Summary
Hier wordt een methode voor het isoleren van de rat hersenen microvessels en voor de bereiding van de eindmonsters membraan beschreven. Dit protocol heeft het duidelijk voordeel van het produceren van verrijkte microvessel monsters met aanvaardbare eiwit van individuele dieren opbrengst. Steekproeven kunnen vervolgens worden gebruikt voor analyses van de robuuste proteïne in de hersenen microvasculaire endotheel.
Abstract
De bloed - hersenbarrière (BBB) is een dynamische barrière-weefsel dat op verschillende pathofysiologische en farmacologische stimuli reageert. Dergelijke veranderingen ten gevolge van deze prikkels kunnen sterk moduleren drug levering naar de hersenen en, bij uitbreiding, aanzienlijke uitdagingen bij de behandeling van het centrale zenuwstelsel (CNS) ziekten veroorzaken. Vele BBB veranderingen die invloed op farmacotherapie, waarbij eiwitten die zijn gelokaliseerd en uitgedrukt op het niveau van endotheliale cellen. Inderdaad, heeft deze kennis op BBB fysiologie in gezondheid en ziekte leidde tot aanzienlijke belangstelling voor de studie van deze membraaneiwitten. Vanuit een oogpunt van de fundamentele wetenschap onderzoek impliceert dit een verplichting voor een simpel maar robuust en reproduceerbare methode voor isolatie van de microvessels van hersenweefsel geoogst van proefdieren. Ter voorbereiding van membraan monsters van vers geïsoleerde microvessels, is het essentieel dat de staalvoorbereiding worden verrijkt in de endotheliale cellen maar in het bijzijn van andere celtypes van de neurovasculaire eenheid (dat wil zeggen, astrocyten, microglia, neuronen beperkt, pericytes). Een bijkomend voordeel is de mogelijkheid om voor te bereiden van monsters van individuele dieren om te vangen de ware variabiliteit van eiwit expressie in een experimentele bevolking. In dit manuscript vindt u details over een methode die wordt gebruikt voor isolatie van rat hersenen microvessels en bereiding van de monsters van het membraan. Verrijking van de Microvessel, van monsters afgeleid, wordt bereikt met behulp van vier centrifugeren stappen waar dextran is opgenomen in de steekproef buffer. Dit protocol kan gemakkelijk aangepast worden door andere laboratoria voor hun eigen specifieke toepassingen. Monsters die zijn gegenereerd op basis van dit protocol is aangetoond dat de opbrengst van robuuste experimentele gegevens van eiwit analyse experimenten die het begrip van BBB reacties op stimuli van farmacologische, fysiologische en pathofysiologische sterk kunnen helpen.
Introduction
De bloed - hersenbarrière (BBB) bestaat op het raakvlak tussen het centrale zenuwstelsel (CNS) en de systemische circulatie en speelt een essentiële rol in het behoud van de homeostase van de hersenen. In het bijzonder de BBB functies juist controle opgeloste concentraties in extracellulaire vloeistof van de hersenen en de voedingsstoffen die nodig zijn om te voldoen aan de aanzienlijke metabole eisen van de CNS1door hersenweefsel efficiënt te verstrekken. Deze rollen impliceren dat de BBB, die voornamelijk op het niveau van de microvasculaire endothelial cel bestaat, moet beschikken over een discrete mechanismen waarmee sommige stoffen tot hersenen parenchym en tegelijkertijd te garanderen dat potentieel schadelijke xenobiotica niet accumuleren. Inderdaad, microvasculaire endothelial hersencellen zijn niet fenêtré en vertonen beperkte Pinocytose, die zorgt voor een gebrek aan niet-selectieve permeabiliteit2. Bovendien express microvessel endothelial hersencellen tight junction en adherens junction eiwitten die te vormen een fysieke handelen "zegel" tussen aangrenzende endotheliale cellen en sterk beperken paracellular verspreiding van bloed overdraagbare stoffen in de hersenen Parenchym. Inderdaad, selectieve permeabiliteit van endogene en exogene stoffen vereist functionele uitdrukking van opname- en efflux vervoerders3. Algemene, strakke kruispunten, adherens kruispunten en vervoerders werken samen om de unieke barrière-eigenschappen van de BBB.
