Qui, presentiamo un protocollo per una purificazione efficiente unico passaggio dell'essere umano senza tag attivo dieci-undici traslocazione-2 (TET2) 5-metilcitosina diossigenasi usando la cromatografia a scambio ionico e sua analisi utilizzando una massa liquida di cromatografia-tandem spettrometria (LC-MS/MS)-approccio basato.
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Articolo metodologico
Purificazione efficiente e sviluppo di analisi LC-MS/MS-based per dieci-undici traslocazione-2 5-metilcitosina diossigenasi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La regolazione della trascrizione epigenetica mediata da 5-metilcitosina (5mC) ha svolto un ruolo critico nello sviluppo eucariotico. Demetilazione di questi segni epigenetici avviene mediante ossidazione sequenza di dieci-undici traslocazione diossigenasi (TET1-3), seguita dalla riparazione bassa di asportazione glicosilasi-dipendente timina-DNA. Inattivazione del gene TET2 a causa di mutazioni genetiche o da altri meccanismi epigenetici è associato con una prognosi difficile in pazienti con diversi tipi di cancro, specialmente malignità ematopoietiche. Qui, descriviamo una purificazione efficiente singolo passaggio di enzimaticamente attivo dioxygenase di TET2 umana senza tag mediante cromatografia a scambio cationico. Forniamo inoltre un approccio liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS) che può separare e quantificare le quattro basi di DNA normale (A, T, G e C), così come le quattro basi modificate citosina (5-metil, 5-idrossimetil, 5-formil e 5-carbossilico). Questa analisi può essere usata per valutare l'attività del wild type e mutanti TET2 diossigenasi.
Introduzione
La posizione di C5 della citosina basi all'interno di dinucleotidi CpG è il sito di metilazione predominante (5mCpG) nel genoma di mammiferi1. Inoltre, una serie di studi recenti hanno scoperto vasta metilazione della citosina C5 (5mC) in siti non-CpG (5mCpH, dove H = A, T, o C)2,3. modifica di 5mc serve come un silenziatore trascrizionale retrotrasposoni endogeno e gene promotori3,4,5. La metilazione del DNA a 5mC inoltre svolge ruoli importanti nell'inattivazione del cromosoma X, gene imprint....
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Protocollo
1. clonazione e purificazione di TET2 umana senza tag diossigenasi
- Clone umano TET2 diossigenasi (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) nel vettore pDEST14 destinazione usando la tecnica di ricombinazione site-specific come descritto in precedenza22.
Nota: Gli studi precedenti hanno dimostrato che il dominio C-terminale TET2 diossigenasi (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) è il minimo cataliticamente attiva dominio21,23. Per poter esprimere senza tag TET2 diossigenasi dominio utilizzando il vettore pDONR221, sequenze di Shine Dalgarno e Kozak sono state incorporate nell'iniettore in avanti ....
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Risultati
Modifica dinamica di 5mC nel DNA di diossigenasi TET-famiglia svolge i ruoli importanti nel regolamento trascrizionale epigenetica. Dioxygenase di TET2 è frequentemente mutato in varie malignità ematopoietiche12. Per studiare il ruolo dell'enzima TET2 nello sviluppo normale e nella malattia, abbiamo clonato il suo dominio cataliticamente attivo minimo senza qualsiasi tag di affinità nel vettore pDEST1422. Il dioxygenase di TET2 senza tag è s.......
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Discussione
Mutazioni nel gene TET2 sono alcuni dei cambiamenti genetici più frequentemente rilevati in pazienti con malignità ematopoietiche diversificata. Ad oggi centinaia di diverse mutazioni di TET2, sono sciocchezze, frame-shift e mutazioni di senso sbagliato, sono state identificate in pazienti12. Pazienti con mutazioni di TET2 mostrano bassi livelli di genomica 5hmC nel midollo osseo rispetto a quelli con wt-TET214. TET2 mutante knock-in esperimenti hanno rica.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nessun interessi finanziari di dichiarare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata dal dipartimento della difesa sotto forma di un'Idea Award (W81XWH-13-1-0174), Anemia aplastica & MDS Foundation Grant e grant UMRB a M.M. Authors ringraziare Mohit Jaiswal e Subhradeep Bhar per clonazione iniziale di TET2 nel vettore pDEST14.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Solfato di ferro (II) eptaidrato | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Acido chetoglutarico (acido 2-ossoglutarico) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| Acido L-ascorbico | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Acido etilendiamminetraacetico sale disodico diidrato | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Acetato di ammonio | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acqua di grado HPLC | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo pulito e concentratore | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nucleasi | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Fosfatasi alcalina intestinale di vitello) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)acido etansolfonico monoidrato] | Carbosynth | FM37015 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientifico | 7647-14-5 | |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deossi-5-metilcitidina | TCI | D3610 | |
| 2'-Deossi-5-idrossimetialcitidina | TCI | D4220 | |
| 2'-Deossicitidina-5-acido carbossilico, sale di sodio | Berry & Amp; Associates | PY 7593 | |
| 5-Formil-2'-deossicitidina | Bacca & Associati | PY 7589 | |
| 2'-Deossicitidina | Bacca & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deossiadenosina | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deossiguanosina | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deossitimidina | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Tecnologia gateway | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuga | Beckman Coulter | 392932 | |
| Smembratore Sonico 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| Ä Sistema KTA FPLC | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| Sistema di liofilizzazione FreeZone 4.5 Colonne di purificazione | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 colonna | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Spettrometro di massa Q-Trap | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| Colonna FPLC XK16/20 | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
Riferimenti
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341
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Ristampe e permessi
