זיהוי אתרים פקטור שעתוק Olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר PDGFRα + תאים על-ידי Immunoprecipitation נמוך-תא כרומטין רצף ניתוח
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול אשר נועד לנתח את הגנום כולו הכריכה של הגורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2 (Olig2) בתאי המוח בחריפות מטוהרים אוליגודנדרוציטים קודמן (OPCs) על-ידי ביצוע כרומטין נמוך-תא immunoprecipitation (ChIP) , ספריית הכנה, תפוקה גבוהה רצף וניתוח נתונים bioinformatic.
Abstract
בתרבית של תאים, שעתוק גנים מוסדר באופן ספציפי סוג התא על ידי פעולת הגומלין בין גורמים תעתיק עם הדנ א. גורמי שעתוק ספציפיים שושלת היוחסין נחשבים ממלאים תפקידים חיוניים ב מפרט תא ובידול במהלך הפיתוח. שבב בשילוב עם רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ’יפ-seq) נעשה שימוש נרחב כדי לנתח אתרי קישור ברמת הגנום של גורמי שעתוק (או שלה מורכב משויכת) ל- DNA גנומי. עם זאת, מספר גדול של תאים נדרשים עבור אחד שבב התגובה השגרתית, מה שהופך את זה קשה ללמוד מספר מוגבל של התאים הראשי מבודד או אוכלוסיות תאים נדיר. כדי להבין את מנגנון רגולטורי של שעתוק ספציפיים שושלת היוחסין אוליגודנדרוציטים מוצג גורם Olig2 העכבר בחריפות מטוהרים OPCs, שיטה מפורטת באמצעות שבב-seq לזהות את האתרים ברמת הגנום מחייב Olig2 (או Olig2 מורכבים). ראשית, הפרוטוקול מסביר כיצד לטהר את האלפא קולטן גורם גידול נגזר טסית דם (PDGFRα) OPCs חיובי מן מוח העכבר. בשלב הבא, נוגדן Olig2 מתווכת שבב, ספריית הבנייה מבוצעות. החלק האחרון מתאר את תוכנת bioinformatic של הליכים המשמשים לניתוח Olig2 שבב-seq. לסיכום, מאמר זה מדווח שיטה לנתח את איגודי ברמת הגנום של גנים ברמת השעתוק גורם Olig2 במוח בחריפות מטוהרים OPCs.
Introduction
חשוב ללמוד את החלבון (או החלבונים) ה-DNA כריכות, הסימנים epigenetic לבנות רשתות בקרה רגולטריות תעתיק המעורבים בתהליכים ביולוגיים שונים. במיוחד, איגודי גורמי שעתוק לדנ א הגנומי יכול לשחק תפקיד חשוב של הכונה, הבידול תא, לבין התפתחות רקמת. כלי רב עוצמה עבור הלומדים את תקנה תעתיק ואת מנגנוני epigenetic הוא immunoprecipitation כרומטין (ChIP). עקב התקדמות מהירה הטכנולוגיה רצף של הדור הבא, שבב בשילוב עם רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ’יפ-seq) משמש עבור הניתוחים של חלבון-DNA כריכות, סימני epigenetic1. עם זאת, פרוטוקול תקני seq שבב דורש כ-20 מיליון תאים לכל תגובה, מה שהופך את היישום של טכניקה זו קשה כאשר מספר התא מוגבל, כגון תאים בודדים ראשי אוכלוסיות תאים נדיר.