De BBB is een dynamische barrière die op farmacologische, fysiologische en pathofysiologische stimuli reageert. Bijvoorbeeld, is hypoxie/heroxygenatie stress aangetoond dat het moduleren van expressie van kritische tight junction eiwitten (dat wil zeggen, occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), die wordt geassocieerd met verhoogde paracellular permeabiliteit aan dergelijke vasculaire markeertekens als sacharose4,5,6. Vergelijkbare waarnemingen zijn gedaan bij de BBB in de omgeving van traumatische hersenen letsel7 en perifere inflammatoire pijn8,9. Deze dezelfde ziekten kunnen ook moduleren vervoer mechanismen op de BBB10,11,12,13,14. Inderdaad, hypoxie/heroxygenatie letsel verbetert functionele uitdrukking van organische anion vervoeren polypeptide 1a4 (Oatp1a4) op de BBB, die kunnen leiden tot een aanzienlijke stijging van het vervoer van bloed-aan-hersenen van specifieke Oatp vervoer substraten zoals taurocholate en Atorvastatine13. BBB eigenschappen kunnen ook worden gewijzigd door farmacotherapie zelf, een mechanisme dat kan een basis voor beide ingrijpende veranderingen in de effectiviteit van de drug in de hersenen en voor interactie van de drug-drug vormen. Bijvoorbeeld, signalering mechanismen van doelen van paracetamol nucleaire receptor in de hersenen microvasculaire endotheliale cellen, functionele expressie van de kritische efflux vervoerder P-glycoproteïne (P-gp) verhoogt, en wijzigt de tijd-afhankelijke analgesie verleend door morfine, vervoeren een opioïde pijnstillende drug en gevestigde P-gp substraat15. Een grondige kennis van BBB veranderingen, die kan worden opgewekt door ziekten of door drugs, vereist ook identificatie en karakterisering van specifieke regulerende mechanismen waarmee deze wijzigingen. Inderdaad, discrete signaalroutes zijn geïdentificeerd in hersenen microvasculaire endotheliale cellen die de moleculaire uitdrukking van strakke junction eiwitten16,17 en vervoerders15, bepalen 18,19. Samen genomen, deze opmerkingen aangeven dat complexe moleculaire pathways bij de regulering van BBB strakke kruispunten en vervoerders in zowel de volksgezondheid als de ziekte betrokken zijn.
Een belangrijke uitdaging in de studie van de BBB is de absolute vereiste van een eenvoudige en effectieve methode voor het isoleren van microvessels van hersenweefsel afkomstig van proefdieren en latere bereiding van de monsters van het membraan. Deze monsters moeten worden voorbereid, zodat ze zijn zowel met microvasculaire endothelial hersencellen verrijkt en in aanwezigheid van andere celtypes beperkt. In de afgelopen jaren, zijn meerdere methoden voor het isoleren van microvasculature van knaagdier hersenen gemeld in de wetenschappelijke literatuur13,20,21,22. Dit artikel beschrijft een eenvoudig, robuust, en reproduceerbare methode voor isolatie van de microvessels van de rat hersenen en voor de bereiding van endothelial membraan verrijkte monsters die kunnen worden gebruikt voor de analyse van eiwit expressie. Een voordeel van dit protocol van de isolatie microvessel is de mogelijkheid om een individuele proefdieren staalvoorbereiding van hoge kwaliteit en met voldoende eiwit opbrengst te verkrijgen. Hierdoor is de behandeling van dieren variabiliteit in eiwit expressie. Dergelijke een voorschot in dit protocol is sterk verbeterd de robuustheid van BBB studies omdat overschatting (of onder schatting) van de ware omvang van eiwit veranderingen bij de BBB kan nu worden vermeden. Daarnaast maakt de integratie van meerdere centrifugeren stappen met dextran verbeterde verrijking van microvessels in experimentele monsters terwijl het verwijderen van ongewenste cellulaire bestanddelen zoals neuronen vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die hieronder zijn goedgekeurd door een institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en voldoen aan de National Institutes of Health (NIH) en dier onderzoek: rapportage In Vivo experimenten (aankomen) richtlijnen. De procedurele gegevensstroom voor het protocol is afgebeeld in Figuur 1.
