Summary
Burada, sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için bir yöntemi açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı örnekleri kabul edilebilir protein ile bireysel hayvanlardan verim zenginleştirilmiş microvessel üreten açık avantajı vardır. Örnekleri daha sonra beyin mikrovasküler endotel, sağlam protein analizleri için kullanılabilir.
Abstract
Kan - beyin bariyerini (BBB) çeşitli patofizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt veren dinamik bariyer dokudur. Bu uyaranlara kaynaklanan bu tür değişiklikler büyük ölçüde ilaç dağıtım beyne modüle ve, uzantısı tarafından (CNS) hastalıkları merkezi sinir sistemi tedavisinde önemli sorunlar neden. Farmakoterapi, etkileyen birçok BBB değişiklikler lokalize ve endotel hücre düzeyinde ifade proteinleri içerir. Gerçekten de, böyle bir bilgiye BBB fizyolojisi sağlığı ve hastalıkları üzerinde insan bu membran proteinlerinin büyük ilgi yol açtı. Bir temel bilim araştırma açısından bu deneysel hayvan--dan hasat beyin dokusundan yüzdeki yalıtım için basit ama güçlü ve tekrarlanabilir bir yöntem için bir gereklilik anlamına gelir. Taze izole yüzdeki membran örnekleri hazırlamak için bu örnek hazırlıklar endotel hücrelerinde zenginleştirilmiş ama nörovasküler birimi (astrocytes, microglia, nöronlar, varlığında diğer hücre tipleri sınırlı esastır perisitlerden). Bir yararı protein ifadesi deneysel bir nüfus içinde gerçek değişkenliği yakalamak için bireysel hayvanlardan örnekleri hazırlamak için yeteneğidir. Bu el yazması kullanılmaktadır sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için bir yöntem ile ilgili ayrıntılar sağlanmaktadır. Örneklerinden elde edilen, microvessel zenginleştirme dextran örnek arabellekte nerede dahil dört Santrifüjü adımlar kullanılarak elde edilir. Bu iletişim kuralı diğer laboratuvarlar için kendi özel uygulamalar tarafından kolayca adapte edilebilir. Bu iletişim kuralı oluşturulan örnekleri üzerinden BBB yanıt fizyolojik, patofizyolojik ve farmakolojik uyaranlara karşı anlayış büyük ölçüde yardımcı olabilir protein analizi deneyler sağlam deneysel veri vermeye gösterilmiştir.
Introduction
Kan - beyin bariyerini (BBB), merkezi sinir sistemi (MSS) ve sistemik dolaşımı arasındaki arayüzü var ve beyin homeostazı bakım içinde önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle, BBB işlevleri tam olarak kontrol çözünen konsantrasyonları beyin hücre dışı sıvı ve verimli bir şekilde beyin dokusu tarafından CNS1önemli metabolik taleplerini yerine getirmek için gerekli olan bu besin kaynağı. Öncelikle mikrovasküler endotel hücre düzeyinde var, BBB, potansiyel olarak zararlı xenobiotics yapamadığı sağlarken beyin parankimi erişmek bazı maddelerin etkinleştirmek ayrık mekanizmaları sahip olması gereken bu roller ima birikir. Nitekim, beyin mikrovasküler endotel hücreleri Poşlu değildir ve sigara seçici geçirgenlik2eksikliği sağlar sınırlı pinocytosis sergilemek. Ayrıca, beyin microvessel endotel hücreleri hızlı bir fiziksel "bitişik endotelyal hücreler arasında mühürle" ve büyük ölçüde kan kaynaklı maddeler paracellular Difüzyon beyin içine kısıtlamak formu için hareket sıkı Kavşağı ve adherens junction proteinler parankimi. Nitekim, seçici geçirgenlik endojen ve eksojen maddelerin alımı ve sızma taşıyıcı3fonksiyonel ifade gerektirir. Genel olarak, sıkı kavşaklar, adherens kavşaklar ve Işınlayıcılar konser BBB benzersiz bariyer özelliklerini korumak için çalışır.
