Summary
Qui, è descritto un metodo per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana. Questo protocollo ha il chiaro vantaggio di produrre arricchito del microvessel campioni con proteina accettabile resa da singoli animali. Campioni possono quindi essere utilizzati per analisi di robusta proteina presso l'endotelio microvascolare cerebrale.
Abstract
Emato - encefalica (BBB) è un tessuto barriera dinamica che risponde ai vari stimoli fisiopatologici e farmacologici. Tali cambiamenti derivanti da questi stimoli possono notevolmente modulano la consegna della droga per il cervello e, per estensione, causano notevoli sfide nel trattamento del sistema nervoso centrale (CNS) malattie. Molte modifiche BBB che interessano la farmacoterapia, coinvolgono proteine localizzate ed espresse a livello delle cellule endoteliali. Infatti, tale conoscenza sulla fisiologia BBB nella salute e nella malattia ha suscitato notevole interesse nello studio di queste proteine di membrana. Da un punto di vista di ricerca di scienza di base, ciò implica un requisito per un metodo semplice ma robusto e riproducibile per l'isolamento dei microvasi dal tessuto di cervello raccolto da animali da esperimento. Per preparare campioni di membrana da microvasi appena isolati, è indispensabile che la preparazione del campione essere arricchiti in cellule endoteliali ma limitati in presenza di altri tipi di cellule dell'unità neurovascolare (cioè, gli astrociti, microglia, neuroni, periciti). Un ulteriore vantaggio è la possibilità di preparare i campioni da singoli animali al fine di acquisire la vera variabilità dell'espressione della proteina in una popolazione sperimentale. In questo manoscritto, vengono forniti dettagli per quanto riguarda un metodo che viene utilizzato per l'isolamento di microvasi cerebrali di ratto e preparazione dei campioni di membrana. Arricchimento del microvessel, dai campioni derivati, è ottenuta utilizzando quattro fasi di centrifugazione dove destrano è incluso nel buffer del campione. Questo protocollo può essere facilmente adattato da altri laboratori per le proprie applicazioni specifiche. Campioni generati da questo protocollo sono stati indicati per produrre dati sperimentali affidabili da esperimenti di analisi di proteine che possono notevolmente facilitare la comprensione delle risposte BBB a stimoli fisiologici, fisiopatologici e farmacologici.
Introduction
Emato - encefalica (BBB) esiste a livello di interfaccia tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la circolazione sistemica e svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dell'omeostasi del cervello. In particolare, le funzioni BBB al proprio controllo soluto le concentrazioni nel liquido extracellulare del cervello e di fornire in modo efficiente quei nutrienti necessari per soddisfare le richieste metaboliche considerevole del CNS1dal tessuto cerebrale. Questi ruoli implicano che la BBB, che esiste principalmente a livello della cellula endoteliale microvascolare, deve possedere meccanismi discreti che permettono alcune sostanze per accedere il parenchima cerebrale, garantendo nel contempo che xenobiotici potenzialmente dannosi non può si accumulano. Infatti, cellule endoteliali microvascolari del cervello non sono fenestrate e pinocitosi limitato, che assicura una mancanza di permeabilità non selettivo2per mostre. Inoltre, le cellule endoteliali del microvessel di cervello esprimono proteine di giunzione junction e adherens strette che agiscono per formare un fisico "sigillo" tra cellule endoteliali adiacenti e limitare notevolmente paracellulare diffusione di sostanze ematica nel cervello parenchima. Infatti, la permeabilità selettiva di sostanze endogene ed esogene richiede espressione funzionale di assorbimento e efflusso trasportatori3. Nel complessive, strette giunzioni, giunzioni intermedie e trasportatori funzionano di concerto per mantenere le proprietà di barriera unico della BBB.
