (CDI) med diaré, og sunn kontroller (HC). Fortynning serum IgG og IgA er 1:500 og 1: 100, henholdsvis. Forskjellene mellom gruppene ble vurdert ved hjelp av Kruskal-Wallis testen, etterfulgt av Dunn's post hoc testen for flere svar. Sammenlignet med HC (n = 17) og pasienter med symptomatisk CDI (n = 16), voksen CF pasienter (n = 16) viste signifikant høyere nivåer av serum IgA anti-gift A og B nivåer; P ≤0.05. Det samme mønsteret seiret for IgG, bortsett fra at det var ingen forskjell i anti-gift A IgG nivåer mellom gruppene. Boksen og whisker tomter representerer medianen, utvalg og kvartiler. P ≤0.0001; P ≤0.01; P ≤0.05. Standardisert signalene blir normalisert til immunglobulin standardkurven. Dette tallet har blitt reprinted fra Monaghan et al. 2 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Neutralizing antistoff efficacies til C. difficile giftstoffer A og B i pasientenes sera. Denne illustrasjonen viser beskyttende nøytraliserende antistoffer (NAb) Svar å C. difficile giftstoffer A og B [toxinotype 0, belastning VPI 10463, ribotype 087, brukes på en 50% dødelig dose (LD50)] i sera (1: 100 fortynning, gift en 2.5 ng/mL, gift B 0,5 ng/mL) fra HC , pasienter med CF uten diaré, og pasienter med CDI med diaré. Sera fra CF pasienter utstilt betydelig sterkere beskyttende anti-gift NAb svar sammenlignet med sera fra HC (giftstoffer A og B) og pasienter med CDI (gift A). Forskjellene mellom gruppene ble vurdert ved hjelp av Kruskal-Wallis testen, etterfulgt av Dunn's post hoc testen for flere svar. Boksen og whisker tomter representerer medianen, utvalg og kvartiler. P ≤0.01; P ≤0.05. Dette tallet har blitt reprinted fra Monaghan et al. 2 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Immune reaktivitet og nøytralisere effekten av IVIg til C.difficile antigener. A. dette bildet viser reaktivitet av multi-isotype spesifikke antistoffer mot C. difficile antigener i kommersielle intravenøs immunglobulin (IVIg) preparater. Varmekartet viser nivåene av spesifikt antistoff isotypes (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 og IgM) i tre kommersielt tilgjengelig preparater (se Tabell for materiale) mot syv C. difficile antigener [gift en (200 µg /mL), gift B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), gift B (CCUG 20309, 90 µg/mL), og overflaten lag proteiner (SLPs) 001 og 002 027 (alle 200 µg/mL)] bruker protein microarray teknologi. Fargekode varme kartet er som følger: grønn (lav) til rød (høy) signal intensitet. Signalet verdier representert på fargeskala for varmekartet er log2-forvandlet fra vilkårlig fluorescens enhetene (AFU). Vennligst signaler Merk at AFU har nylig blitt erstattet av beskrivelsen standardisert2. Den totale IgG, IgG1 og IgG2 isotypes ga de høyeste bindende reactivities mot toksinet A, gift B, binære gift (pCDTb), og toksinet B (CCUG 20309). B. disse flatene Vis IVIg nøytralisering effekten mot den opprinnelige C. difficile hele giftstoffer A og B. De gir prosentandelen av beskyttende nøytralisering effekten av kommersielle IVIg produkter mot C. difficile giftstoffer A og B. Hver tomt representerer medianen til tre eksemplarer eksperimenter på 1: 100 fortynning. IVIg forberedelse 1 viser laveste beskyttende effekten sammenlignet med IVIg forberedelser 2 og 3, særlig mot toksinet A. *** P ≤0.0001; P ≤0.05 (enveis analyse av varians). Dette tallet har blitt endret fra Negm et al. 3 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Immune reaktivitet og nøytralisere effekten av pasientens sera å C. difficile antigener. A. denne illustrasjonen viser en sammenligning av antistoff reactivities mot C. difficile proteiner i pasientenes sera før og etter IVIg infusjon. Varmekartet viser hvilket uttrykk isotypes (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 