Summary
여기, 쥐 뇌 microvessels의 격리에 대 한 고 막 샘플의 준비에 대 한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 허용 단백질와 개별 동물에서 항복 하는 풍부한 microvessel 생산의 명확한 장점이 있습니다. 샘플은 다음 뇌 microvascular 내 피에 강력한 단백질 분석에 사용할 수 있습니다.
Abstract
혈액-뇌 장벽 (BBB)은 다양 한 병 태 생리 및 약리 자극에 응답 하는 동적 장벽 조직. 이러한 자극 으로부터 발생 하는 이러한 변경 고 수 있습니다 크게 뇌에 약물 전달 조절, 확장 하 여, 질병의 원인이 상당한 도전 중앙 신경 치료에서 (CNS). Pharmacotherapy에 영향을 주는 많은 BBB 변화를는 지역화 된 내 피 세포의 수준에서 단백질을 포함 한다. 실제로, 건강 및 질병에 BBB 생리학에 이러한 지식은이 막 단백질의 연구에 상당한 관심을 촉발 했다. 기초 과학 연구의 관점에서이 실험 동물에서 수확 하는 뇌 조직에서 microvessels의 격리에 대 한 간단 하지만 강력 하 고 재현할 수 방법에 대 한 요구를 의미 합니다. 갓 격리 된 microvessels에서 막 샘플을 준비 하기 위하여 샘플 준비 내 피 세포에 농축 되어야 하지만 다른 세포 유형 (즉, 이다, microglia, 신경, 혈관 단위의 존재 제한 필수적 이다 pericytes)입니다. 추가 혜택 개별 동물에서 실험적인 인구에서 단백질 식의 진정한 변화를 캡처하기 위해 샘플을 준비 하는 기능입니다. 이 원고에서 쥐 뇌 microvessels의 고립과 막 샘플의 준비에 대 한 활용 방법에 관한 세부 정보는 제공 됩니다. Microvessel 농축, 파생, 샘플에서 dextran 샘플 버퍼에 포함 된 4 개의 원심 분리 단계를 사용 하 여 이루어집니다. 이 프로토콜은 그들의 자신의 특정 응용 프로그램에 대 한 다른 실험실에 의해 쉽게 적응 수 있습니다. 이 프로토콜에서 생성 된 샘플 크게 생리 적, 병 태 생리, 약리 자극 응답 BBB의 이해를 원조 할 수 있는 단백질 분석 실험에서 강력한 실험 데이터를 얻을를 보였다.
Introduction
혈액-뇌 장벽 (BBB) 중앙 신경 시스템 (CNS)와 조직의 순환 간의 인터페이스에 존재 하 고 뇌 항상성 유지에 중요 한 역할. 구체적으로, 정확 하 게 제어 용 질 농도에 효율적으로 뇌 조직 CNS1의 상당한 변화 요구를 충족 하는 데 필요한는 그 영양분을 공급 하 고 뇌 세포 외 액에는 BBB 기능. 이러한 역할 의미 microvascular 내 피 세포의 수준에 있는 BBB 잠재적으로 유해한 xenobiotics 수 없습니다 하면서 뇌 실질에 액세스 하는 일부 물질을 사용할 수 있는 개별 메커니즘을가지고 있어야 합니다. 축적. 사실, microvascular 내 피 세포 fenestrated 하지 않습니다 하 고 비 선택적인 침투성2의 부족을 보장 제한 pinocytosis 전시. 또한, microvessel 내 피 세포 꽉 접점과 외화 접합 단백질 형태로 실제 인접 한 내 피 세포 사이의 "봉인"과 뇌에 혈액을 매개로 물질의 paracellular 확산을 크게 제한 하는 표현 실질입니다. 사실, 내 인 성 및 외 인 성 물질의 선택적인 침투성의 통풍 관 및 경과 전송기3기능 식이 필요합니다. 전반적으로, 단단한 접속점, 외화 교차점, 및 전송기는 BBB의 독특한 장벽 속성을 유지 하기 위해 콘서트에서 작동.