La BBB è una barriera dinamica che risponde agli stimoli fisiologici, fisiopatologici e farmacologici. Ad esempio, ipossia/riossigenazione stress ha dimostrato di modulare l'espressione di proteine di giunzione critici (cioè, occludina, zonulae occluden-1 (ZO-1)), che è associato con permeabilità paracellulare aumentato per gli indicatori vascolari come saccarosio4,5,6. Osservazioni simili sono state effettuate a BBB nella regolazione della ferita di cervello traumatica7 e dolore infiammatorio periferico8,9. Queste stesse malattie possono anche modulare i meccanismi di trasporto presso le BBB10,11,12,13,14. Infatti, ipossia/riossigenazione aumenta l'espressione funzionale di anioni organici che trasporta il polipeptide 1a4 (Oatp1a4) presso la BBB, che può portare ad un aumento significativo del trasporto di sangue al cervello di substrati specifici di trasporto Oatp come taurocholate e atorvastatina13. BBB proprietà possono anche essere alterate dalla farmacoterapia stessa, un meccanismo che possa costituire una base per entrambi profondi cambiamenti nell'efficacia droga nel cervello e per interazioni farmaco-farmaco. Ad esempio, meccanismi di recettori nucleari di bersagli di acetaminofene segnalazione in cellule endoteliali microvascolari del cervello, aumenta l'espressione funzionale del trasportatore di efflusso critico P-glicoproteina (P-gp) e modifica l'analgesia dipendente dal tempo conferiti dalla morfina, un analgesico oppioide e stabilito P-gp trasporto substrato15. Una conoscenza approfondita delle modifiche BBB, che può essere indotta da malattie o da farmaci, richiede anche l'identificazione e caratterizzazione di specifici meccanismi regolatori che controllano queste modifiche. Infatti, le vie di segnalazione discrete sono state identificate in cellule endoteliali microvascolari del cervello che controllano l'espressione molecolare di giunzione stretta proteine16,17 e trasportatori15, 18,19. Prese insieme, queste osservazioni indicano che vie molecolari complesse sono coinvolti nella regolazione delle giunzioni strette BBB e trasportatori in salute e malattia.
Una sfida significativa nello studio della BBB è il requisito assoluto di un metodo semplice ed efficace per l'isolamento dei microvasi da tessuto cerebrale derivato da animali da esperimento e successiva preparazione dei campioni di membrana. Questi campioni devono essere preparati in modo che sono sia arricchite in cellule endoteliali microvascolari del cervello e limitati in presenza di altri tipi di cellule. Sopra i passato parecchi anni, molteplici metodologie per l'isolamento di microvasculature dal cervello del roditore sono stati segnalati nella letteratura scientifica13,20,21,22. Questo articolo viene descritto un semplice, robusto e un metodo riproducibile per l'isolamento dei microvasi dal cervello del ratto e per la preparazione di campioni arricchita di membrana endoteliali che può essere utilizzato per l'analisi dell'espressione della proteina. Un vantaggio di questo protocollo di isolamento del microvessel è la capacità di ottenere la preparazione del campione di alta qualità e con resa sufficiente di proteina da un singolo animale sperimentale. In questo modo la considerazione della variabilità nell'espressione della proteina. Tale un anticipo in questo protocollo ha migliorato notevolmente la robustezza degli studi BBB perché over-estimation (o sottovalutazione) della vera grandezza dei cambiamenti della proteina a BBB ora può essere evitato. L'inclusione di più fasi di centrifugazione con destrano consente inoltre di arricchimento migliorata di microvasi in campioni sperimentali, facilitando la rimozione di costituenti cellulari indesiderate quali neuroni.
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Protocol
Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate da un istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) e si conformano al National Institutes of Health (NIH) e Animal Research: Reporting In Vivo esperimenti (arrivo) linee guida. Nella Figura 1è illustrato il flusso procedura per il protocollo.
1. set-up per la procedura
- Preparare il tampone del microvessel di cervello (BMB). Avviare pesando 54,66 g D-mannitolo, 1,90 g EGTA e 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (cioè, Tris) base in un bicchiere pulito. Aggiungere 1,0 L di acqua deionizzata. Miscelare i componenti del buffer BMB utilizzando un agitatore magnetico. Una volta che la soluzione è stata mescolata accuratamente, regolare il pH a 7.4 utilizzo 1,0 M HCl.