BBB fizyolojik, patofizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt veren dinamik bir engeldir. Örneğin, hipoksi/reoxygenation stres vasküler işaretçileri için artan paracellular geçirgenliği ile ilişkili olduğu ifade (occludin,Yani, zonulae occluden-1 (ZO-1)), kritik sıkı kavşak proteinlerin modüle için gösterilen olarak sukroz4,5,6. Travmatik beyin hasarı7 ve çevresel enflamatuar ağrı8,9ortamda BBB, benzer gözlemler yapılmıştır. Bu aynı hastalıklar da taşıma mekanizmaları BBB10,11,12,13,14modüle. Nitekim, hipoksi/reoxygenation yaralanma organik anyon polipeptit 1a4 taşıma fonksiyonel ifade artırır (Oatp1a4) BBB, hangi yol açabilir için belirli Oatp taşıma yüzeylerde kan beyin taşımacılığının önemli artışlar gibi taurocholate atorvastatin ve13. BBB özellikleri, farmakoterapi kendisi, ilaç-ilaç etkileşimleri ve beyinde uyuşturucu etkinliği her iki derin değişiklikler için bir temel oluşturabilir bir mekanizma tarafından da değiştirilebilir. Örneğin, asetaminofen hedefleri nükleer reseptör sinyal mekanizmalar beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde kritik sızma ışınlama P-glikoprotein (P-gp) fonksiyonel ifade artırır ve zamana bağımlı analjezi değiştirir morfin tarafından doğan, bir opioid analjezik ilaç ve kurulan P-gp substrat15taşımacılığı. Hastalıklar veya uyuşturucu indüklenen, BBB değişiklikleri kapsamlı bir anlayış aynı zamanda kimlik ve bu değişiklikleri denetleyen belirli düzenleyici mekanizmaları karakterizasyonu gerektirir. Nitekim, ayrık sinyal yolları sıkı kavşak proteinler16,17 ve Işınlayıcılar15, moleküler ifade denetleyen beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde tespit edilmiştir 18,19. Birlikte ele alındığında, bu gözlemler karmaşık moleküler yolları BBB sıkı kavşak düzenlenmesi ve Işınlayıcılar sağlık ve hastalığında katılmaktadırlar gösterir.
BBB çalışmanın önemli bir mücadelesine izole yüzdeki beyin dokusundan deneysel hayvan ve membran örnekleri sonraki hazırlanması elde edilmesi için basit ve etkili bir yöntem mutlak zorunluluktur. Böylece onlar hem beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde zenginleştirilmiş ve diğer hücre tipleri huzurunda sınırlı bu örnekler hazırlanmalıdır. Son birkaç yıl içinde--dan kemirgen beyin microvasculature yalıtım için birden fazla metodolojiler içinde bilimsel literatür13,20,21,22bildirilmiştir. Bu makalede bir basit, sağlam ve tekrarlanabilir yöntemi protein ifade analiz için kullanılabilecek endotel membran zenginleştirilmiş örnekleri hazırlanması ve yüzdeki--dan sıçan beyin yalıtım için. Bir avantaj bu microvessel yalıtım protokol örnek hazırlıklar kaliteli ve yeterli protein verim ile bireysel bir deneysel hayvan edinmek için yeteneğidir. Bu protein ifadesindeki arası hayvan değişkenlik dikkate sağlar. Protein değişiklikleri BBB, gerçek büyüklükte aşırı tahmini (veya altında tahmin) şimdi önlenebilir çünkü böyle bir önceden bu iletişim kuralı yer sağlamlık BBB çalışmaların büyük ölçüde iyileşmiştir. Ayrıca, birden çok Santrifüjü adımı dextran ile eklenmesi nöronlar gibi istenmeyen hücresel bileşenlerin kaldırılmasını kolaylaştırmak ise deneysel örneklerinde yüzdeki geliştirilmiş zenginlik sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamlar ana hatlar aşağı bir kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış olan ve ulusal kurumları Sağlık (NIH) ve hayvan araştırma için uygun: In Vivo deneyler (varış) yönergeleri raporlama. İletişim kuralı için yordamsal akışı şekil 1' de tasvir edilir.