BBB는 생리 적, 병 태 생리, 약리 자극에 응답 하는 동적 장벽이 다. 예를 들어 산소/reoxygenation 스트레스는 혈관 마커 등을 증가 paracellular 침투성와 관련 중요 한 꽉 접합 단백질 (즉, occludin, zonulae occluden-1 (조로-1))의 식을 조절 하 보였다 자당4,,56으로. 외상 성 뇌 부상7 설정 주변 염증 성 통증8,9에서 BBB에서 비슷한 관찰 되었습니다. 이 같은 질병 또한 BBB10,,1112,13,14에서 전송 메커니즘을 조절 수 있습니다. 실제로, 저 산소 증/reoxygenation 부상 향상 polypeptide 1a4 수송 유기 음이온의 기능 식 (Oatp1a4)에서 BBB,으로 이어질 수 있는 특정 Oatp 전송 기판의 혈액-뇌 전송에 상당한 증가 같은 taurocholate 및 틴이13. BBB 속성 pharmacotherapy 자체, 뇌에 약물 효과에 모두 깊은 변화 및 약물-약물 상호 작용에 대 한 기초를 형성 수 있습니다 메커니즘에 의해 변경할 수 있습니다. 예를 들어 뇌 microvascular 내 피 세포에 아 세트 아미노 펜 대상 핵 수용 체 신호 메커니즘 기능 표현의 중요 한 경과 전송 P-당단백질 (P-gp), 증가 하 고 수정 하는 시간에 따른 진통 모 르 핀에 의해 수 여 된 opioid 진통제 약물 설립된 P-gp 수송 기판15. BBB 변화, 질병 또는 약물에 의해 유도 될 수 있다, 그의 철저 한 이해는 또한 식별 및 이러한 수정을 제어 하는 특정 규제 메커니즘의 필요 합니다. 사실, 이산 신호 경로 꽉 접합 단백질16,17 및 전송기15, 의 분자 표현 제어 하는 두뇌 microvascular 내 피 세포에서 발견 되었습니다 18,19. 함께 찍은, 이러한 관측 복잡 한 분자 경로 BBB 꽉 접합의 규제와 건강 및 질병에 전송기에 관련 된 나타냅니다.
BBB의 연구에 중요 한 도전 막 샘플의 후속 준비 및 실험 동물에서 파생 된 뇌 조직에서 microvessels의 격리에 대 한 간단 하 고 효과적인 방법의 절대적인 요구 사항입니다. 이 샘플은 모두 뇌 microvascular 내 피 세포에 농축 하 고 다른 세포 유형의 존재에 제한 준비 되어야 한다. 지난 몇 년 동안 설치류 두뇌에서 microvasculature의 격리에 대 한 여러 방법론 과학 문학13,20,,2122에 보고 되었습니다. 이 문서에서는 간단 하 고, 강력한, 및 쥐 두뇌에서 microvessels의 격리 및 단백질 발현의 분석에 사용할 수 있는 내 피 막 농축 샘플의 준비에 대 한 재현 방법. 이 microvessel 격리 프로토콜의 한 장점은 개별 실험 동물에서 충분 한 단백질 수율과 높은 품질의 샘플 준비를 얻을 수 있습니다. 단백질 표정에 간 동물 다양성의 고려 수 있습니다. BBB에서 단백질 변경의 진정한 크기의 과대평가 (또는-추정) 수 이제 피할 수 있기 때문에이 프로토콜에는 이러한 사전은 크게 BBB 연구의 견고성을 향상. 또한, 여러 원심 분리 단계 dextran 포함 뉴런 등 원치 않는 세포 성분의 제거를 촉진 하는 동안 실험 샘플에서 microvessels의 향상 된 농축 수 있습니다.
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Protocol
아래에 설명 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다와 국립 보건원 (NIH) 및 동물 연구: Vivo에서 실험 (도착) 지침을 보고. 프로토콜에 대 한 절차 흐름은 그림 1에 묘사 된다.
1입니다. 설정 절차에 대 한
- 뇌 microvessel 버퍼 (BMB)를 준비 합니다. 54.66 g D-마 니 톨, 1.90 g EGTA, 깨끗 한 비 커에 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (즉, 트리 스) 자료를 재 시작 합니다. 이온된 수의 1.0 L를 추가 합니다. 자력 교 반기를 사용 하 여 BMB 버퍼의 구성 요소를 믹스. 일단 솔루션을 철저 하 게 혼합 되어, pH 7.4 1.0 M HCl을 사용 하 여를 조정 합니다.