- Preparare la soluzione di destrano (75.000 MW) di 26% (w/v) prima anestetizzare gli animali. Preparare la soluzione di destrano come descritto nei passaggi seguenti.
Nota: È criticamente importante preparare questa soluzione prima del tempo perché destrano può prendere circa 1,5-2 h da sciogliere in tampone acquoso.- Pesare il destrano in polvere (26 g / 100 mL di tampone) in un becher pulito.
- Misurare il volume appropriato di BMB e versare in un becher separato, pulito.
- Versare lentamente BMB nel becher contenente destrano in polvere. Mescolare manualmente il destrano in polvere durante il versamento di BMB utilizzando un bastoncino per mescolare vetro.
- Regolare il pH a 7.4 con 1,0 M HCl immediatamente prima di utilizzare.
Nota: Un isolamento tipico di microvasi cerebrali da 12 ratti Sprague-Dawley individuali (maschio o femmina; 3 mesi di età; 200-250 g ciascuna) richiede 200 mL di soluzione del dextrano (cioè, del dextrano 52 g in 200 mL di BMB).
2. estrazione del tessuto di cervello dai ratti Sprague-Dawley
- Dopo il trattamento sperimentale desiderato, anestetizzare ratti Sprague-Dawley utilizzando ketamina (50 mg/kg; 2,5 mL/kg i.p.) e xilazina (10 mg/mL; 2,5 mL/kg I, p.). Diluire la ketamina e xilazina in soluzione fisiologica 0,9% a concentrazioni finali di 20 mg/mL e 4,0 mg/mL rispettivamente. Eutanasia animali per decapitazione usando una ghigliottina affilata conformemente agli orientamenti IACUC. Utilizzare la stessa procedura per ratti Sprague-Dawley maschi e femminili.
- Resecare la pelle dal cranio del ratto facendo un singolo taglio trasversa utilizzando forbici chirurgiche.
- Utilizzando Pinze ossivore, attentamente rimuovere la piastra di cranio ed esporre il cervello.
- Rimuovere il cervello con una spatola. Staccare il cervello e inserire il tessuto cerebrale isolato in una provetta conica da 50 mL contenente 5 mL di BMB. Aggiungere 1,0 µ l di inibitore della proteasi cocktail / 1,0 mL di tampone BMB immediatamente prima dell'uso.
3. brain Processing
- Trasferire il tessuto cerebrale dalla provetta conica da 50 mL per una piastra Petri pulita.
- Usando il forcipe, rotolare delicatamente il cervello su carta da filtro diametro 12,5 cm per rimuovere esterne meningi, che sono liberamente aderite alla corteccia cerebrale. Premere il tessuto cerebrale contro la carta da filtro delicatamente e tirare il tessuto ancora. Girare la carta filtro frequentemente durante questo passaggio.
- Separare il plesso coroideo dagli emisferi cerebrali usando il forcipe.
Nota: Il plesso coroideo appare come un tessuto chiaro membranoso localizzato sulla superficie dei ventricoli cerebrali. - Delicatamente appiattire il tessuto cerebrale e rimuovete le meningi e bulbi olfattivi usando il forcipe rimanenti.
- Posizionare il tessuto cerebrale corticale in un mortaio di vetro ghiacciato. Aggiungere 5,0 mL di cocktail contenenti inibitore della proteasi BMB nel mortaio.
- Utilizzando un omogeneizzatore di cavi elettrici, omogeneizzare il tessuto cerebrale usando 15 pinneggiata a 3.700 giri/min. Eseguire omogeneizzazione utilizzando una smerigliatrice di tessuto 10ml mortaio e pestello. Tra omogeneizzazione di ogni singolo campione, pulire il pestello con etanolo al 70%.
Nota: Omogeneizzazione colpi devono essere coerenti in termini di ritmo e grandezza. - Versate l'omogeneizzato in provette da centrifuga con etichetta.