1. kurulum yordamı için
- Beyin microvessel arabellek (BMB) hazırlayın. Temiz bir ölçek 54.66 g D-mannitol, 1.90 g EGTA ve 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (yani, Tris) Bankası ağırlığında tarafından başlatın. 1.0 L deiyonize su ekleyin. Manyetik karıştırıcı kullanarak BMB arabellek bileşenleri karıştırmak. Bir kez belgili tanımlık eriyik iyice karışık, pH 7.4 1.0 M HCl kullanarak için ayarlayın.
- Hayvanlar anesthetizing önce % 26 dextran (MW 75.000) çözüm (w/v) hazırlayın. Dextran çözüm aşağıdaki adımlarda açıklandığı şekilde hazırlayın.
Not: Dextran yaklaşık 1,5-2 h sulu arabellekte çözülmeye alabilir, çünkü bu çözüm önceden hazırlamak kritik önemlidir.- Temiz bir kabı içine toz dextran (100 mL arabellek başına 26 g) dışarı tartın.
- BMB uygun hacmi ölçmek ve ayrı, temiz kabı dağıtmak.
- Yavaş yavaş BMB toz dextran içeren kabı dökün. El ile bir cam heyecan çubuk kullanarak BMB dökme sırasında toz dextran karıştırın.
- PH 7.4 ile kullanmak için 1.0 M HCl hemen önceki için ayarlayın.
Not: Beyin yüzdeki 12 bireysel Sprague-Dawley Rat üzerinden bir tipik yalıtım (erkek veya kadın; 3 ay-in yaş; 200-250 g) 200 mL dextran çözeltisi (yani, 52 g dextran BMB 200 ml) gerektirir.
2. çıkarma beyin dokusunun Sprague-Dawley Rat
- İstenen deneysel tedavi aşağıdaki anestezi ketamin (50 mg/kg; 2.5 mL/kg ı.p.) ve xylazine kullanan Sprague-Dawley Rat (10 mg/mL; 2.5 mL/kg ı, p.). Sırasıyla ketamin ve son konsantrasyonları 20 mg/mL ve 4,0 mg/mL % 0,9 serum xylazine oranında seyreltin. Hayvanlar tarafından IACUC yönergelere uygun olarak bilenmiş bir Giyotin kullanarak işten çıkarma ötenazi. Hem erkek hem de dişi Sprague-Dawley Rat için aynı yordamı kullanın.
- Sıçan kafatası derisini Cerrahi makas kullanarak tek bir çapraz kesim yaparak çıkarabileceğim.
- Rongeurs kullanarak, dikkatle kafatası plaka kaldırmak ve beyin bulaşmasına neden.
- Bir spatula kullanarak beyin kaldırın. Cerebrum ayırmak ve izole beyin dokusu BMB 5 mL içeren 50 mL konik tüp yerleştirin. Proteaz inhibitörü kullanılmadan önce kokteyl BMB arabellek hemen 1.0 mL 1.0 μL ekleyin.
3. beyin işleme
- Beyin dokusu 50 mL konik tüp sizden temiz bir petri kabına aktarın.
- Forseps kullanarak, yavaşça beyin gevşek serebral korteks yapıştırılır vardır dış zarları kaldırmak için 12,5 cm Çap filtre kağıdı rulo. Yavaşça beyin dokusu filtre kağıdı karşı basın ve doku tekrar rulo. Filtre kağıdı bu adımı sırasında sık sık açmak.
- Choroid plexus serebral hemisferlerin forseps kullanarak ayırın.
Not: Choroid plexus serebral ventrikül yüzeye yerelleştirilmiş bir açık membranöz doku olarak görünür. - Yavaşça beyin dokusu dümdüz ve kalan meninkslerde ve olfaktör ampuller forseps kullanarak kaldırın.
- Kortikal beyin dokusu soğutulmuş cam harç yerleştirin. BMB içeren proteaz inhibitörü kokteyl 5.0 mL harç için ekleyin.
- Bir genel gider güç homogenizer kullanarak, 15 vuruş yukarı ve aşağı 3.700 rpm'de kullanarak beyin dokusu lunaparkçı. Homojenizasyon bir 10 mL harç ve havaneli doku taşlama kullanarak gerçekleştirin. Tek tek her örnek homojenizasyon arasında % 70 etanol kullanarak havaneli temiz.