- 동물을 마비 전에 26 %dextran (MW 75000) 솔루션 (w/v)을 준비 합니다. 다음 단계에 설명 된 대로 dextran 솔루션을 준비 합니다.
참고: 그것은 비판적으로 dextran 약 1.5-2 h 수성 버퍼에 분해를 걸릴 수 있기 때문에 미리이 솔루션을 준비 하는 것이 중요.- 깨끗 한 비 커에 가루 dextran (26 g 버퍼 100 mL 당) 밖으로 무게.
- BMB의 적절 한 양을 밖으로 측정 하 고, 깨끗 한 별도 비 커에 분배.
- 천천히 BMB 붓고 가루 dextran을 포함 하는 비 커. 수동으로 BMB 유리 저 어 막대를 사용 하 여의 붓는 동안 가루 dextran을 믹스.
- 사용 하 여 즉시 사전 1.0 M HCl와 7.4에 pH를 조정 합니다.
참고: 12 개별 Sprague-Dawley 쥐에서 뇌 microvessels의 일반적인 격리 (남성 또는 여성; 나이의 3 개월, 200-250 g) dextran 솔루션 (즉, 52 g dextran BMB의 200 ml에서) 200 mL를 필요 합니다.
2. Sprague-Dawley 쥐에서 뇌 조직 추출
- 케 타 민 (50 mg/kg, 2.5 mL/kg i.p.) 및 xylazine를 사용 하 여 Sprague-Dawley 쥐 anesthetize 다음과 같은 원하는 실험 치료 (10mg/mL; 2.5 mL/kg 나, p.). 마 취 제와 최종 농도 20 mg/mL 및 4.0 mg/mL의 0.9% 염 분에서 xylazine을 각각 희석. 잘린 IACUC 지침에 따라 날카롭게 단두대를 사용 하 여 동물을 안락사. 동일한 절차를 사용 하 여 둘 다 남성과 여성 Sprague-Dawley 쥐를 위해.
- 수술가 위를 사용 하 여 단일 가로 컷 하 여 쥐 두개골에서 피부를 resect.
- Rongeurs를 사용 하 여 신중 하 게 두개골 플레이트를 제거 하 고 뇌를 노출.
- 주걱을 사용 하 여 뇌를 제거 합니다. 뇌를 분리 고 격리 된 뇌 조직 50 mL 원뿔 튜브 BMB의 5 mL를 포함 합니다. 프로 테아 제 억제 물 사용 전에 즉시 BMB 버퍼의 1.0 mL 당 칵테일의 1.0 μ를 추가 합니다.
3. 두뇌 처리
- 50 mL 원뿔 튜브의 뇌 조직 깨끗 한 페 트리 접시에 전송.
- 집게를 사용 하 여 부드럽게 롤 두뇌에 대뇌 피 질에 느슨하게 준수 외부 meninges 제거 하 12.5 cm 직경 필터 종이. 부드럽게 필터 종이 대 한 뇌 조직의 누르고 다시 조직 롤. 이 단계 동안 자주 필터 종이 켜십시오.
- 집게를 사용 하 여 대뇌 반구에서 맥락 막 신경 총을 구분 합니다.
참고: 맥락 막 신경 총 대뇌 뇌 실의 표면에 지역화 된 맑은 액체로 조직으로 나타납니다. - 부드럽게 뇌 조직의 평평 하 고 나머지 meninges과 후 각 전구 집게를 사용 하 여 제거 합니다.
- 장소 냉장된 유리 박격포로 대뇌 피 질의 뇌 조직. 박격포를 BMB 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 5.0 mL를 추가 합니다.
- 오버 헤드 전원 균질 화기를 사용 하 여, 3700 rpm에 선 위아래로 15를 사용 하 여 뇌 조직의 균질. 균질 10 mL 박격포와 유 봉 조직 분쇄기를 사용 하 여 수행 합니다. 각 개별 샘플의 균질, 사이 유 봉 70% 에탄올을 사용 하 여 청소.
