Summary
यहां, हम सक्रिय untaggeded मानव दस ग्यारह translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase आयन का उपयोग-विनिमय क्रोमैटोग्राफी और उसके परख एक तरल क्रोमैटोग्राफी-मिलकर जन का उपयोग कर के एक कुशल एक कदम शुद्धिकरण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा-ms/
Abstract
epigenetic प्रतिलेखन विनियमन 5 द्वारा मध्यस्थता-methylcytosine (5mC) eukaryotic विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । इन epigenetic के निशानों में से दस-ग्यारह translocation dioxygenases (TET1-3) द्वारा अनुक्रमिक ऑक्सीकरण द्वारा पूरा किया जाता है, thymine-डीएनए glycosylase-निर्भर आधार उत्पाद की मरंमत के बाद । आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के कारण या अंय epigenetic तंत्र द्वारा TET2 जीन की निष्क्रियता विविध कैंसर, विशेष रूप से टेम द्रोह के साथ रोगियों में एक गरीब पूर्वानुमान के साथ जुड़ा हुआ है । यहां, हम enzymatically सक्रिय untaggeded मानव TET2 dioxygenase कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर के एक कुशल एकल कदम शोधन का वर्णन । हम आगे एक तरल क्रोमैटोग्राफी-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा-ms/एमएस) दृष्टिकोण है कि अलग कर सकते है और चार सामांय डीएनए कुर्सियां (ए, मात्रा प्रदान टी, जी, और सी), साथ ही चार संशोधित cytosine कुर्सियां (5-मिथाइल, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, और 5-carboxyl) । इस परख के लिए जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती TET2 dioxygenases की गतिविधि का मूल्यांकन किया जा सकता है ।
Introduction
CpG dinucleotides के भीतर cytosine कुर्सियां की C5 स्थिति स्तनधारी जीनोम1में प्रमुख मिथाइल साइट (5mCpG) है । इसके अलावा, हाल के अध्ययनों की एक संख्या गैर-CpG साइटों (5mCpH, जहां एच = ए, टी, या सी)2,3में व्यापक C5 cytosine मिथाइल (5mC) का पर्दाफाश किया है । 5mC संशोधन अंतर्जात retrotransposons और जीन प्रवर्तकों3,4,5पर एक transcriptional साइलेंसर के रूप में कार्य करता है । 5mC में डीएनए मिथाइल भी एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जीन प्रिंटिंग, परमाणु reprogramminging और ऊतक विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति5,6,7। C5 की स्थिति पर cytosine के मिथाइल डीएनए methyltransferases द्वारा किया जाता है, और इन एंजाइमों में उत्परिवर्तनों महत्वपूर्ण विकासात्मक दोषों8कारण. TET1-3 5mC oxidases9,10के द्वारा 5mC चिह्नों को हटाने की शुरुआत की जाती है । ये TET-family dioxygenases 5mC को 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) और 5-carboxylcytosine (5caC) द्वारा अनुक्रमिक ऑक्सीकरण चरणों11,12,13में परिवर्तित करते हैं. अंत में, thymine-डीएनए glycosylase की जगह 5fC या 5caC को संशोधित cytosine आधार उत्पाद मरम्मत मार्ग का उपयोग कर11.
मानव TET2 जीन myelodysplastic सिंड्रोम (mds)14,15,16, mds-myeloproliferative ट्यूमर सहित विविध टेम द्रोहियों में एक बार रूपांतरित जीन के रूप में पहचान की गई थी ( mds-सीपीसीबी), और गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) से उत्पन्न mds और mds-सीपीसीबी16. अस्थि मज्जा डीएनए में 5hmC संशोधन के स्तर जंगली प्रकार (wt) के साथ उन लोगों की तुलना में TET2 उत्परिवर्तनों के साथ रोगियों में कम कर रहे हैं-TET214. समूहों की एक संख्या सामांय hematopoiesis और माइलॉयड परिवर्तन17,18,19,20में अपनी भूमिका स्पष्ट करने के लिए TET2-पीट माउस मॉडल विकसित किया है । TET2 जीन में उत्परिवर्तनों के साथ इन चूहों शुरू में सामांय और व्यवहार्य थे, लेकिन विविध टेम द्रोह प्रकट के रूप में वे अपने जल्दी मौत के कारण वृद्ध । इन अध्ययनों ने सामान्य टेम विभेद में wt-TET2 द्वारा निभाई गई महत्वपूर्ण भूमिकाएँ दिखाईं. इन माउस मॉडलों में heterozygous टेम स्टेम सेल (TET2+/ -HSCs) और homozygous TET2-/ HSCs पर एक प्रतिस्पर्धात्मक लाभ था homozygous wt-TET2 HSCs में टेम वंश को बसाने के रूप में दोनों TET2+/ और TET2-/- HSCs विकसित विविध टेम द्रोह17,18. इन अध्ययनों का प्रदर्शन है कि TET2 dioxygenase के haploinsufficiency HSCs और टेम द्रोह में परिणाम के विकास में परिवर्तन ।