Not: vuruş hızı açısından tutarlı olmalıdır homojenizasyon ve parlaklığı. - Homogenate etiketli santrifüj tüpler içine dökün.
4. Santrifüjü adımları
- Beyin homogenate içeren her etiketli santrifüj tüpü 8.0 mL % 26 dextran çözeltisi ekleyin.
- Tüp iki kez ters çevir'i ve sonra iyice girdap örnek. Vortexing beyin homogenate çözüm % 26 dextran çözüm ile kapsamlı bir karıştırma sağlamak için birçok açıdan kullanarak her örneğinin kuralları.
- Santrifüj örnekleri, 5000 x g 4 ° C'de 15 dakika
Not: bazı analizleri için beyin yüzdeki beyin parankimi ile karşılaştırmak yararlı olur. Beyin parankimi ifadede protein değerlendirilmesi-meli var olmak gerekli, bu Santrifüjü adım (yani, beyin parenkima kesir) süpernatant toplanacak ve ileride kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan. - Bir vakum aspiratör kullanarak süpernatant kaldırmak ve Pasteur pipet cam.
Not: Pelet rahatsız etmek dikkat alınmalıdır. Aksi takdirde, hangi önemli ölçüde bu yordamdan protein verim azalacak toplanan beyin yüzdeki miktarı azalacaktır. - Pelet BMB içeren proteaz inhibitörü kokteyl (yani, 1.0 μL proteaz inhibitörü BMB arabellek 1.0 mL kokteyl) 5.0 ml resuspend. Girdap Pelet ayrıntılı karıştırma sağlamak için.
- % 26 dextran 8.0 mL her santrifüj tüpü ve girdap bu protokolü 4.1-4.2 adımlarda açıklandığı gibi ekleyin.
- Santrifüj örnekleri, 5000 x g 4 ° C'de 15 dakika
- Bir vakum şişe ve cam pipet kullanarak, süpernatant Aspire edin ve beyin microvessel içeren bu Pelet değil bozulur emin olun.
Not: tüp duvara yapıştırılır aşırı malzeme yüzdeki içermiyor ve dikkatle temizlenmesi ve kaldırıldı. - Ek bir 4,8 4,5 adımları iki kez tekrarlayın.
- Bir kez 4 dextran Santrifüjü adım tamamlanmıştır, her Pelet ve örnek resuspend girdap BMB 5.0 mL ekleyin.
Not: adım 4,10 tamamlanmasını takiben, protein yerelleştirme analizi için bütün yüzdeki toplanabilir. Bu 50 μL yeniden askıya alınmış microvessel Pelet aliquot alarak ve cam mikroskop slaytta bulaşması gerçekleştirilebilir. Yüzdeki o zaman ısı için bir ek 10 dk. slaytlar sonra çalışmalar görüntüleme için gerekli kadar 4 ° C'de depolanan için buz gibi etanol fiksasyonu ardından Isıtma blokta 10 min 95 ° C'de sabit vardır.
5. ultrasantrifüj toplam beyin mikrovasküler membranlar örnekleri hazırlamak için
- Örnekleri soğutulmuş cam homogenizer aktarın.
- Bir genel gider güç homogenizer kullanarak, 8-10 vuruş aşağı yukarı 3000 rpm'de kullanarak beyin dokusu lunaparkçı. Homojenizasyon bir 10 mL harç ve havaneli doku taşlama kullanarak yapılır. Tek tek her örnek homojenizasyon takip % 70 etanol kullanarak havaneli temiz.
- Ultracentrifuge tüpler temizlemek için örnekleri aktarın. Numara ve bireysel her tüpün tartın. Denge ve tüpler yükleme ultracentrifuge rotor içine önce çift.
Not: Tüm ağırlığında ve ultracentrifuge tüpler eşleştirme kapaklar ile üzerinde tüp ağırlıklar doğru ölçüm sağlamak için yapılmalıdır. - Santrifüj örnekleri 150.000 x g 4 ° C'de 1 h için de
- Bir vakum şişe ve cam Pasteur pipet, kullanarak Aspire süpernatant kullanarak bakım kapiller membran Pelet bozmaya değil.