참고: 균질 선 속도 관점에서 일관 되 고 크기. - 레이블이 지정 된 원심 분리기 튜브에는 homogenate를 부 어.
4. 원심 분리 단계
- 뇌 homogenate 포함 된 각 레이블이 원심 분리기 튜브를 26 %dextran 솔루션 8.0 mL를 추가 합니다.
- 튜브를 두 번 반전 그리고 철저 하 게 소용돌이 샘플. 뇌 26 %dextran 솔루션 homogenate 솔루션의 철저 하 게 혼합 되도록 여러 각도 사용 하 여 각 샘플의 vortexing를 실시 합니다.
- 4 ° c.에 15 분 동안 5000 x g 에서 원심 분리기 샘플
참고: 일부 분석에 대 한 그것은 뇌 microvessels 뇌 실질과 비교 하는 데 유용입니다. 뇌 실질에 단백질 식의 평가 해야 필요한이 원심 분리 단계 (즉, 뇌 parenchymal 분수)에서 상쾌한 수집 고 나중에 사용-80 ° C에 저장. - 진공 흡 인기를 사용 하 여 상쾌한을 제거 하 고 유리 파스퇴르 피 펫.
참고: 주의 펠 렛을 방해 하지로 이동 해야 합니다. 그렇지 않으면, 뇌 microvessels 수집의 수량이 줄어들 것입니다는이 절차에서 단백질 수확량 크게 줄어. - BMB 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (즉, 1.0 μ 프로 테아 제 억제 물 칵테일 BMB 버퍼의 1.0 mL 당)의 5.0 mL에 펠 릿을 resuspend. 철저 하 게 혼합 되도록 펠 릿 소용돌이입니다.
- 각 원심 분리기 튜브와 소용돌이 4.1-4.2이이 프로토콜의 단계에서 설명한 대로 26 %dextran 8.0 mL를 추가 합니다.
- 4 ° c.에 15 분 동안 5000 x g 에서 원심 분리기 샘플
- 진공 플라스 크, 유리 피 펫을 사용 하, 상쾌한 발음 하 고 뇌 microvessel를 포함 하는 펠 릿 방해 하지 확인 하십시오.
참고: 초과 소재 튜브 벽에 고착 했다 microvessels를 포함 하지 않는 해야 될 신중 하 게 청소 하 고 제거. - 두 번 추가는 4.8-4.5 단계를 반복 합니다.
- 일단 4 dextran 원심 분리 단계 완료 되었습니다, 그리고 각 펠 릿 및 resuspend 샘플을 소용돌이 BMB의 5.0 mL를 추가 합니다.
참고: 다음 단계 4.10의 완료, 전체 microvessels 단백질 지 방화의 분석에 대 한 수집할 수 있습니다. 이 여 50 μ 다시 중단된 microvessel 펠 릿의 aliquot 유리 현미경 슬라이드에 번짐 수행할 수 있습니다. Microvessels는 뒤에 얼음 처럼 차가운 에탄올에 고정 추가 10 분 슬라이드 이미징 연구에 필요한 때까지 4 ° C에 저장 된 다음 수 열 블록에 10 분 동안 95 ° C에서 열 고정.
5. Ultracentrifugation 총 뇌 Microvascular 막의 샘플을 준비 하
- 냉장된 유리 균질 화기에 샘플을 전송.
- 오버 헤드 전원 균질 화기를 사용 하 여 3000 rpm에서 선 위아래로 8-10을 사용 하 여 뇌 조직의 균질. 균질 10 mL 박격포와 유 봉 조직 분쇄기를 사용 하 여 수행 됩니다. 유 봉 각 개별 샘플의 균질에 따라 70% 에탄올을 사용 하 여 청소.
- Ultracentrifuge 튜브를 청소 하는 샘플을 전송 합니다. 번호와 각 개별 튜브 무게. 균형 그리고 ultracentrifuge로 터에 로드 하기 전에 튜브 쌍.
참고: 모든 무게와 ultracentrifuge 튜브의 해야 합니다 실시는 모자에 튜브 무게의 정확한 측정을 보장 하기 위해. - 4 ° c.에서 1 h 150000 x g 에서 원심 분리기 샘플
- 상쾌한 발음 진공 플라스 크, 유리 피 펫 파스퇴르를 사용 하 여 모 세관 멤브레인 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 사용 하 여.
