Qui, è descritto un metodo per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana. Questo protocollo ha il chiaro vantaggio di produrre arricchito del microvessel campioni con proteina accettabile resa da singoli animali. Campioni possono quindi essere utilizzati per analisi di robusta proteina presso l'endotelio microvascolare cerebrale.
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Articolo metodologico
Un metodo semplice e riproducibile per preparare campioni di membrana da microvasi cerebrali appena isolati del ratto
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Emato - encefalica (BBB) è un tessuto barriera dinamica che risponde ai vari stimoli fisiopatologici e farmacologici. Tali cambiamenti derivanti da questi stimoli possono notevolmente modulano la consegna della droga per il cervello e, per estensione, causano notevoli sfide nel trattamento del sistema nervoso centrale (CNS) malattie. Molte modifiche BBB che interessano la farmacoterapia, coinvolgono proteine localizzate ed espresse a livello delle cellule endoteliali. Infatti, tale conoscenza sulla fisiologia BBB nella salute e nella malattia ha suscitato notevole interesse nello studio di queste proteine di membrana. Da un punto di vista di ricerca di scienza di base, ciò implica un requisito per un metodo semplice ma robusto e riproducibile per l'isolamento dei microvasi dal tessuto di cervello raccolto da animali da esperimento. Per preparare campioni di membrana da microvasi appena isolati, è indispensabile che la preparazione del campione essere arricchiti in cellule endoteliali ma limitati in presenza di altri tipi di cellule dell'unità neurovascolare (cioè, gli astrociti, microglia, neuroni, periciti). Un ulteriore vantaggio è la possibilità di preparare i campioni da singoli animali al fine di acquisire la vera variabilità dell'espressione della proteina in una popolazione sperimentale. In questo manoscritto, vengono forniti dettagli per quanto riguarda un metodo che viene utilizzato per l'isolamento di microvasi cerebrali di ratto e preparazione dei campioni di membrana. Arricchimento del microvessel, dai campioni derivati, è ottenuta utilizzando quattro fasi di centrifugazione dove destrano è incluso nel buffer del campione. Questo protocollo può essere facilmente adattato da altri laboratori per le proprie applicazioni specifiche. Campioni generati da questo protocollo sono stati indicati per produrre dati sperimentali affidabili da esperimenti di analisi di proteine che possono notevolmente facilitare la comprensione delle risposte BBB a stimoli fisiologici, fisiopatologici e farmacologici.
Introduzione
Emato - encefalica (BBB) esiste a livello di interfaccia tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la circolazione sistemica e svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dell'omeostasi del cervello. In particolare, le funzioni BBB al proprio controllo soluto le concentrazioni nel liquido extracellulare del cervello e di fornire in modo efficiente quei nutrienti necessari per soddisfare le richieste metaboliche considerevole del CNS1dal tessuto cerebrale. Questi ruoli implicano che la BBB, che esiste principalmente a livello della cellula endoteliale microvascolare, deve possedere meccanismi discreti che permettono alcune sostanze per accedere il....
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Protocollo
Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate da un istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) e si conformano al National Institutes of Health (NIH) e Animal Research: Reporting In Vivo esperimenti (arrivo) linee guida. Nella Figura 1è illustrato il flusso procedura per il protocollo.
1. set-up per la procedura
- Preparare il tampone del microvessel di cervello (BMB). Avviare pesando 54,66 g D-mannitolo, 1,90 g EGTA e 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (cioè, Tris) base in un bicchiere pulito. Aggiungere 1,0 L di acqua deionizzata. Miscelare i componenti de....
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Risultati
Il flusso sperimentale per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana del microvessel è mostrato nella Figura 1. Utilizzando la procedura qui presentata, è dimostrato successo isolamento dei microvessels intatti dal cervello del ratto (Figura 2A). Questi vasi sono stati ottenuti dopo completamento di centrifugazione con destrano e immediatamente prima dell'inizio ultracentrifugazio.......
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Discussione
In questo articolo, viene descritto un metodo semplice ed efficace di preparazione dei campioni di proteine di membrana da microvasi appena isolati dal tessuto di cervello di ratto. Diversi approcci per isolamento di microvasi cerebrali di ratto e/o generazione di preparazioni della membrana da microvasculature isolato sono stati segnalati in letteratura13,20,21,22 ,
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01-NS084941) e la Commissione di ricerca biomedica Arizona (ADHS16-162406) ptr. WA ha ricevuto in passato, il sostegno da un appuntamento pre-dottorato per un istituti nazionali di salute formazione Grant (T32-HL007249).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cocktail di inibitori della proteasi | Sigma-Aldrich | #P8340 | Componente del tampone dei microvasi cerebrali |
| D-mannitolo | Sigma-Aldrich | #M4125 | Componente del tampone dei microvasi cerebrali |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Componente del tampone dei microvasi cerebrali |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Componente del tampone dei microvasi cerebrali |
| Destrano (MW 75.000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Destrano utilizzato nelle fasi di centrifugazione per separare i microvasi dal parenchima cerebrale |
| Zetamina | MWI Animal Health | #501072 | Anestesia generale |
| Xilazina | Western Medical Supply | #5530 | Anestesia generale |
| Soluzione salina allo 0,9% | Western Medical Supply | N/A | Anestesia generale diluente |
| Carta da filtro (diametro 12,5 cm) | VWR | #28320-100 | Utilizzato per la rimozione di meningi dal tessuto cerebrale |
| Provette da centrifuga | Sarstedt | #60.540.386 | Provette monouso utilizzate per le fasi di centrifugazione del destrano |
| Pierce™ Saggio Coomassie Plus (Bradford) | ThermoFisher Scientific | #23236 | Misurazione della concentrazione di proteine nelle preparazioni a membrana |
| Omogeneizzatore di potenza a testa alta | Wheaton DWK Life Sciences | #903475 | Necessario per l'omogeneizzazione dei campioni Macinatore di tessuti per |
| mortaio e pestello in vetro da 10,0 ml | DWK Life Sciences | #358039 | Necessario per l'omogeneizzazione dei campioni |
| Acido cloridrico | Sigma-Aldrich | #H1758 | Necessario per la regolazione del pH dei tamponi |
| Albumina sierica bovina | ThermoFisher Scientific | #23210 | Standard proteico per il saggio Bradford |
| Pinze standard | Strumenti per la scienza fine | #91100-12 | Utilizzato per la dissezione del tessuto cerebrale |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Utilizzato per aprire il cranio per isolare il cervello |
| Provette da centrifuga coniche da 50 ml | ThermoFisher Scientific | #352070 | Utilizzato per la raccolta di tessuto cerebrale dopo l'isolamento Pipette |
| Pasteur in vetro | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Utilizzato per l'aspirazione di detriti cellulari dopo centrifughe di destrano |
| Etanolo, anidro | Sigma-Aldrich | #459836 | Utilizzato per la pulizia del macinatore di tessuti; diluito al 70% con acqua |
| distillataProvette per ultracentrifuga | Beckman-Coulter | #41121703 | Utilizzate per l'ultracentrifugazione di campioni |
Riferimenti
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T.
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Ristampe e permessi