- Pelet boyutuna göre deiyonize su ve BMB bir 1:1 (v/v) oranı oluşur depolama arabellek uygun bir birimi ekleyin. Genellikle, granül 400-500 μL depolama arabellek içinde resuspended. Proteaz inhibitörü kokteyl 1.0 μL depolama arabellek 1.0 mL başına oranında depolama arabellek ekleyin.
- Girdap örnekleri Pelet depolama arabellek resuspend.
- Bir cam Pasteur pipet kullanarak, kapiller membran örnekleri etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
- Geçiş örnek bir iğne aracılığıyla şırınga 5 x örnek iyice karıştırılır ve hücresel yok toplamları bulunduğundan emin olun.
- Örnekleri-80 ° analiz için gerekli kadar C'de depolayın.
Not: Her microvessel membran örnek Protein içeriği Bradford yöntemi kullanılarak ölçülür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel akışı sıçan beyin yüzdeki izolasyonu ve microvessel membran örnekleri hazırlanması için şekil 1' de gösterilmiştir. Burada sunulan yordamını kullanarak--dan sıçan beyin sağlam yüzdeki başarılı yalıtım gösterilmiştir (şekil 2A). Bu gemiler Santrifüjü dextran ve hemen ultrasantrifüj membran örnekleri (yani, aşağıdaki tamamlanma adımının 4.10) hazırlamaya başlamadan önce tamamlanmasının ardından elde edilmiştir. Bu görüntüde, microvessel bir antikor Oatp1a4, de plazma zarı beyin mikrovasküler endotel hücreleri2,11,13ifade için gösterilen bir taşıyıcı karşı kullanarak lekeli, 18. Western blot analizi (şekil 2B), hazırlıklar kadın Sprague-Dawley sıçanlarından emir hasat yüzdeki üzerinden gösterildi membran ile olmak trombosit endotel hücre adezyon molekülü-1 (PECAM-1; CD31 olarak da bilinir), bir işaretleyici protein için zenginleştirilmiş beyin microvasculature. PECAM-1, vasküler endotel hücrelerinin plazma membran üzerinde son derece ifade edilen bir inhibitör co reseptör T-hücre ve B-hücre sinyallemesi dahil olduğunu. Bu iletişim kuralının en iyileştirme sırasında iki ve dört dextran Santrifüjü adımlar kullanılarak hazırlanan zar örneklerinde PECAM zenginleştirme gözlendi. Şekil 2Biçinde gösterildiği gibi PECAM ifade farklı aralıklarla adımları kullanarak hazırlanan örnek arasında hiçbir fark vardı; Ancak, dört dextran spin sonuçlandı endotel taşıma proteinleri geliştirilmiş ifadesinde, geliştirilmiş microvessel zenginleştirme örnekleri gösterir. Ayrıca, dört dextrans kullanımı istenmeyen hücresel bileşenlerinin geliştirilmiş kaldırma synaptophysin18gibi nöronal marker proteinlerin azaltılmış ifade tarafından belirtildiği şekilde döner. Bu nedenle, beyin microvessel membranlar için tüm sonraki hazırlıklar dört dextran Santrifüjü adımları kullanarak gerçekleştirilen. Bizim Batı leke deneylerde Mikrotubul kurucu protein tübülin yükleme denetimi olarak kullanıldı. Bradford protein tahlil tarafından belirlenen membran hazırlıklar genellikle protein konsantrasyonları 5.0 mg/mL ve 10.0 mg/mL arasında değişen verim. Temsilcisi protein miktar sonuçları Tablo 1' de tasvir edilmektedir. Bu protein değerleri sığır serum albumin (BSA; 2.0 mg/mL) kullanılarak oluşturulan standart bir eğri dayalı standart (şekil 3) belirlenmiştir. Protein örnekleri seyreltilmiş 10 kat Bradford tahlil.