- 펠 릿 크기에 따라 달라 집니다, 1:1 (v/v) 비율로 이온된 수와 BMB의 구성 된 저장소 버퍼의 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 일반적으로 펠 릿 저장 버퍼의 400-500 μ에 resuspended 있다. 프로 테아 제 억제 물 칵테일 저장소 버퍼의 1.0 mL 당 1.0 μ의 비율에서 저장소 버퍼에 추가 합니다.
- 펠 릿 저장 버퍼에 resuspend를 소용돌이 샘플.
- Using 유리 파스퇴르 피 펫, 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 관에 모 세관 막 샘플을 전송 합니다.
- 바늘을 통해 패스 샘플 샘플은 철저 하 게 혼합 하 고 아무 셀룰러 집계 존재 5 x 주사기.
- -80 ° c까지 분석에 필요한 샘플을 저장 합니다.
참고: 각 microvessel 막 샘플의 단백질 콘텐츠 브래드포드 메서드를 사용 하 여 측정 됩니다.
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Representative Results
쥐 뇌 microvessels의 격리 및 microvessel 막 샘플의 준비에 대 한 실험 흐름은 그림 1에 표시 됩니다. 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 쥐 두뇌에서 그대로 microvessels의 성공적인 절연 설명 된다 (그림 2A). 이러한 혈관 원심 dextran와 ultracentrifugation 막 샘플 (즉, 다음 준공 단계 4.10) 준비를 개시 직전의 완료 후 얻은 했다. 이 이미지는 microvessel Oatp1a4, 두뇌 microvascular 내 피 세포2,11,13의 원형질 막에 잘 표현 될 표시 되었습니다 전송에 대 한 항 체를 사용 하 여 스테인드입니다. 18. 서쪽 오 점 분석 (그림 2B), 막에서 microvessels 여성 Sprague-Dawley 쥐에서 수확 준비 표시 했다를 사용 하 여 되도록 농축 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자-1 (PECAM-1, 일컬어 CD31)에 대 한 마커 단백질 뇌 microvasculature입니다. PECAM-1는 억제 공동 수용 체 T 세포와 B 세포 신호에 관련 된 높은 혈관 내 피 세포의 원형질 막에 표현 되는. 이 프로토콜의 최적화 하는 동안 PECAM 농축 막 샘플 2와 4 dextran 원심 분리 단계를 사용 하 여 준비에서 관찰 되었다. 그림 2B에서 같이, 이러한 다른 원심 분리 단계;를 사용 하 여 준비 하는 샘플 사이의 PECAM 식에 차이가 없었다 그러나, 4 개의 dextran 스핀 결과 내 피 수송 단백질의 개선된 식에서 나타내는 샘플 우라늄 농축 향상 된 microvessel. 또한, 4 개의 dextrans 사용 하 여 synaptophysin18등 신경 마커 단백질의 감소 식에 표시 된 대로 원치 않는 세포 성분의 향상 된 제거를 회전 합니다. 따라서, 뇌 microvessel 막에 대 한 모든 후속 준비 4 dextran 원심 분리 단계를 사용 하 여 수행 했다. 우리의 서쪽 오 점 실험에서 microtubule 구성 단백질 tubulin 로드 제어로 사용 되었다. Bradford 단백질 분석 실험에 의해 결정 된 대로 막 준비는 일반적으로 단백질 농도가 5.0 mg/mL 및 10.0 mg/mL 사이 항복. 대표적인 단백질 정량화 결과 표 1에 묘사 된다. 이러한 단백질 값 (그림 3) 표준으로 소 혈 청 알 부 민 (BSA; 2.0 mg/mL)을 사용 하 여 생성 된 표준 곡선에 따라을 결정 했다. 단백질 견본 10 배 희석 했다 Bradford 분석 실험에.