אוליגודנדרוציטים שושלת התאים כולל אוליגודנדרוציטים קודמן תאים (OPCs) ו אוליגודנדרוציטים מופצים באופן נרחב ברחבי המוח, הם חיוניים עבור ההתפתחות והתפקוד של המוח. כסוג של קודמן תאים, OPCs מסוגלים התחדשות עצמית והן בידול. OPCs לא רק לשמש אבות עבור oligodendrocytes להפוך אלא גם לשחק תפקיד חשוב הפצת אותות עצביים בהתקשרות עם סוגים אחרים של תאים במוח2. מחקרים קודמים הראו כי פיתוח אוליגודנדרוציטים מוסדר על ידי גורמי שעתוק שושלת היוחסין הספציפי כגון3,Olig2 ו- Sox104. גורמי שעתוק אלה נמצאו כדי לאגד האזורים יזם או שיפור של כמה גנים חיוניים כדי להשפיע על הביטוי שלהם במהלך אוליגודנדרוציטים מפרט ובידול. עם זאת, מאתגרות לזיהוי DNA קשירה של חלבון (או החלבונים) עניין בבחריפות מטוהרים OPCs ראשי עם מספר מאוד מצומצם של תאים.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקור באופן שיטתי את immunoprecipitated דנ א גנומי על ידי Olig2 ב העכבר מטוהרים OPCs בקנה מידה הגנום כולו באמצעות שבב-seq טכניקה. OPCs של מוח העכבר היו בחריפות מטוהרת על-ידי immunopanning, המשמשים ניסוי שבב ללא התפשטות בתוך חוץ גופית. מספר מוגבל של OPCs יכולה להיות מושגת על ידי immunopanning, והוא די לניסויים שבב-seq סטנדרטי. במסמך זה, פרוטוקול שבב-seq נמוך-תא עם יהיה נמוך ככל 20 אלף תאים לכל שבב תגובה עבור גורמי שעתוק מתואר. בקצרה, צולבים התאים היו lysed, sonicated על ידי מכשיר sonication להטיה של כרומטין. כרומטין הוטו, נדגרה עם נוגדנים Olig2, כמו גם חלבון חרוזים מצופים A, כדי לזרז Olig2 נוגדנים מאוגד הדנ א. לאחר • תנאי של חרוזים מצופים של חלבון ו- cross-linking הפוכה, דנ א גנומי משהחמיר נוגדן Olig2 היה טהור על ידי מיצוי פנול-כלורופורם. המוצר הסופי היה לכמת, נתון T-עוקב, פריימר חישול החלפת תבנית והסיומת, התוספת של מתאמי, הגברה, בחירת גודל הספרייה, טיהור צעדים לבניית ספריה שבב-seq.
לאחר רצף, ניתחנו את איכות הקריאות raw המדגם שהוכנו עם נוגדן פקטור שעתוק Olig2 והן את דגימת הבקרה. באיכות נמוכה בסיסי זוגות, מתאם המכילה לקרוא קטעים נגזמו. קריאות הבא, החתוך היו המיושר הגנום הפניה העכבר. האזורים גנומית זה היו באופן משמעותי מועשר עבור קריאות שבב, לעומת הדגימה שליטה, אותרו כמו פסגות. פסגות משמעותית, המייצג אתרי קישור פקטור שעתוק פוטנציאליים, מסוננים, דמיינו בדפדפן הגנום.
ראוי לציין, השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה ניתן באופן כללי על שבב-seq גורמים אחרים תמלול עם כל סוג התא של מספרים מוגבלת.
Protocol
Representative Results
Discussion
ג’ין בתרבית של רגולציה רשתות הם מורכבים מאוד. שבב-seq היא שיטה חזקה לחקור אינטראקציות חלבון-DNA הגנום כולו. פרוטוקול זה כולל כיצד לבצע Olig2 שבב-seq באמצעות מספר נמוך של OPCs מטוהרים מוח העכבר (נמוך כמו 20 אלף תאים לכל תגובה). הצעד הראשון מפתח עבור פרוטוקול זה הוא הטיהור של OPCs של מוח העכבר על ידי immunopanning…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, XD, RCDD ו- YY נתמכו על ידי מענקים נבחרת מוסדות של בריאות R01 NS088353; 1R21AR071583 גרנט NIH-01; קרן Staman אוגילבי קרן-אנדרטת הרמן; היוזמה המוח UTHealth ואת CTSA UL1 TR000371; מענק מן האוניברסיטה של טקסס מערכת מדעי המוח מכון המחקר Neurotechnology (גרנט #362469).
Materials
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
Riferimenti
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
- Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
- Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
- Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
- Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive ‘Phantom Peaks’ in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
- Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).
