Identification des Sites de facteur de Transcription Olig2 génomique fixation aiguë purifiée cellules PDGFRα + par immunoprécipitation de la chromatine Low-cellule analyse de séquençage
Summary
Nous présentons ici un protocole qui vise à analyser la liaison pangénomique du facteur de transcription oligodendrocyte 2 (Olig2) dans cerveau parfaitement purifiée précurseur oligodendrocytes (OPCs) en effectuant l’immunoprécipitation de la chromatine basse-cellule (ChIP) , préparation de bibliothèque, séquençage haut-débit et des analyses de données bioinformatiques.
Abstract
Dans les cellules de mammifères, transcription génique est régie d’une manière spécifique de type cellulaire par les interactions des facteurs transcriptionnels avec l’ADN génomique. Sont considérés comme des facteurs de transcription spécifiques lignage jouent un rôle essentiel dans la spécification des cellules et la différenciation au cours du développement. Puce, couplé avec le séquençage haut-débit (ChIP-seq) est largement utilisé pour analyser le génome accepteurs de facteurs de transcription (ou son complexe associé) d’ADN génomique. Toutefois, un grand nombre de cellules est nécessaire pour une réaction de puce standard, ce qui rend difficile d’étudier le nombre limité de cellules isolées de primaire ou de populations cellulaires rares. Afin de comprendre le mécanisme de régulation de transcription de lignée spécifique oligodendrocyte facteur Olig2 chez la souris parfaitement purifiée OPCs, une méthode détaillée à l’aide de ChIP-seq pour identifier les sites de liaison pangénomique du Olig2 (ou Olig2 complexe) est montré. Tout d’abord, le protocole explique comment purifier l’alpha du récepteur de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα) positifs OPCs de cerveaux de souris. Ensuite, Olig2 anticorps médiée par puce et construction de la bibliothèque sont effectuées. La dernière partie décrit le logiciel bioinformatique et les méthodes utilisées pour l’analyse Olig2 ChIP-seq. En résumé, cet article présente une méthode pour analyser les liaisons pangénomique du facteur de transcription Olig2 cerveau parfaitement purifiée OPCs.
Introduction
Il est important d’étudier les protéines (ou complexe protéique) liaisons de l’ADN et les marques épigénétiques pour construire des réseaux de régulation transcriptionnelles impliqués dans divers processus biologiques. En particulier, les liaisons des facteurs de transcription de l’ADN génomique peuvent jouer un rôle important dans la régulation des gènes, la différenciation cellulaire et le développement des tissus. Un outil puissant pour l’étude de la régulation transcriptionnelle et mécanismes épigénétiques est immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). En raison des progrès rapides dans la prochaine génération de technologies de séquençage, puces couplé avec le séquençage haut-débit (ChIP-seq) est utilisé pour les analyses des liaisons protéine-ADN et les marques épigénétiques1. Toutefois, un protocole standard de ChIP-seq nécessite environ 20 millions de cellules par réaction, ce qui rend l’application de cette technique difficile lorsque le nombre de cellules est limité, tels que l’isolement de cellules primaires et populations cellulaires rares.
Oligodendrocytes lignée, y compris les cellules de précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) et des oligodendrocytes sont largement distribués dans tout le cerveau et sont essentiels pour le développement et le fonctionnement du cerveau. Comme un type de cellules précurseurs, OPCs sont capables d’auto-renouvellement et de différenciation. OPC non seulement service de progéniteurs d’oligodendrocytes, mais joue également un rôle important dans la propagation de la signalisation neuronale en communiquant avec d’autres types de cellules de cerveau2. Des études antérieures ont suggéré que le développement des oligodendrocytes est régulée par des facteurs de transcription spécifiques lignée telles que Olig2 et Sox103,4. Ces facteurs de transcription ont été trouvés pour lier aux régions promoteur ou exhausteur de certains gènes cruciaux pour influencer leur expression au cours de la spécification de l’oligodendrocyte et la différenciation. Toutefois, il est difficile d’identifier la liaison ADN des protéines (ou complexe protéique) présentant un intérêt en aiguë purifiées OPCs primaires avec un nombre très limité de cellules.
Ce protocole décrit comment examiner systématiquement l’immunoprécipitée ADN génomique par Olig2 en OPCs purifié de la souris à l’échelle du génome en utilisant la technique de ChIP-seq. OPCs de cerveaux de souris ont été intensément purifiées par immunopanning et utilisés dans une expérience de puce sans prolifération in vitro. Un nombre limité de l’OPCs peut être obtenu par immunopanning et est insuffisant pour des expériences de ChIP-seq standards. Dans les présentes, un protocole de ChIP-seq basse-cellule avec aussi peu que 20 mille cellules par réaction de la puce pour les facteurs de transcription est décrit. En bref, réticulé de cellules ont été lysées et sonication par un dispositif de sonication pour cisailler la chromatine. La chromatine cisaillée est incubée avec Olig2 anticorps, mais aussi des protéines A recouvert de perles pour précipiter l’ADN génomique anticorps lié Olig2. Après élution de billes de protéine A revêtu et réticulation inverse, précipitée par les anticorps Olig2 de l’ADN génomique a été purifiée par extraction au phénol-chloroforme. Le produit obtenu a été quantifié et T-tailing, apprêt recuit changement de modèle et de l’extension, l’ajout d’adaptateurs et amplification, sélection de la taille de bibliothèque et de purification les étapes pour la construction de bibliothèque de ChIP-seq.
Après le séquençage, la qualité des lectures brutes de l’échantillon préparé avec de l’anticorps de Olig2 transcription factor et l’échantillon de contrôle a été analysée. Paires de bases de faible qualité et adaptateur contenant lire des fragments ont été taillés. Ensuite, parés de lectures étaient alignés sur le génome de référence de souris. Les régions génomiques qui ont considérablement enrichies pour les lectures de puce, par rapport au témoin, ont été détectés comme des pics. Des pics importants, représentant de potentiels sites de fixation de facteurs de transcription, ont été filtrés et visualisés dans un navigateur de génome.
Notamment, la méthode décrite dans le présent protocole peut être largement utilisée pour ChIP-seq, d’autres facteurs de transcription avec n’importe quel type de cellule d’un nombre limité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Réseaux de règlement de gène mammifère sont très complexes. ChIP-seq est une méthode puissante pour étudier les interactions ADN-protéines de génome. Ce protocole comprend comment faire Olig2 ChIP-seq en utilisant un nombre faible de l’OPCs purifiées de cerveaux de souris (aussi bas que 20 mille cellules par réaction). La première étape clée pour que ce protocole est la purification de l’OPCs de cerveaux de souris par immunopanning avec anticorps PDGFRα. Pour la sélection positive de l’OPCs avec pla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, XD, DEDC et YY appuyés par les subventions accordées par les instituts nationaux de santé R01 NS088353 ; 01-NIH grant 1R21AR071583 ; la Fondation Hermann de Staman Ogilvie fonds-Memorial ; l’Initiative de cerveau de UTHealth et le CSTC UL1 TR000371 ; et une subvention de l’Université du Texas système Neuroscience et Institut de neurotechnologie (Grant #362469).
Materials
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
Riferimenti
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