단백질 정량화, 다음 서쪽 오 점 분석, 점 오 점, 또는 공동-immunoprecipitation 같은 단백질 분석에 대 한 생 화 학적 방법론에 대 한 microvessel 막 샘플을 활용할 수 있습니다. 그림 4A 묘사는 BBB 전송 단백질 포도 당 운송업 자-1 (공급 과잉-1) 표 1 에서 샘플 분석 되었다 대표 서쪽 오 점. 적절 한 분자량에서 단일 밴드를 취소 (즉, 예상 54 kDa)이 높은 표현 BBB에 대 한 단백질 각 막 샘플에서 발견 되었습니다. 이 서쪽 오 점에 각 개별 레인 microvessel 막 샘플을 하나의 실험 동물에서 준비를 나타냅니다. 각 차선에 동일한 단백질 나트륨-칼륨 ATPase를 사용 하 여 결정 했다 (즉, 없음+/K+ ATPase; 예측된 분자량 = 113 kDa) 로드 컨트롤. 그림 4B에서 같이, BBB에 Glut-1의 높은 식 그들의 여성 대조 물에 비교 하 여 남성 쥐에서 관찰 되었다. 나+의 표현에 차이가 /K+ ATPase 남성과 여성 동물 사이 관찰 했다. 이 densitometric 분석에 대 한 밴드 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 quantitated 했다.
그림 1: 쥐 뇌 microvessels 고 막 샘플을 준비 하는 절차와 프로토콜의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 그대로 microvessel와 혈관 내 피 세포 마커 단백질의 표현을 보여주는 대표적인 데이터. A: 면역 형광 염색 법 Oatp1a4, 고립이 프로토콜에서 설명 된 대로 그대로 뇌 microvessel에서 BBB에 잘 표현 될 표시 되었습니다 전송의 지역화를 보였다. Oatp1a4 지역화 1:10 희석에 Oatp1a4에 대 한 특정 토끼 polyclonal 항 체를 사용 하 여 검색 되었습니다. 이차 항 체 형광 활용된-토끼 IgG 1:300의 희석에 사용 된 했다. 눈금 막대 = 7.5 μ m. B: 서쪽 오 점 분석 1: 100 희석에 마우스 단일 클론 항 체를 사용 하 여 검색을 특정 내 피 세포 마커 단백질 PECAM-1의 농축을 보여주는 microvessel 샘플의 순도 시연 했다. 이차 항 체는 1: 50000 희석에는 반대로 마우스 IgG 이었다. BH 뇌 homogenate, MV = = 원유 microvessel 분수, MVM = 뇌 microvessel 막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Bradford 단백질 분석 실험에 대 한 대표적인 표준 곡선. 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 표준으로 사용 되 고 다음 농도를 묽 게 했다: 0, 0.125, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5, 및 2.0 mg/mL. 흡 광도 측정 = 595 nm. 각 데이터 요소는 BSA 농도 당 3 흡 광도 읽기의 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 고립 된 쥐 두뇌 Microvessels에서 막 샘플 준비에서 Glut-1 식에서 성 차이 보여주는 대표 서쪽 오 점. A: 서쪽 오 점 분석에서는 남성과 여성의 Sprague-Dawley 쥐에서 분리 된 microvessel에서 준비 하는 막 샘플 Glut-1의 표현. 공급 과잉-1에서 1: 500 희석 토끼 단일 클론 항 체를 사용 하 여 발견 되었다. 이차 항 체 단일 클로 널 항 토끼 IgG 1:40,000 희석에 했다. 나=/K+ ATPase, 원형질 막 마커 및 로드 제어 1: 40000 희석에 polyclonal 항 토끼 IgG를 사용 하 여 발견 되었다. B: 남성과 여성의 Sprague-Dawley 쥐에서 분리 막 샘플에 Glut-1 식의 densitometric 분석. 결과 치료 그룹 당 6 실험 동물에서 SEM을 의미 표현 됩니다. 별표는 컨트롤에서 통계적으로 중요 한 데이터 포인트를 나타냅니다. P < 0.05의 값은 통계적으로 중요 한 것으로 간주 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 동물 | 평균 흡 광도 | 조정 된 흡 광도 | 계산 된 농도 | 실제 농도 |
| (Λ = 595 nm) | (mg/ml) | (mg/ml) | ||
| 남성 1 | 0.7967 | 0.3859 | 0.768 | 7.68 |
| 남자 2 | 0.7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7.42 |
| 남자 3 | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8.17 |
| 남성 4 | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7.72 |
| 남성 5 | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | 7.63 |
| 남성 6 | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6.08 |
| 여성 1 | 0.7114 | 0.3006 | 0.578 | 5.78 |
| 여성 2 | 0.7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7.74 |
| 여성 3 | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8.2 |
| 여성 4 | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6.7 |
| 여성 5 | 0.8008 | 0.39 | 0.7773 | 7.77 |
| 여성 6 | 0.7975 | 0.3867 | 0.77 | 7.7 |
표 1: 남성과 여성의 Sprague-Dawley 쥐에서 파생 된 대표 단백질 농도 뇌 Microvessel 준비에서. 조정 된 흡 광도 값은 배경 l에서 흡 광도 빼서 결정 됩니다 = 595 nm 평균 흡 광도에서 각 실험 동물에 대 한 값. 이 분석 결과에서 배경 흡 광도 0.4108 결정 했다.