og IgM) i serumprøver i sju pasienter før og etter IVIg infusjon mot syv C. difficile antigener [gift en (200 µg/mL), gift B (100 µg / mL), pCDTb (200 µg/mL), gift B (CCUG 20309, 90 µg/mL), og SLPs 001 og 002 027 (alle 200 µg/mL)] bruker protein microarray teknologi. Fargekode varme kartet er som følger: grønn (lav) til rød (høy) signal intensitet. Signalet verdier representert på fargeskala for varmekartet er log2-forvandlet fra AFU. Vær oppmerksom på at AFU har nylig blitt erstattet av standardiserte signaler2. Det var en post infusjon forbedring av de totale IgG, IgG1, IgG2 og IgG3 reactivities gift A, gift B og pCDTb. B. dette bildet viser IgG svar gift A, gift B og binære gift (pCDTb), pre og post-IVIg administrasjon. De totale IgG nivåene mot alle giftstoffer viser en betydelig økning etter IVIg administrasjonen (med Diversified signert-rank test). Hver tomt representerer medianen til tre eksemplarer eksperimenter på 1:10 fortynning. C. disse flatene Vis nøytralisering effekt mot innfødt C. difficile giftstoffer A og B etter IVIg administrasjon. En sammenligning av pre- og post infusjon nøytraliserende antistoff viser en forbedret beskyttende effekt etter IVIg infusjoner mot innfødte C. difficile giftstoffer A og B. Hver tomt representerer medianen til tre eksemplarer eksperimenter på 1:10 fortynning. En betydelig økning i beskyttende effekt mot giftstoffer A og B var kjent i pasienten sera testet innlegg-IVIg infusjon (med Diversified signert-rank test). Dette tallet har blitt reprinted fra Negm et al. 3 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reproduserbarhet | Gift A | Gift B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | Gift B CCUG 20309 | pCDTb |
| Intra-analysen | 7.70% | 6.40% | 7.40% | 5.10% | 7.60% | 7% | 3.70% |
| Inter analysen | 9.10% | 9.10% | 7.40% | 11,20% | 12,8 | 9.70% | 12,50% |
Tabell 1: Microarray intra-analysen og inter analysen presisjon 1. Microarray intra - og inter - assay variabilities ble beregnet ved hjelp av sera 7 pasienter. Identiske eksempler ble assayed på hver av to lysbilder på to uavhengige tidspunkt. Alle antigener (n = 7 test og n = 2 kontrollerer) ble oppdaget i av fem på hver matrise.
| Renset protein konsentrasjon | Serum fortynning | Sekundær antistoff fortynning | |
| IgG | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
| IgG1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgG3 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG4 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA | 50 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgA2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgM | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
Tabell 2: liste over immunglobuliner brukt i denne studien. Igs vises med relevante renset protein konsentrasjon (µg/mL) og fortynninger for serum og sekundære antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, har vi vist at microarray er en passende plattform for definere humoral immunreaksjoner til C. difficile protein antigener i pasienten sera (tall 3 og 6) og kommersielle forberedelser av IVIg (figur 5). Vi har også vist at microarray teknikk utfører også sammenlignet med konvensjonelle ELISA (figur 2) og viser utmerket reproduserbarhet, intra - og inter - assay variabilities innenfor akseptable grenser presisjon ( Tabell 1).
Avgjørende skritt:
En rekke viktige tiltak må følges når du bygger en vellykket antigen microarray plattform. I utgangspunktet er det svært viktig å kjøre QC eksperimenter. I QC eksperimentene, bør ulike parametere vurderes, som valg av riktige overflatekjemi, utskrift buffere, blokkerer buffere, fortynninger av serumprøver og sekundære antistoffer. Disse eksperimentene må utføres med sikte på å levere en godt validert og pålitelig teknikk38,39.