4. centrifugazione passaggi
- Aggiungere 8,0 mL di soluzione del dextrano 26% per ogni provetta da centrifuga con etichetta contenente omogeneato del cervello.
- Capovolgere la provetta due volte e poi accuratamente Vortexare il campione. Condurre il Vortex di ciascun campione con angolazioni multiple per garantire un'accurata miscelazione della soluzione omogeneato del cervello con soluzione del dextrano del 26%.
- Centrifugare i campioni a 5.000 x g per 15 min a 4 ° C.
Nota: Per alcune analisi, è utile confrontare il cervello dei microvasi con parenchima cerebrale. Dovrebbe essere la valutazione dell'espressione proteica in parenchima cerebrale richiesto, il surnatante da questo passo di centrifugazione (cioè, frazione parenchimatica del cervello) possa essere raccolti e conservato a-80 ° C per un uso futuro. - Rimuovere il supernatante utilizzando un aspiratore e pipetta Pasteur in vetro.
Nota: Attenzione deve essere presa per non disturbare il pellet. In caso contrario, sarà ridotto quantitativo dei microvasi cerebrali raccolti, che diminuirà notevolmente il rendimento di proteina da questa procedura. - Risospendere il pellet in 5,0 mL di BMB contenente l'inibitore della proteasi cocktail (cioè, 1,0 μL inibitore della proteasi cocktail per 1,0 mL di buffer di BMB). Vortice il pellet per garantire la completa miscelazione.
- Aggiungere mL 8,0 del dextrano del 26% a ogni provetta da centrifuga e vortice come descritto ai punti 4.1-4.2 del presente protocollo.
- Centrifugare i campioni a 5.000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Utilizzando un termos e pipetta di vetro, aspirare il surnatante e garantire quel pellet contenente del microvessel cervello non viene interrotto.
Nota: Materiale di eccesso che abbia aderito alla parete del tubo non contiene dei microvasi e dovrebbe essere accuratamente puliti e rimosso. - Ripetere i passaggi da 4,5 a 4,8 un ulteriore due volte.
- Una volta 4 fasi di centrifugazione di destrano sono state completate, aggiungere 5,0 mL di BMB ogni pellet e vortexare per risospendere il campione.
Nota: Dopo il completamento del passaggio 4.10, microvasi interi possono essere raccolti per l'analisi di localizzazione della proteina. Questo può essere realizzato prendendo un 50 μL aliquota del precipitato risospeso microvessel e sbavature su un vetrino per microscopio. Microvasi sono quindi calore-fisso a 95 ° C per 10 minuti in un blocco di riscaldamento seguito da fissazione in etanolo ghiacciata per un ulteriore 10 min diapositive possono quindi essere archiviati a 4 ° C fino a quando richiesto per gli studi di imaging.
5. ultracentrifugazione per preparare campioni di membrane microvascolare cerebrale totale
- Trasferire campioni l'omogeneizzatore bicchiere precedentemente raffreddato.
- Utilizzando un omogeneizzatore di cavi elettrici, omogeneizzare il tessuto cerebrale usando 8-10 su e giù colpi a 3.000 giri/min. Omogeneizzazione è condotto utilizzando una smerigliatrice di tessuto 10ml mortaio e pestello. Pulire il pestello con etanolo al 70% dopo omogeneizzazione di ogni singolo campione.
- Trasferire i campioni per pulire i tubi ultracentrifuga. Numero e pesare ogni singolo tubo. Equilibrio e accoppiare i tubi prima di caricarli nel rotore ultracentrifuga.
Nota: Tutti i peso e accoppiamento di tubi ultracentrifuga devono svolgersi con i tappi su per garantire misure accurate di pesi del tubo. - Centrifugare i campioni a 150.000 x g per 1 h a 4 ° C.
- Usando un termos e vetro pipetta Pasteur, aspirare il surnatante facendo attenzione di non disturbare il pellet di membrana capillare.