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Discussion
이 문서에서는 갓 쥐 뇌 조직에서 분리 된 microvessels에서 막 단백질 샘플 준비의 간단 하 고 효과적인 방법을 설명 합니다. 격리 된 microvasculature에서 쥐 뇌 microvessels의 격리 및 막 준비의 세대에 대 한 몇 가지 방법은 문학13,20,,2122 에 보고 되었습니다. , 24.이 이렇게 하나의 실험 동물에서 우수한 단백질 수확량을 가진 막 샘플의 준비를 수 있도록 최적화 되었습니다 비록 위에서 설명한 microvessel 격리 프로토콜 원칙적으로 비슷합니다. 이 사전 탈락 했다 필요 풀 microvessels을 3 개 이상 Sprague-Dawley 쥐에서 만족 스러운 단백질 농축 단백질 분석에 대 한 다양 한 접근에 사용 하기 위해 샘플을 얻기 위하여. 이러한 접근을 포함, 하지만 서쪽 오 점 분석, 점 오 점, 그리고 공동-immunoprecipitation에 국한 되지 않습니다. 풀링 microvessels 크게 한 샘플을 생성 하는 여러 실험 동물에서의 연습 남북 그룹 다양성 감소 주목 한다. 이 정도로 microvessel 풀링 단백질 식 실험 동물의 인구에서 관찰에 진정한 변화를 대표 하지 않는다 감소 확산과 데이터에 발생할 수 있습니다. 샘플은 단일 실험 동물에서 준비 될 수 있다, 이후 연구 인구의 진정한 다양성 캡처, 실험 데이터에서 병 태 생리 또는 약리학 과정 즉 더 많은 대표를 얻을 수 있습니다. 시험입니다. 추가적인 혜택은 microvessel 막 샘플 실험 동물의 감소 된 수를 사용 하 여 준비 될 수 있다.
아마도이 프로토콜의 실행에서 가장 중요 한 고려는 원심 분리 단계를 포함 한다. 실제로, 원심 분리기는 그들의 나이, 제조 업체, 또는 전반적인 조건 때문에 실험실 및 무결성 사이 달라질 수 있습니다. 이 스핀 스핀에서 중요 한 변화는 실제 g 수준 (또는 rpm 수준)에 발생할 수 있습니다. 샘플 무결성에이 변이의 역할은 같은 시간에 동일한로 터에서 함께 단일 비교 분석에서 모든 샘플의 원심 분리 하 여 최소화할 수 있습니다. 예를 들어 경우는 터 샘플 튜브만 12 사용 가능한 슬롯이, 후 분리와 개별 실험에서 microvessel 샘플의 준비 제한 됩니다 12에. 이 고려 하면 준비 된 샘플 비교 품질의는 실험 그룹 사이의 평균 단백질 표정에 어떤 변화 치료 조건 자체에 할당할 수 있습니다.