1. de set-up voor de Procedure
- Bereiden de hersenen microvessel buffer (BMB). Start door weging 54.66 g D-mannitol, 1.90 g EGTA en 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (d.w.z., Tris) base in een bekerglas van schoon. 1.0 L gedeïoniseerd water toevoegen. Het mengen van de componenten van de BMB-buffer met een magneetroerder. Zodra de oplossing heeft goed zijn gemengd, breng de pH op 7.4 met behulp van 1,0 M HCl.
- Bereid 26% dextran (MW 75.000)-oplossing (m/v) voorafgaand aan het anesthetizing van dieren. Bereid de dextran oplossing zoals beschreven in de volgende stappen.
Opmerking: Het is uitermate belangrijk voor te bereiden van deze oplossing tevoren omdat dextran ongeveer 1,5-2 h nemen kunt te ontbinden in waterige buffer.- Weeg de poedervorm dextran (26 g per 100 mL buffer) in een bekerglas van schoon.
- Meet de juiste hoeveelheid BMB en afzien in een bekerglas van afzonderlijke, schoon.
- Langzaam giet BMB in het bekerglas van gepoederde dextran. Handmatig mengen de poedervorm dextran tijdens het gieten van BMB met behulp van een roer roerstaaf.
- Breng de pH op 7.4 met 1,0 M HCl onmiddellijk vóór gebruik.
Opmerking: Een typische isolatie van hersenen microvessels van 12 individuele Sprague-Dawley ratten (mannelijk of vrouwelijk; 3 maanden oud; 200-250 g elke) 200 mL dextran oplossing (dat wil zeggen, de 52 g dextran in 200 mL BMB) vereist.
2. extractie van hersenweefsel van Sprague-Dawley ratten
- Na de gewenste experimentele behandeling, anesthetize Sprague-Dawley ratten met behulp van ketamine (50 mg/kg; 2,5 mL/kg i.p.) en xylazine (10 mg/mL; 2,5 mL/kg ik, p.). Verdun ketamine en xylazine in een 0,9% zoutoplossing om de eindconcentraties van 20 mg/mL en 4,0 mg/mL respectievelijk. Euthanaseren dieren door onthoofding met behulp van een scherp guillotine overeenkomstig de richtsnoeren van de IACUC. Gebruik dezelfde procedure voor zowel mannelijke als vrouwelijke Sprague-Dawley ratten.
- Resect de huid van de rat schedel door een enkele dwarse knippen met behulp van chirurgische scharen.
- Met behulp van rongeurs, verwijder voorzichtig de plaat van de schedel en het blootstellen van de hersenen.
- Het verwijderen van de hersenen met behulp van een spatel. Loskoppelen van de hersenen en de geïsoleerde hersenweefsel plaats in een conische tube van 50 mL, met 5 mL BMB. Voeg 1.0 l proteaseinhibitor cocktail per 1,0 mL BMB buffer onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik.
3. brain Processing
- Het hersenweefsel van de conische tube van 50 mL overbrengen naar een schone petrischaal.
- Met behulp van Tang, zachtjes rollen de hersenen op 12,5 cm diameter filterpapier te verwijderen van de buitenste hersenvliezen, die losjes de hand wordt gehouden aan de hersenschors. Zachtjes druk op het hersenweefsel tegen filtreerpapier en het weefsel weer rollen. Schakel het koffiefilter vaak tijdens deze stap.
- De plexus choroideus van de hersenhelften gebruik van pincet scheiden.
Opmerking: De plexus choroideus verschijnt als een duidelijke membraanachtig weefsel gelokaliseerd op het oppervlak van de hersenen ventrikels. - Voorzichtig plat van het hersenweefsel en verwijder resterende hersenvliezen en bulbus bollen met pincet.
- Plaats de corticale hersenweefsel in een gekoeld glas mortier. 5,0 mL van BMB met proteaseinhibitor cocktail aan het cement toevoegen.
- Met behulp van een overhead macht homogenizer, meng het hersenweefsel met behulp van 15 op en neer beroertes bij 3700 t/min. Uitvoeren van homogenisering met behulp van een 10 mL mortier en een stamper weefsel grinder. Tussen homogenisering van elke individuele monster, reinig de stamper met 70% ethanol.