Protein miktar, microvessel membran örnekleri western blot analizi, nokta lekeleri veya co-immunoprecipitation gibi protein analizi için biyokimyasal yöntemler için yararlı olabilir. Şekil 4A BBB taşıma protein glikoz taşıyıcı-nerede Tablo 1 örnekleri analiz edildi 1 (Glut-1) için bir temsilci Batı leke gösteriyor. Temizleyin uygun moleküler ağırlık itibariyle tek bantları (yani, 54 kDa olduğu tahmin) bu son derece ifade BBB için protein her membran örneği algılandı. Batı bu leke bireysel her şeritte microvessel membran örnek tek bir deneysel hayvan hazırlanan temsil eder. Her şeritte eşit protein sodyum-potasyum ATPaz kullanarak kararlı (yani, Na+/K+ ATPaz; tahmin edilen Moleküler ağırlığı 113 kDa =) yükleme denetimi olarak. Şekil 4B' de gösterildiği Glut-1 BBB, daha yüksek ifade kadın karşılıkları ile karşılaştırıldığında erkek rats gözlendi. Na+ifade hiçbir fark /K+ ATPaz erkek ve dişi hayvanlar arasında gözlendi. Bu densitometric çözümleme için bantları ImageJ yazılımını kullanarak quantitated.
Şekil 1: anahat sıçan beyin yüzdeki izole etmek ve membran örnekleri hazırlamak için bir yordam ve protokolleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: temsilcisi veri bozulmamış microvessel ve vasküler endotel hücre işaretçisi protein ifade gösteren. A: Ayirt boyama Oatp1a4, BBB, bu protokol için açıklandığı gibi izole bir olduğu gibi beyin microvessel, iyi ifade için gösterilen bir ışınlama yerelleştirilmesini gösterdi. Oatp1a4 yerelleştirme belirli tavşan poliklonal antikor Oatp1a4 karşı 1:10 seyreltme kullanarak tespit edildi. İkincil antikor IgG 1:300 bir seyreltme kullanılan, floresan konjuge ve anti-tavşan oldu. Ölçek çubuğu 7,5 mikron =. B: Western blot analizi bir fare Monoklonal antikor 1: 100 dilüsyonu kullanılarak tespit edildi zenginleştirme belirli endotel hücre işaretçisi protein PECAM-1, göstererek microvessel örnekleri saflığı gösterdi. İkincil antikor bir anti-IgG 1:50,000 seyreltme, fareydi. BH beyin homogenate, MV = ham microvessel kesir, MVM = beyin microvessel membranlar =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir temsilcisi standart eğri Bradford Protein tahlil için. Sığır serum albumin (BSA) ve standart olarak kullanılan aşağıdaki konsantrasyonlar seyreltilmiş: 0, 0.125, 0,25, 0,50, 0,75, 1.0, 1.5 ve 2.0 mg/mL. Ölçülen Absorbans, 595 = nm. Her bir veri noktasını üç Absorbans ölçümleri BSA konsantrasyon başına ortalama temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: cinsiyet farklılıkları Glut-1 ifade örnekleri membran hazırlanan izole sıçan beyin yüzdeki gösterilen temsilcisi Batı leke. A: Western blot analizi ve erkek Sprague-Dawley sıçanlarından emir izole microvessel hazırlanan zar örneklerinde Glut-1'in ifade gösterir. GLUT-1 tavşan Monoklonal antikor 1:500 dilüsyonu kullanılarak tespit edildi. İkincil antikor monoklonal bir anti-tavşan IgG 1:40,000 seyreltme, yapıldı. Na=/K+ ATPaz, plazma zarı marker ve yükleme denetim poliklonal Anti-tavşan IgG 1: 40.000 dilutions kullanarak algılandı. B: Glut-1 ifade izole kadın ve erkek Sprague-Dawley sıçanlarından emir zar örneklerinde densitometric analizi. Sonuçları tedavi grubu başına 6 deneysel hayvanlardan SEM demek olarak ifade edilir. Yıldız denetiminden istatistiksel olarak anlamlı veri noktalarını gösterir. P < 0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hayvan | Ortalama absorbans | Ayarlanan absorbans | Hesaplanan konsantrasyon | Gerçek konsantrasyonu |
| (λ = 595 nm) | (mg/ml) | (mg/ml) | ||