- In base alle dimensioni della pallina, aggiungere un volume adeguato di buffer di memoria, che è composto di acqua deionizzata e BMB in un rapporto di 1:1 (v/v). In genere, i pellet sono risospese in 400-500 μL di tampone di deposito. Aggiungere cocktail inibitore della proteasi per il buffer di memoria in un rapporto di 1,0 µ l per 1,0 mL di buffer di memoria.
- Campioni di vortice per risospendere il pellet in buffer di archiviazione.
- Utilizzando un pipetta Pasteur di vetro, trasferire campioni di membrana capillare in una microcentrifuga da 1,5 mL con etichetta.
- Esempio di passaggio attraverso un ago siringa 5 x affinché il campione è mescolato completamente e che non aggregati cellulari esistono.
- Conservare i campioni a-80 ° C fino a quando non necessari per l'analisi.
Nota: Il contenuto proteico di ogni campione di membrana del microvessel è misurata utilizzando il metodo di Bradford.
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Representative Results
Il flusso sperimentale per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana del microvessel è mostrato nella Figura 1. Utilizzando la procedura qui presentata, è dimostrato successo isolamento dei microvessels intatti dal cervello del ratto (Figura 2A). Questi vasi sono stati ottenuti dopo completamento di centrifugazione con destrano e immediatamente prima dell'inizio ultracentrifugazione per preparare campioni di membrana (vale a dire, dopo il completamento del passaggio 4,10). In questa immagine, i microvasi sono macchiato usando un anticorpo contro Oatp1a4, un trasportatore che ha dimostrato di essere ben espresso sulla membrana plasmatica di cervello cellule endoteliali microvascolari2,11,13, 18. Utilizzando l'analisi western blot (Figura 2B), membrana preparati da microvasi raccolti da topi Sprague Dawley femminili sono stati indicati per essere arricchito in piastrinica endoteliale delle cellule adesione molecule-1 (PECAM-1; anche conosciuto come CD31), una proteina marker per microcircolo cerebrale. PECAM-1 è un inibitorio co-recettore coinvolti nella segnalazione della B-cellula e del T-cell che è altamente espressa sulla membrana plasmatica delle cellule endoteliali vascolari. Durante l'ottimizzazione del presente protocollo, arricchimento PECAM è stata osservata nei campioni di membrana preparati con due e quattro passaggi di centrifugazione di destrano. Come illustrato nella Figura 2B, non c'era nessuna differenza nell'espressione PECAM tra campioni preparati utilizzando la procedura di centrifugazione differenti; Tuttavia, quattro giri di destrano ha provocato in una migliore espressione delle proteine di trasporto endoteliale, che indica di arricchimento del microvessel migliorata nei campioni. Inoltre, l'uso di quattro destrani gira una migliore rimozione di costituenti cellulari indesiderate come indicato dalla riduzione dell'espressione di proteine marker neuronale come lo synaptophysin18. Di conseguenza, tutte le successive preparazioni per membrane del microvessel cerebrale sono state eseguite utilizzando quattro fasi di centrifugazione di destrano. Nei nostri esperimenti di western blot, la tubulina proteina costituente dei microtubuli è stato usato come un controllo di carico. Come determinato dall'analisi della proteina di Bradford, preparazioni della membrana in genere ottenere concentrazioni di proteine compreso tra 5,0 mg/mL e 10,0 mg/mL. Risultati di quantificazione della proteina rappresentativi sono rappresentati nella tabella 1. Questi valori di proteina sono stati determinati basato su una curva standard che è stata generata utilizzando albumina di siero bovino (BSA; 2,0 mg/mL) come standard (Figura 3). Campioni della proteina sono stati diluiti 10 volte nell'analisi di Bradford.