Opmerking: Homogenisering lijnen verenigbaar zijn in termen van tempo moeten en omvang. - Giet het homogenaat in gelabelde centrifuge buizen.
4. centrifugeren stappen
- 8.0 mL van 26% dextran-oplossing toevoegen aan elke gelabelde centrifugebuis met hersenen homogenaat.
- Omkeren van de buis tweemaal en vervolgens grondig vortex het monster. Het gedrag van de vortexing van elk monster met behulp van meerdere hoeken om ervoor te zorgen een homogenisatie van het mengsel van hersenen homogenaat oplossing met 26% dextran oplossing.
- Centrifugeer steekproeven bij 5.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
Opmerking: Voor sommige analyses, het is nuttig om te vergelijken van hersenen microvessels met hersenen parenchym. Moet de beoordeling van de eiwituitdrukking in hersenen parenchym kan nodig hebt, het supernatant van deze stap van centrifugeren (dat wil zeggen, hersenen parenchymal breuk) worden verzameld en opgeslagen bij-80 ° C voor toekomstig gebruik. - Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een vacuüm aspirator en glazen pipet van Pasteur.
Opmerking: Let op moet men zich niet de pellet te verstoren. Anders zal de microvessels van de hersenen verzamelde hoeveelheid worden verminderd, die zal leiden tot aanzienlijke afname van de opbrengst van de eiwitten van deze procedure. - Resuspendeer de pellet in 5,0 mL van BMB met proteaseinhibitor cocktail (dat wil zeggen, 1,0 μl proteaseinhibitor cocktail per 1,0 mL BMB buffer). Vortex de pellet om homogenisatie van het mengsel.
- Voeg 8.0 mL van 26% dextran toe aan elke centrifugebuis en vortex zoals beschreven in stappen 4.1-4.2 van dit protocol.
- Centrifugeer steekproeven bij 5.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Met behulp van een vacuüm kolf en glazen pipet, gecombineerd supernatant en ervoor zorgen dat pellet met microvessel van de hersenen, hierdoor niet wordt verstoord.
Opmerking: Overmaat materiaal dat zich heeft gehouden aan de buiswand bevat geen microvessels en moet zorgvuldig schoongemaakt en verwijderd. - Herhaal stap 4.5 tot 4,8 een extra twee keer.
- Eenmaal 4 dextran centrifugeren stappen zijn voltooid, 5,0 mL van BMB toevoegen aan elke pellet en vortex aan resuspendeer de steekproef.
Opmerking: Na het voltooien van stap 4.10, hele microvessels kunnen worden verzameld voor analyse van eiwit lokalisatie. Dit kan worden bereikt door het nemen van een 50 μl aliquoot opnieuw gesuspendeerde microvessel pellet en smeren op een microscoopglaasje van glas. Microvessels zijn dan warmte-vastgesteld op 95 ° C gedurende 10 minuten op een blok van de verwarming gevolgd door fixatie in ijskoude ethanol voor een extra 10 min. dia's kunnen vervolgens worden opgeslagen bij 4 ° C totdat vereist voor imaging studies.
5. ultracentrifugatie ter voorbereiding van de monsters van totale hersenen microvasculaire membranen
- Monsters overbrengen in het gekoelde glas homogenizer.
- Met behulp van een overhead macht homogenizer, meng hersenweefsel met behulp van 8-10 op en neer beroertes bij 3000 t/min. Homogenisering wordt uitgevoerd met behulp van een 10 mL mortier en een stamper weefsel grinder. Reinig de stamper met 70% ethanol na homogenisatie van elke individuele monster.
- Overdracht van monsters voor de reiniging van de ultracentrifuge buizen. Nummer en elke individuele buis wegen. Evenwicht en koppel de buizen vóór het laden in de rotor van de ultracentrifuge.
Opmerking: Alle wegen en koppeling van de ultracentrifuge buizen moeten worden uitgevoerd met de caps op om ervoor te zorgen nauwkeurige meting van de gewichten van de buis. - Centrifugeer steekproeven bij 150.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Met behulp van een vacuüm kolf en glazen pipet van Pasteur, bovendrijvende substantie gecombineerd met behulp van zorg niet te verstoren de capillaire membraan-pellet.