Valg av en egnet protein immobilisering prosess er en av de viktigste trinnene i microarray analyser, sikre en høy kvalitet ytelse testet aminosilane lysbildene, sett i denne studien. Det er avgjørende å observere regelmessig og sirkulære spot morfologi, høy og bestemt signal intensitet og en klar bakgrunn. En annen faktor som påvirker microarray ytelse er utskrift bufferen, som er like viktig å oppnå ønsket overflatekjemi å produsere uniform og vanlige flekker på lysbildet.
Det er viktig å velge riktige innstillinger for utskrift som dette vil tillate den optimale størrelsen og formen på et sted som skal skrives ut. For eksempel skal luftfuktigheten vedlikeholdes rundt 55% under utskrift, fordi uten fuktighet øker frekvensen av fordampning i microarray kammeret og færre flekker skrives.
Non-spesifikke protein binding er en tilleggsfaktor påvirker bakgrunn og spot signaler; Derfor kan riktig valg av en blokkerende buffer redusere en uspesifisert binding, fører til økt følsomhet og nøyaktigheten av matrise data39.
Endringer og feilsøking:
Antigener og serumprøver må være aliquoted og lagret i mindre lagringsplass rør i fryseren før bruk, som bidrar til å unngå gjentas flere fryse-Tin sykluser, som kan forverres signalstyrken for matrisen. For å forbedre sjansene for en vellykket eksperiment, alle reagenser må forberedes frisk og filtreres. Rengjøring av arrayer før utskrift og kontrollere innstillingene kreves. Videre holdes lysbildeholderen rene for å redusere bakgrunnsstøy.
Begrensninger:
Anvendelsen av protein microarrays er for tiden hindret av strenge behovet overflatekjemi i protein microarray fabrikasjon. Her nødvendiggjør den store variasjonen i de kjemiske og fysiske egenskapene av protein molekyler custom-designe unike overflatekjemi for forskjellige klasser av protein og antistoff molekyler40. Andre tekniske utfordringer utbredt gjennomføringen av slik teknologi inkluderer behovet for kostbare spesialisert utstyr og programvare med tilordnede benk, samt vurdering av vedlikehold avgifter, komplekse dataanalyse, relativ protein kvantifisering og kritisk tilgang til renset antigener.
Betydningen av metoden med hensyn til eksisterende/alternative metoder:
Microarray teknologi ligner i prinsippet til ELISA, Meso skala oppdagelsen eller Luminex immunanalyser, men kan tilpasses, kan skaleres for å oppnå statistiske makt, avhengig bare mikroliter mengder dyrebare prøver og evnen til å skjermen sera for flere protein reactivities. Det er derfor spesielt egnet for store, historiske serum banker og biomarkør oppdagelsen og screening.
Framtidige applikasjoner eller retninger av metoden:
Arbeidet vil være rettet mot å optimalisere analysen for andre prøver (celle supernatants), bruke analysen som prognostiske verktøy for pasienten lagdeling, eksternt validere potensielle biomarkers bruker store kohorter i en dobbel-blind mote, og forutsi og optimalisere svar immunterapi (mAb, vaksiner). I fremtiden, kan microarray teknologien brukes i et sykehus innstilling som et nyttig diagnostisk verktøy eller overvåke en narkotika behandlingsplan over en tidsperiode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av en Hermes Fellowship Ola Negm og Tanya Monaghan og gjennom egen finansiering fra Nottingham Digestive sykdommer sentrum og NIHR Nottingham Digestive sykdommer biomedisinsk forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
References
- Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
- Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
- Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
- Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31 (2017).
- Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
- Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
- Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
- Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
- Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
- Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
- Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
- Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
- Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
- Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
- Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
- Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
- Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21 (2013).
- Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
- Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
- Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
- Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
- Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).
- Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
- Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).
- Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).
- Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349 (2015).
- Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
- Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).
- Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
- Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
- Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).