A seguito di quantificazione della proteina, campioni di membrana del microvessel possono essere utilizzati per metodologie biochimiche per l'analisi di proteine quali analisi western blot, dot blot o co-immunoprecipitazione. Figura 4A raffigura un rappresentante western blot per BBB trasporto proteina glucosio transporter-1 (Glut-1) dove sono stati analizzati campioni da tabella 1 . Cancellare singole bande presso il peso molecolare adeguato (cioè, previsto per essere 54 kDa) per questo BBB altamente espressi della proteina sono stati rilevati in ciascun campione di membrana. Ogni corsia individuo in questa macchia occidentale rappresenta il campione di membrana del microvessel preparato da un singolo animale sperimentale. Proteina uguale in ogni corsia è stata determinata utilizzando sodio-potassio ATPasi (i.e., Na+/k+ ATPasi; predetto peso molecolare = 113 kDa) come un controllo di carico. Come mostrato in Figura 4B, più alta espressione di Glut-1 presso la BBB è stata osservata in ratti maschii rispetto alle loro controparti femminili. Nessuna differenza nell'espressione di Na+/k+ dell'atpasi è stata osservata fra gli animali maschii e femminili. Per l'analisi densitometrica, bande sono stati quantificati utilizzando software ImageJ.
Figura 1: struttura di procedure e protocolli per isolare dei microvasi cerebrali di ratto e per preparare campioni di membrana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: dati rappresentativi risultati microvessel intatto e l'espressione di una proteina marker delle cellule endoteliali vascolari. R: Colorazione di immunofluorescenza hanno mostrato la localizzazione di Oatp1a4, un trasportatore che ha dimostrato di essere ben espresso al BBB, in un cervello intatto del microvessel isolato come descritto in questo protocollo. Oatp1a4 localizzazione è stato rilevato utilizzando un anticorpo policlonale di coniglio specifici contro Oatp1a4 a una diluizione di 01:10. L'anticorpo secondario era un IgG di anti-coniglio coniugato fluorescente che è stato utilizzato a una diluizione di 1: 300. Barra della scala = 7,5 μm. B: L'analisi Western blot ha dimostrato la purezza dei campioni del microvessel mostrando arricchimento della proteina marker specifici delle cellule endoteliali PECAM-1, che è stato rilevato utilizzando un anticorpo monoclonale murino a una diluizione di 1: 100. L'anticorpo secondario è stato un anti-IgG di topo ad una diluizione di 1: 50.000. BH = omogeneato del cervello, MV = frazione del microvessel grezza, MVM = membrane del microvessel cerebrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: una curva standard rappresentativa per l'analisi della proteina di Bradford. Albumina di siero bovino (BSA) è stato usato come standard ed è stata diluita per le seguenti concentrazioni: 0, 0.125, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5 e 2,0 mg/mL. Assorbanza è stata misurata a = 595 nm. Ogni punto dati rappresenta una media di tre letture di assorbenza per concentrazione di BSA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: rappresentanza macchia occidentale mostrando le differenze del sesso in espressione di Glut-1 nella membrana campioni preparati da isolato dei microvasi cerebrali di ratto. R: analisi Western blot Mostra espressione di Glut-1 in campioni di membrana preparati da microvasi isolati dai ratti Sprague-Dawley maschi e femminili. GLUT-1 è stato rilevato utilizzando un anticorpo monoclonale di coniglio ad una diluizione di 1: 500. L'anticorpo secondario era un monoclonale IgG anti-coniglio ad una diluizione di 1: 40.000. Na=/k+ dell'atpasi, un marcatore di membrana plasmatica e il controllo di carico, è stato rilevato utilizzando un IgG policlonale di anti-coniglio a una diluizione di 1: 40.000. B: Analisi densitometrica dell'espressione di Glut-1 in campioni di membrana isolato da ratti Sprague-Dawley maschi e femmine. Risultati sono espressi come media SEM 6 animali da esperimento per gruppo di trattamento. Gli asterischi indicano i punti di dati che sono statisticamente significativi dal controllo. Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Animale | Assorbanza media | Assorbanza rettificato | Concentrazione calcolata | Concentrazione effettiva |
| (Λ = 595 nm) | (mg/ml) | (mg/ml) | ||
| Maschio 1 | 0.7967 | 0.3859 | 0,768 | 7.68 |
| Maschio 2 | 0.7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7,42 |
| Maschio 3 | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8,17 |
| Maschio 4 | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7,72 |
| Maschio 5 | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | 7.63 |
| Maschio 6 | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6.08 |
| 1 femmina | 0.7114 | 0.3006 | 0.578 | 5,78 |
| Femmina 2 | 0.7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7.74 |
| Femmina 3 | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8.2 |
| Femmina 4 | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6.7 |
| 5 femmina | 0.8008 | 0.39 | 0.7773 | 7.77 |
| Femmina 6 | 0.7975 | 0,3867 | 0,77 | 7.7 |
Tabella 1: le concentrazioni di proteina rappresentante dal cervello del Microvessel preparazioni derivate da maschio e femmina a topi Sprague Dawley. Valori di assorbanza rettificato sono determinati sottraendo dell'assorbanza di fondo a l = 595 nm da assorbanza media valori per ciascun animale sperimentale. In questa analisi, dell'assorbanza di fondo è stata determinata per essere 0.4108.