- Op basis van de grootte van de pellet, het toevoegen van een passende volume van opslag buffer, die uit gedeïoniseerd water en BMB in een verhouding van 1:1 (v/v bestaat). Typisch, pellets zijn geresuspendeerde in 400-500 μL van opslag buffer. Protease inhibitor cocktail toevoegen aan de buffer van de opslag in een verhouding van 1,0 μl per 1,0 mL opslag buffer.
- Vortex monsters resuspendeer de pellet in opslag buffer.
- Met behulp van een glazen pipet van Pasteur, transfer capillaire membraan monsters naar een gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buis.
- Pass monster door een naald syringe 5 x om het monster wordt grondig gemengd en dat er geen cellulaire aggregaten bestaan.
- Opslaan van monsters bij-80 ° C totdat vereist voor analyse.
Opmerking: Eiwitgehalte van elk monster microvessel membraan is gemeten met behulp van de methode Bradford.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De experimentele stroom voor isolatie van rat hersenen microvessels en voor de bereiding van microvessel membraan monsters is afgebeeld in Figuur 1. Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd, succesvolle Isolatievan intact microvessels van rat hersenen is aangetoond (figuur 2A). Deze schepen werden verkregen na voltooiing van centrifugeren met dextran en onmiddellijk vóór ultracentrifugatie te bereiden membraan monsters (dat wil zeggen, volgende voltooiing van stap 4.10). In dit beeld, is de microvessel gekleurd met behulp van een antilichaam tegen Oatp1a4, een transporteur dat is aangetoond dat het goed op het plasma-membraan van hersenen microvasculaire endotheliale cellen2,11,13, worden uitgedrukt 18. Met behulp van westelijke vlekkenanalyse (figuur 2B), membraan preparaten van microvessels geoogst van vrouwelijke Sprague-Dawley ratten bleken te zijn verrijkt met bloedplaatjes endothelial cel adhesie molecuul-1 (PECAM-1; ook bekend als CD31), een marker eiwit voor microvasculature van de hersenen. PECAM-1 is een remmende co receptor die betrokken zijn bij de T-cel- en B-cel-signalering die zeer op het plasma-membraan van vasculaire endotheliale cellen wordt uitgedrukt. Tijdens de optimalisatie van dit protocol, werd PECAM verrijking waargenomen in membraan monsters opgesteld op basis van twee en vier dextran centrifugeren stappen. Zoals blijkt uit figuur 2B, was er geen verschil in PECAM expressie tussen monsters opgesteld op basis van verschillende centrifugeren volgt; echter, vier dextran draaiingen resulteerde in betere uitdrukking van endothelial vervoer eiwitten, geeft die aan verbeterde microvessel verrijking in de monsters. Bovendien is het gebruik van vier dextrans draaiingen verbeterde verwijdering van ongewenste cellulaire bestanddelen zoals aangegeven door verminderde expressie van neuronale marker eiwitten zoals synaptophysin18. Daarom, alle verdere voorbereidingen voor hersenen microvessel membranen werden uitgevoerd met behulp van vier dextran centrifugeren stappen. In onze westelijke vlek experimenten, werd de microtubulus samenstellende eiwit tubuline gebruikt als een besturingselement laden. Zoals bepaald door de eiwit analyse van Bradford, opbrengst membraan preparaten meestal eiwit concentraties variërend tussen 5,0 mg/mL en 10.0 mg/mL. Representatieve eiwit kwantificering resultaten zijn afgebeeld in tabel 1. Deze eiwit-waarden werden bepaald op basis van een standaard curve die is gegenereerd met behulp van bovien serumalbumine (BSA; 2,0 mg/mL) als de standaard (Figuur 3). EiwitSteekproeven werden 10-fold verdund in de analyse van Bradford.