| Erkek 1 | 0.7967 | 0.3859 | 0.768 | 7,68 |
| Erkek 2 | 0.7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7,42 |
| Erkek 3 | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8,17 |
| Erkek 4 | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7,72 |
| Erkek 5 | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | 7.63 |
| Erkek 6 | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6.08 |
| Kadın 1 | 0.7114 | 0.3006 | 0.578 | 5,78 |
| Kadın 2 | 0.7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7,74 |
| Kadın 3 | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8.2 |
| Kadın 4 | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6,7 |
| Kadın 5 | 0.8008 | 0,39 | 0.7773 | 7,77 |
| Kadın 6 | 0.7975 | 0.3867 | 0.77 | 7,7 |
Tablo 1: temsilcisi Protein konsantrasyonları beyin Microvessel hazırlıklar üzerinden elde edilen kadın ve erkek Sprague-Dawley sıçanlarından emir. Ayarlanan Absorbans değerleri l Absorbans arka plan çıkarılarak belirlenir = 595 nm üzerinden ortalama Absorbans değerleri her deneysel hayvan için. Bu tahlil, arka plan Absorbans 0.4108 olarak tespit edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, taze sıçan beyin dokusundan izole yüzdeki membran protein örnekleri hazırlama basit ve etkili bir yöntem açıklanmıştır. İzole microvasculature sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve/veya membran hazırlıklar nesil için çeşitli yaklaşımlar içinde edebiyat13,20,21,22 bildirilmiştir , 24. microvessel yalıtım Protokolü yukarıda açıklanan ilke olarak benzer olsa da, bu yaklaşım membran örnekleri tek bir deneysel hayvan mükemmel protein verim ile hazırlanması etkinleştirmek için optimize edilmiştir. Bu önceden gerek havuzu yüzdeki için en az üç Sprague-Dawley sıçanlarından emir örneklerini protein analizi için çeşitli yaklaşımlar kullanmak için tatmin edici protein zenginleştirme ile almak için ortadan kaldırdı. Bu tür yaklaşımlar, bunlarla western blot analizi, nokta lekeleri ve co-immunoprecipitation için sınırlı değildir. Bu büyük ölçüde tek bir örnek oluşturmak için birden çok deneysel hayvanlardan yüzdeki havuzu uygulaması arası grup değişkenliği azaltır olması gerekmektedir. Bu dereceye microvessel havuzu oluşturma veri deneysel hayvan nüfusu içinde gözlenen protein ifadesindeki gerçek değişkenlik göstermez azaltılmış yayılması ile sonuçlanabilir. Örnekleri tek deneysel hayvanlardan hazırlanmış olabilir bu yana, bir çalışma nüfus doğru değişkenliği, yani daha fazla temsilcisi patofizyolojik veya farmakolojik sürecin altında elde edilecek deneysel veriler için sağlayan yakalanır sınav. Bir ek yararı microvessel membran örnekleri deneysel hayvan azaltılmış bir dizi kullanarak hazırlanabilir olmasıdır.
Belki de bu protokolü yürütülmesinde en önemli dikkate Santrifüjü adımları içerir. Nitekim, santrifüjler laboratuvarları kendi yaş, üretici, ve/veya genel durumu nedeniyle ve bütünlüğü arasında farklı olabilir. Bu gerçek g düzeyi (veya d/d düzeyi) önemli değişimler spin spin yol açabilir. Bu varyasyon örnek bütünlük içinde rolünün bir tek karşılaştırmalı analizde birlikte aynı rotor tüm örneklerinde Santrifüjü aynı zamanda en aza indirilebilir. Bir rotor örnek tüpler için sadece on iki yuva varsa, örneğin, daha sonra izolasyon ve bireysel bir deneme örneklerinde microvessel hazırlanması için on iki sınırlı olacaktır. Bu dikkate hazır örneklerdir karşılaştırılabilir kalitesi ve deneysel grupları arasında ortalama protein ifade herhangi bir değişkenlik tedavi durumuna atanabilir sağlar.