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Discussion
In questo articolo, viene descritto un metodo semplice ed efficace di preparazione dei campioni di proteine di membrana da microvasi appena isolati dal tessuto di cervello di ratto. Diversi approcci per isolamento di microvasi cerebrali di ratto e/o generazione di preparazioni della membrana da microvasculature isolato sono stati segnalati in letteratura13,20,21,22 , 24. anche se il protocollo di isolamento del microvessel descritto sopra è simile in linea di principio, questo approccio è stato ottimizzato per consentire la preparazione dei campioni di membrana con proteina eccellente resa da un singolo animale sperimentale. Questo progresso ha eliminato la necessità per microvasi piscina da almeno tre ratti Sprague-Dawley al fine di ottenere campioni con arricchimento di proteine soddisfacente per uso in vari approcci per l'analisi della proteina. Tali metodi includono, ma non sono limitati a, l'analisi western blot, dot blot e co-immunoprecipitazione. Si deve osservare che la pratica del pooling dei microvasi più animali da esperimento per generare un singolo campione notevolmente riduce la variabilità inter-gruppo. In questa misura, pool di microvessel può causare dati con la diffusione ridotta che non rappresentano il vero variabilità nell'espressione della proteina in una popolazione di animali da esperimento. Poiché i campioni possono essere preparati dai singoli animali sperimentali, viene catturata il vera variabilità di una popolazione di studio, che consente di dati sperimentali di ottenere cioè più rappresentativa del processo fisiopatologico o farmacologico sotto esame. Un ulteriore vantaggio è che i campioni di membrana del microvessel possono essere preparati utilizzando un ridotto numero di animali da esperimento.
Forse la considerazione più critica nell'esecuzione del presente protocollo prevede i passaggi di centrifugazione. Infatti, centrifughe possono differire tra laboratori a causa della loro età, produttore, e/o complessiva condizione e l'integrità. Questo può portare a variazioni significative nel livello di effettivo g (o livello di giri/min) da spin a rotazione. Il ruolo di questa variazione nell'integrità del campione può essere minimizzato mediante centrifugazione di tutti i campioni in una singola analisi comparativa insieme nel rotore stesso allo stesso tempo. Ad esempio, se un rotore ha solo dodici slot disponibili per provette, quindi l'isolamento e la preparazione dei campioni del microvessel in un singolo esperimento sarà limitati a dodici. Questa considerazione assicura che i campioni preparati sono di qualità paragonabile e che può essere assegnato qualsiasi variabilità nell'espressione della proteina media tra gruppi sperimentali per la stessa condizione di trattamento.