Na eiwit kwantificering, microvessel membraan monsters kunnen worden gebruikt voor de biochemische methoden voor eiwit analyse zoals westelijke vlekkenanalyse, dot blots of co-immunoprecipitation. Figuur 4A beeldt een representatieve westelijke vlek voor de BBB vervoer eiwit glucose transporter-1 (Glut-1) waar monsters van tabel 1 zijn geanalyseerd. Schakel één banden op de juiste molecuulgewicht (dat wil zeggen, voorspelde te 54 kDa) voor deze zeer uitgesproken BBB eiwit werden ontdekt in elk monster membraan. Iedere individuele baan in deze westelijke vlek steekproef microvessel membraan bereid uit een enkele proefdieren. Gelijke eiwit in elke rijstrook werd bepaald met behulp van de natrium-kalium-ATPase (dat wil zeggen,+nb /K+ ATPase; voorspelde molecuulgewicht = 113 kDa) als een besturingselement laden. Zoals aangetoond in figuur 4B, werd hogere uitdrukking van Glut-1 bij de BBB waargenomen bij mannelijke ratten in vergelijking met hun vrouwelijke tegenhangers. Geen verschil in expressie van nb++ ATPase /K werd waargenomen tussen mannelijke en vrouwelijke dieren. Voor deze densitometric analyse, werden de banden quantitated ImageJ softwarematig.
Figuur 1: overzicht van de procedures en protocollen voor het isoleren van de rat hersenen microvessels en het voorbereiden van membraan monsters. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: representatieve gegevens intact microvessel en expressie van een vasculaire endothelial cel marker eiwit. A: Immunofluorescentie kleuring toonde lokalisatie van Oatp1a4, een transporteur dat is aangetoond dat goed bij de BBB, in een intacte hersenen microvessel geïsoleerd zoals beschreven in dit protocol worden uitgedrukt. Localisatie van de Oatp1a4 werd ontdekt met behulp van een specifieke konijn polyclonal antilichaam tegen Oatp1a4 bij een verdunning 1:10. Het secundaire antilichaam was een fluorescerende geconjugeerd anti-konijn IgG, die werd gebruikt bij een verdunning van 1:300. Schaal bar = 7,5 μm. B: Westelijke vlekkenanalyse aangetoond de zuiverheid van microvessel monsters door aan te tonen van de verrijking van het specifieke endothelial cel marker eiwit PECAM-1, die werd ontdekt met behulp van een muis monoklonaal antilichaam bij een verdunning 1:100. Het secundaire antilichaam was een anti-muis IgG bij een verdunning 1:50,000. BH = hersenen homogenaat, MV = ruwe microvessel Fractie, MVM = hersenen microvessel membranen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: een representatieve standaard curve voor de eiwit analyse van Bradford. Bovien serumalbumine (BSA) werd gebruikt als een standaard en is verdund tot de volgende concentraties: 0, 0,125 0,25, 0,50, 0.75, 1.0, 1,5 en 2,0 mg/mL. Absorptie werd gemeten op = 595 nm. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een gemiddelde van drie lezingen van de extinctie per BSA concentratie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vertegenwoordiger westelijke vlek Sex verschillen in Glut-1 expressie in het membraan monsters bereid tonen van geïsoleerde Rat hersenen Microvessels. A: westelijke vlekkenanalyse uitdrukking van Glut-1 toont in membraan monsters bereid uit microvessel van mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley ratten geïsoleerd. GLUT-1 werd ontdekt met behulp van een konijn monoklonaal antilichaam bij een verdunning 1:500. Het secundaire antilichaam was een monoklonaal anti-konijn IgG bij een verdunning 1:40,000. Na=+ ATPase /K, een plasmamembraan marker en het besturingselement laden, werd ontdekt met behulp van een polyclonal anti-konijn IgG in een 1: 40.000 verdunningen. B: Densitometric analyse van Glut-1 expressie in membraan monsters van mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley ratten geïsoleerd. Resultaten worden uitgedrukt als bedoel SEM uit 6 proefdieren per behandelde groep. Sterretjes geven aan gegevenspunten die statistisch significant van het besturingselement zijn. Een waarde van p < 0.05 werd beschouwd als statistisch significant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Dier | Gemiddelde absorptie | Gecorrigeerde extinctie | Berekende concentratie | Feitelijke concentratie |