추가 고려 뇌 microvessels 뇌 parenchymal 조직 차등 원심 분리를 통해 분리에 필요한 26 %dextran 솔루션의 준비를 포함 한다. Dextran의 α-1, 6-연결 단위 보급으로 포도 당 중합체 이며 일반적으로 선형 구조25를 소유한 다. 그것은 또한 높은 물-바인딩 용량을 하고있다. 예를 들어 1 g dextran 75의 (즉,이 프로토콜에 사용 되는 75000 다의 평균 분자량으로 dextran) 약 20-25 mL의 물 유지 합니다. Dextran의이 속성은 수성 버퍼에 분말을 용 해에 깊은 도전을 발생할 수 있습니다. 40 ° c 최대 온도 dextran 솔루션을가 열 하 여 수성 가용성을 향상 시킬 수 있습니다. 난방, 시 폴리머 적게 함으로써 솔루션에서 덜 확장 된 형태 (즉, 낮은 정도의 물 보존)를 채택 하는 dextran을 일으키는 물 분자와 상호 작용 합니다. 높은 온도에 열 하면 뜨 dextran 폴리머 그리고, 그러므로, 그것은 효과적일 것입니다 되지 분리 시 약으로. 또한, dextran 솔루션의 pH 7.4 사용 직전에 조정 될 필수적 이다. 26 %dextran 솔루션은 중요 한 pH 변화, 이상도 1-2 시간 준비를 경험할 수 있습니다. 이러한 고려 사항으로 인해 26 %dextran 솔루션 해산 및 산도의 적절 한 조정 가능 하도록 실험 하지만 뇌 조직의 격리 전에 충분 한 시간으로 하루에 준비 한다.
이 프로토콜의 제한 다른 종류의 세포 microvessel 준비에 혈관 단위 (NVU)의 존재를 포함 한다. 내 피 세포, 이외는 NVU (즉, 이다, microglia) glial 세포, 신경 3,,2627, pericytes, 등 다양 한 세포 구성 성분의 구성 됩니다. 설치류 두뇌에서 microvessels의 격리는 일반적으로 혈관 내 피 세포; 농축을 보여줍니다. 그러나, 신경 마커 단백질의 표현 뿐만 아니라 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 설립된 사이토 마커의 표현 또한 관찰 된다. 또한, pericytes은 혈관 내 피와 함께 그들의 친밀 한 협회로 인해 샘플 준비에 존재 한다. 현재, 실험 동물에서 뇌 microvessels를 분리 하 고 모든 pericytes, 신경, 및 이다 사실상 불가능 하다 아니다. 그러나,이 프로토콜은 고급 되었습니다 여러 원심 분리 단계를 통해 샘플 풍성 하 게 내 피 세포에서 (즉, 향상 된 식 PECAM-1 각 원심 분리 단계를 다음으로 표시)으로 다른 세포 유형 (의 한정 된 존재는 즉,로 표시 하 여 신경 마커 단백질 synaptophysin-1 각 원심 분리 단계 다음의 표현 감소).
전반적으로,이 이렇게 쥐 뇌 microvessels의 격리와 막 샘플의 준비에 대 한 병 태 생리 또는 약리학 적인 조건 하에서 BBB 단백질 공부에 관심을 가진 모든 실험실에 적응 될 수 있다. 예를 들어이 프로토콜 BBB2,18endogenously 표현 되는 마약 수송 단백질의 연구에 활용 될 수 있는 microvessel 샘플을 제공 합니다. 이 접근의 견고성은 약리 자극, 실험 데이터는 정보 전송 기능 및 BBB에서 규칙을 평가 하기 위해 엄격한 연구의 디자인에 대 한 응답에서 Oatp1a4에서 개별 변화의 관찰을 활성화 하 고 있다. 있으 나 위에서 설명한 프로토콜 생리 적 조건 하에서 BBB를 이해 하 고 병 태 생리에 대 한 응답 BBB 무결성에 변화를 공부 하는 노력에 꽉 접합 단백질 및 외화 접합 단백질의 단백질 분석에도 적용할 수 있습니다. 그리고 약리학 스트레스입니다. 분명히,이 프로토콜 BBB 필드에 여러 응용 프로그램에 대 한 적응 시킬 수 있다 그리고, 그러므로, 단백질 분석을 필요로 하는 BBB 연구에 통합 될 수 있는 아직 강력한 간단 하 고 재현성 메서드를 나타냅니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 PTR에 건강의 국가 학회 (R01-NS084941)와 애리조나 생물 의학 연구 위원회 (ADHS16-162406)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. WA는 과거의 국가 연구소의 건강 교육 부여 (T32-HL007249)을 미리 박사 약속에서 지원 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
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