Un'ulteriore considerazione comporta la preparazione della soluzione del dextrano 26%, che è richiesta per la separazione di microvasi cerebrali e il tessuto parenchimale cerebrale tramite centrifugazione differenziale. Destrano è un polimero di glucosio con una prevalenza di α-1,6-legata all'unità e in genere possiede una struttura lineare25. Ha anche una capacità di legare acqua alta. Ad esempio, 1 g di destrano 75 (cioè, destrano con un peso molecolare medio di 75.000 Da come viene utilizzato in questo protocollo) conserva circa 20-25 mL di acqua. Questa proprietà di destrano può portare a gravi sfide nella dissoluzione della polvere nel buffer acquoso. Solubilità in acqua può essere migliorata mediante riscaldamento della soluzione del dextrano a una temperatura massima di 40 ° C. Al momento di riscaldamento, il polimero interagisce meno con molecole di acqua, causando così destrano ad adottare una conformazione meno espansa (cioè, inferiore grado di ritenzione idrica) in soluzione. Riscaldamento a temperature più elevate causerà il polimero di destrano abbattere e, pertanto, esso sarà inefficace come reagente di separazione. Inoltre, è essenziale che il pH della soluzione del dextrano essere regolato a 7,4 immediatamente prima dell'uso. Soluzioni di destrano 26% possono sperimentare spostamenti significativi pH, ancor più di 1-2 ore dopo la preparazione. A causa di queste considerazioni, la soluzione di destrano 26% deve essere preparata il giorno dell'esperimento, ma con tempo sufficiente prima dell'isolamento del tessuto cerebrale per consentire dissoluzione e opportuna regolazione del pH.
Una limitazione di questo protocollo comporta la presenza di altri tipi di cellule dell'unità neurovascolare (NVU) nelle preparazioni del microvessel. Oltre alle cellule endoteliali, il NVU è composto da vari componenti cellulari inclusi cellule gliali (astrociti, microglia), periciti e neuroni 3,26,27. Isolamento di microvasi dal cervello del roditore Mostra tipicamente arricchimento con le cellule endoteliali vascolari; espressione di proteine marker neuronale come pure espressione della proteina silicea fibrillare glial (GFAP), un marcatore di astrociti stabilito, tuttavia, inoltre è osservato. Inoltre, i periciti sono presenti nella preparazione del campione a causa della loro associazione intima con l'endotelio vascolare. Allo stato attuale, è praticamente impossibile isolare dei microvasi cerebrali da animali da esperimento ed eliminare tutti i periciti, neuroni e astrociti. Tuttavia, questo protocollo è stato avanzato attraverso più fasi di centrifugazione affinché i campioni sono arricchiti in cellule endoteliali (cioè, come indicato dall'espressione migliorata di PECAM-1 che segue ogni passo di centrifugazione) con limitata presenza di altri tipi di cella ( cioè, come indicato dalla ridotta espressione del marcatore neuronale proteina synaptophysin-1 seguendo ogni passo di centrifugazione).
Nel complesso, questo approccio per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana può essere adattato in qualsiasi laboratorio con un interesse per lo studio di proteine BBB in condizioni fisiopatologiche o farmacologiche. Ad esempio, questo protocollo fornisce campioni del microvessel che possono essere utilizzati per lo studio delle proteine di trasporto di droga che sono espressi in modo endogeno al BBB2,18. La robustezza di questo approccio ha permesso l'osservazione dei cambiamenti discreti in Oatp1a4 in risposta a stimoli farmacologici, dati sperimentali che ha informato la progettazione di studi rigorosi per valutare la funzione di trasportatore e regolamento presso la BBB. Il protocollo descritto sopra può anche applicarsi alle analisi della proteina di giunzione stretta e proteine di giunzione dei adherens nel tentativo di comprendere la BBB in condizioni fisiologiche e per studiare i cambiamenti nell'integrità BBB in risposta a fisiopatologico e fattori di stress farmacologici. Chiaramente, questo protocollo può essere adattato per molteplici applicazioni nel campo BBB e, pertanto, rappresenta un metodo semplice ma robusto e riproducibile che può essere incorporato in studi BBB che richiedono l'analisi di proteine.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01-NS084941) e la Commissione di ricerca biomedica Arizona (ADHS16-162406) ptr. WA ha ricevuto in passato, il sostegno da un appuntamento pre-dottorato per un istituti nazionali di salute formazione Grant (T32-HL007249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
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