| (Λ = 595 nm) | (mg/ml) | (mg/ml) | ||
| Mannelijke 1 | 0.7967 | 0.3859 | 0.768 | 7.68 |
| Mannelijke 2 | 0.7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7,42 |
| Mannelijke 3 | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8.17 |
| Mannelijke 4 | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7.72 |
| Mannelijke 5 | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | 7,63 |
| Mannelijke 6 | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6.08 |
| Vrouwelijke 1 | 0.7114 | 0.3006 | 0.578 | 5.78 |
| Vrouwelijke 2 | 0.7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7.74 |
| Vrouwelijke 3 | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8.2 |
| Vrouwelijke 4 | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6.7 |
| Vrouwelijke 5 | 0.8008 | 0.39 | 0.7773 | 7.77 |
| Vrouwelijke 6 | 0.7975 | 0.3867 | 0.77 | 7.7 |
Tabel 1: vertegenwoordiger eiwit concentraties van hersenen Microvessel preparaten afgeleid van mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley ratten. Gecorrigeerde extinctie waarden worden vastgesteld door af te trekken achtergrond absorptie bij l = 595 nm van absorptie van de gemiddelde waarden voor elke proefdieren. In deze test, was achtergrond extinctie vastbesloten om te worden 0.4108.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel, wordt een eenvoudige en effectieve methode voor te bereiden membraan EiwitSteekproeven van microvessels vers geïsoleerd van rat hersenweefsel beschreven. Verschillende benaderingen voor isolatie van rat hersenen microvessels en/of generatie van membraan preparaten van geïsoleerde microvasculature zijn gemeld in de literatuur13,20,21,22 , 24. Hoewel het microvessel isolatie protocol hierboven beschreven lijkt in principe, deze benadering is geoptimaliseerd zodat de bereiding van de monsters van het membraan met uitstekende eiwit opbrengst van een enkele proefdieren. Dit voorschot heeft geëlimineerd de noodzaak aan zwembad microvessels van ten minste drie Sprague-Dawley ratten om monsters met bevredigende eiwitverrijking voor gebruik in verschillende benaderingen voor eiwit analyse. Dergelijke benaderingen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, westelijke vlekkenanalyse, dot blots en co-immunoprecipitation. Opgemerkt moet worden dat de praktijk van het bundelen van microvessels van meerdere proefdieren voor het genereren van één sample sterk Inter groep variabiliteit vermindert. In zoverre de bundeling van de microvessel kan leiden tot gegevens met de beperkte verspreiding die geen echte variabiliteit in eiwit expressie waargenomen in een populatie van proefdieren. Aangezien monsters kunnen bereid worden uit één proefdieren, wordt de ware variabiliteit van een studie populatie vastgelegd, waardoor voor experimentele gegevens worden verkregen die meer representatief is voor het proces van het pathofysiologische of farmacologische onder examen. Een bijkomend voordeel is dat microvessel membraan monsters kunnen worden voorbereid met een beperkt aantal proefdieren.
Misschien is de belangrijkste overweging bij de uitvoering van dit protocol omvat de centrifugeren stappen. Inderdaad, centrifuges kunnen verschillen tussen laboratoria als gevolg van hun leeftijd, fabrikant, en/of algemene voorwaarde en integriteit. Dit kan leiden tot aanzienlijke verschillen in het niveau van de werkelijke g (of rpm) van rotatie naar rotatie. De rol van deze variatie in de integriteit van het monster kan worden geminimaliseerd door middel van centrifugeren van alle monsters in een enkele vergelijkende analyse samen in de dezelfde rotor op hetzelfde moment. Bijvoorbeeld, als een rotor slechts twaalf beschikbare "slots" voor monster buizen heeft, zullen de isolatie en de bereiding van de monsters van de microvessel in een afzonderlijk experiment beperkt tot twaalf. Deze behandeling zorgt ervoor dat bereid monsters van vergelijkbare kwaliteit zijn en dat elke variabiliteit in gemiddelde eiwit expressie tussen experimentele groepen kan worden toegewezen aan de voorwaarde van de behandeling zelf.