Bir ek dikkate beyin yüzdeki ve beyin parenkima dokusu ile fark Santrifüjü ayrılması için gerekli olan % 26 dextran çözüm hazırlanması içerir. Dextran α-1,6-bağlı birimlerden yaygınlığı ile glikoz polimer ve genellikle doğrusal yapı25sahiptir. Ayrıca yüksek su Bağlama kapasitesi vardır. Örneğin, 1 g dextran 75 (yani, bu protokol için kullanıldığı gibi 75.000 Da bir ortalama molekül ağırlığı ile dextran) yaklaşık 20-25 mL su korur. Dextran bu özellik toz sulu arabelleğine eriterek derin sorunlara yol açabilir. Sulu çözünürlük dextran çözüm 40 ° c en yüksek bir sıcaklığa Isıtma tarafından geliştirilebilir Isıtma üzerine, polimer daha az su molekülleri, böylece daha az Genişletilmiş biçimi (yani, alt düzeyde su tutma) çözüm benimsemeye dextran neden ile etkileşime girer. Daha yüksek sıcaklıklara ısınma yıkmak dextran polimer neden olur ve, bu nedenle, ayıran bir reaktif etkisiz olacaktır. Ayrıca, dextran çözüm pH 7.4 kullanımdan hemen önce ayarlanması gereklidir. % 26 dextran çözümler önemli pH vardiya, hatta üzerinde 1-2 saat hazırlama takip yaşayabilirsiniz. Bu hususlar nedeniyle % 26 dextran çözüm gün deneme ama yeterli süre önce beyin dokusunun yalıtım ile fesih ve uygun pH düzeltilmesi için izin vermek için hazırlanmalıdır.
Bu iletişim kuralı bir sınırlama diğer hücre tipleri microvessel müstahzarları (NVU) nörovasküler biriminin varlığı içerir. Ek olarak endotel hücreleri, NVU gliyal hücreler (yani, astrocytes, microglia), perisitlerden ve nöronlar 3,26,27de dahil olmak üzere çeşitli hücresel bileşenlerden oluşur. Yüzdeki--dan kemirgen beyin yalıtım genellikle vasküler endotel hücreleri ile zenginleştirme gösterir; Ancak, ifade nöronal marker proteinlerin yanı sıra ifade gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin), bir kurulan astrocyte işaretleyici de görülmektedir. Ayrıca, perisitlerden örnek hazırlıkları nedeniyle onların samimi dernek vasküler endotel ile mevcut. Şu anda, beyin yüzdeki deneysel hayvanlardan yalıtmak ve tüm perisitlerden, sinir hücreleri ve astrocytes ortadan kaldırmak neredeyse imkansız. Böylece örnekleri endotel hücrelerinde (yani, PECAM-1 her Santrifüjü adım takip geliştirilmiş ifade tarafından belirtildiği gibi) diğer hücre türleri (sınırlı varlığı ile zenginleştirilmiş ancak, bu iletişim kuralı birden çok Santrifüjü adımı ilerlemiştir Yani, ifade nöronal marker protein synaptophysin-1 her Santrifüjü adım takip azaltılmış gösterildiği gibi).
Genel olarak, bu yaklaşım sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için herhangi bir laboratuvarda BBB proteinler patofizyolojik veya farmakolojik koşullar altında okuyan bir ilgi ile uyarlanabilir. Örneğin, bu iletişim kuralı endogenously BBB2,18, ifade edilir uyuşturucu taşıma proteinlerinin incelenmesi için kullanılan microvessel örnekleri sağlar. Bu yaklaşım sağlamlık Oatp1a4 ayrık değişiklikleri yanıt farmakolojik bir çekim gücü, ışınlama işlevi ve yönetmelik BBB, değerlendirmek için titiz çalışmalar tasarımını bildirdi deneysel veriler olarak gözlenmesi sağlamıştır. Yukarıda açıklanan protokolü de sıkı kavşak proteinlerin ve adherens junction proteinler protein analizleri için bir çaba BBB fizyolojik koşullar altında anlamak ve BBB bütünlüğü yanıt olarak patofizyolojik değişiklikler çalışma için uygulanabilir ve farmakolojik stres. Açıkçası, bu protokol BBB alanında birden çok uygulama için uyarlanmış ve bu nedenle, protein analiz gerektiren BBB çalışmalar dahil edilebilir bir basit ama güçlü ve tekrarlanabilir yöntemi temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser PTR için Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01-NS084941) ve Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu (ADHS16-162406) gelen hibe tarafından desteklenmiştir. WA geçmiş bir ulusal kurumları sağlık eğitim Grant'ın (T32-HL007249) için önceden doktora bir randevudan destek aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery? AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