Een extra overweging betreft de voorbereiding van de 26% dextran oplossing, die vereist voor de scheiding van hersenen microvessels en parenchymal hersenweefsel via differentiële centrifugeren is. Dextran is een polymeer van de glucose met een prevalentie van α-1,6-linked eenheden en meestal bezit een lineaire structuur25. Het heeft ook een hoog water-bindingscapaciteit. Bijvoorbeeld, behoudt 1 g dextran 75 (dat wil zeggen, dextran met een gemiddelde molecuulgewicht van 75.000 Da zoals wordt gebruikt in dit protocol) ongeveer 20-25 mL water. Deze eigenschap van dextran kan leiden tot ingrijpende uitdagingen in de ontbinding van het poeder in de waterige buffer. Oplosbaarheid in water kan worden verbeterd door verwarming van de oplossing van de Dextraan tot een maximale temperatuur van 40 ° C. Bij verwarming communiceert het polymeer minder met watermoleculen, waardoor dextran tot een minder uitgebreide conformatie (dat wil zeggen, lagere graad van waterretentie) in oplossing. Verwarming aan hogere temperaturen zal leiden tot het polymeer dextran te breken en daarom zal zij ondoeltreffend zijn als een scheitrechter reagens. Bovendien is het essentieel dat de pH van de oplossing dextran aan 7.4 onmiddellijk voor het gebruik worden aangepast. Oplossingen van 26% dextran kunnen ervaren aanzienlijke pH verschuivingen, zelfs meer dan 1-2 uur na bereiding. Vanwege deze overwegingen, moet de 26% dextran oplossing worden bereid op de dag van het experiment, maar met voldoende tijd voorafgaand aan de isolatie van hersenweefsel voor ontbinding en adequate aanpassing van de pH.
Een beperking van dit protocol betekent de aanwezigheid van andere celtypes van de neurovasculaire eenheid (NVU) in microvessel preparaten. Naast endotheliale cellen, de NVU bestaat uit verschillende cellulaire componenten met inbegrip van gliale cellen (dat wil zeggen, astrocyten, microglia), pericytes en neuronen 3,26,27. Isolatie van de microvessels van knaagdier hersenen toont meestal verrijking met vasculaire endotheliale cellen; expressie van neuronale marker eiwitten en expressie van het gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP), een marker van de gevestigde Astrocyt, wordt echter ook waargenomen. Daarnaast zijn pericytes aanwezig in staalvoorbereiding vanwege hun intieme associatie met het vasculaire endotheel. Op dit moment is het vrijwel onmogelijk om te isoleren van de hersenen microvessels van proefdieren en alle pericytes, neuronen, en astrocyten te elimineren. Echter dit protocol is naar voren geschoven via meerdere centrifugeren stappen zodat de monsters worden verrijkt in endotheliale cellen (dat wil zeggen, zoals aangegeven door betere uitdrukking van PECAM-1 na elke stap centrifugeren) met beperkte aanwezigheid van andere cel typen ( dat wil zeggen, zoals aangegeven door verminderde expressie van de neuronale marker eiwit synaptophysin-1 na elke stap centrifugeren).
Over het algemeen kan deze aanpak voor isolatie van rat hersenen microvessels en voor de bereiding van de monsters van de membraan in elk laboratorium met belangstelling bestuderen van BBB eiwitten pathofysiologische of farmacologische omstandigheden worden aangepast. Dit protocol biedt bijvoorbeeld microvessel samples die kunnen worden gebruikt voor de studie van drug vervoer eiwitten die endogeen worden uitgedrukt op de BBB2,18. De robuustheid van deze aanpak heeft de waarneming van afzonderlijke wijzigingen in Oatp1a4 in reactie op farmacologische stimuli, experimentele gegevens dat ontwerp van strenge studies ter beoordeling van vervoerder functie en regulering op de BBB heeft geïnformeerd. Het hierboven beschreven protocol kan ook worden toegepast op eiwit analyses van strakke junction eiwitten en adherens junction eiwitten in een poging om te begrijpen van de BBB onder fysiologische omstandigheden en te bestuderen of wijzigingen in BBB integriteit in reactie op pathofysiologische en farmacologische stressoren. Duidelijk, dit protocol kan worden aangepast voor meerdere toepassingen op het gebied van de BBB en, dus, vertegenwoordigt een eenvoudig maar toch robuust en reproduceerbare methode die in BBB studies waarbij eiwit analyse kan worden opgenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01-NS084941) en de Arizona biomedisch onderzoek Commissie (ADHS16-162406) aan PTR. WA heeft ontvangen uit het verleden steun van een-gepromoveerde afspraak tot een nationale instituten van gezondheid opleiding verlenen (T32-HL007249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery? AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