TET2 जीन में उत्परिवर्तन के साथ चूहों के समान, सबसे ल्यूकेमिया रोगियों TET2 dioxygenase गतिविधि के प्रकट haploinsufficiency. इन ज्यादातर heterozygous दैहिक उत्परिवर्तनों फ्रेम बदलाव और बकवास TET2 जीन शरीर भर में फैलाया उत्परिवर्तनों शामिल है जबकि dioxygenase डोमेन12में सबसे संकुल रहे है कि बकवास उत्परिवर्तनों । तिथि करने के लिए, wt के छोटे लक्षण वर्णन-और उत्परिवर्ती-TET2 साहित्य में मुख्य रूप से TET2 dioxygenase और इसकी परख21के उत्पादन के साथ कठिनाइयों के कारण की सूचना दी है । यहां, हम देशी TET2 आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी का उपयोग dioxygenase का एक सरल एकल कदम शुद्धि की रिपोर्ट । इसके अलावा, एक मात्रात्मक LC-ms/एमएस परख अनुकूलित और देशी TET2 dioxygenase के एंजाइमी गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
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Protocol
1. untaggeded मानव TET2 Dioxygenase की क्लोनिंग और शुद्धिकरण
- क्लोन मानव TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, δ 1481-1843) में pDEST14 गंतव्य सदिश का उपयोग कर साइट विशिष्ट पुनर्संयोजन तकनीक के रूप में पहले22वर्णित है ।
नोट: पिछले अध्ययनों से दिखा दिया है कि सी-टर्मिनल TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, δ 1481-1843) डोमेन ंयूनतम उत्प्रेरक सक्रिय डोमेन21,23है । untaggeded TET2 dioxygenase डोमेन pDONR221 वेक्टर का उपयोग व्यक्त करने के लिए, शाइन Dalgarno और श्मिट अनुक्रम पीसीआर (तालिका 1) के दौरान आगे प्राइमर में शामिल किया गया । - बैक्टीरियल परिवर्तन के लिए, रिकॉमबिनेंट pDEST14 अभिव्यक्ति वेक्टर untaggeded मानव TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, δ 1481-1843) के 1 µ एल जोड़ने के लिए १०० µ एल के लिए रासायनिक सक्षम ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं में एक १.७ मिलीलीटर ट्यूब । एक पानी के स्नान में 30 एस के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी सदमे के बाद कम से कम 15 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण रखें ।
- गर्मी सदमे के बाद तुरंत, 2 मिनट के ंयूनतम के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को वापस रखो । इस के बाद, कोशिकाओं को catabolite दमन (एस. ओ. सी मीडिया) के साथ सुपर इष्टतम शोरबा के २५० µ एल जोड़ें । एक शेखर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं की मशीन ।
- मशीन के बाद, नीचे स्पिन कोशिकाओं के लिए ९,००० x जी पर ट्यूब केंद्रापसारक 1 मिनट के लिए pipetting द्वारा ७०% supernatant त्यागो और गोली भंग में मीडिया पर छोड़ दिया ।
- एक Luria शोरबा पर सेल निलंबन फैलाओ (पौंड) १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन युक्त प्लेट आगर । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए थाली मशीन ।
- एक अलग कॉलोनी का चयन करें और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में पौंड-एम्पीसिलीन मीडिया के 10 मिलीलीटर में यह inoculate । रात भर के लिए एक शेखर में ३७ ° c पर ट्यूब मशीन । इस के बाद, संस्कृति के १०० µ एल का उपयोग करें ५० एमएल ट्यूब से inoculate १०० मिलीलीटर की पौंड-एम्पीसिलीन मीडिया । १८० rpm पर एक शेखर पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर कुप्पी मशीन और प्राथमिक संस्कृति के रूप में उपयोग करें । अगले दिन, का उपयोग करें 6 मिलीलीटर प्राथमिक संस्कृति के प्रत्येक inoculate करने के लिए 15 कुप्पी, प्रत्येक युक्त ६०० मिलीलीटर पौंड-एम्पीसिलीन मीडिया. अब, ३७ डिग्री सेल्सियस पर १८० rpm पर एक शेखर पर 15 कुप्पी की मशीन ।
नोट: परिवर्तित क्लोन की पुष्टि करने के लिए, डीएनए अनुक्रमण प्रदर्शन या अलग प्लाज्मिड डीएनए के साथ पाचन प्रतिबंध । - बैक्टीरियल संस्कृति के घनत्व की जांच करने के लिए, अपने आयुध डिपो६०० एक spectrophotometer का उपयोग उपाय । के बाद संस्कृति ०.८ के आयुध डिपो६००में एक घनत्व तक पहुंचता है, ३०० µ एल के 1 एम के साथ TET2 प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रेरित (६०० एमएल में ०.५ mM के अंतिम एकाग्रता) प्रत्येक कुप्पी में IPTG और आगे 17 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए संस्कृति हो जाना ।
- 16 एच के बाद, जीवाणु संस्कृति के हस्तांतरण के लिए बोतलें केंद्रापसारक । बैक्टीरियल संस्कृति ५,२५० x g पर TET2 एंजाइम व्यक्त करने के लिए ४५ min. TET2 शुद्धि के लिए बैक्टीरियल गोली का प्रयोग करें ।
नोट: या तो बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष सभी प्रोटीन शुद्धि कदम प्रदर्शन करते हैं । - ५० mM एमईएस (2-(एन-morpholino) ethanesulfonic एसिड) बफर, पीएच 6 और sonicate 5 × 30 एस के लिए ६० एस ठंडा अंतराल के साथ बिजली 20 में से १०० मिलीलीटर में बैक्टीरियल गोली resuspend ।
- ४५ मिनट के लिए ५,२५० x जी में lysate स्पिन । घुलनशील TET2 एंजाइम युक्त supernatant लीजिए और एक FPLC सिस्टम पर लोड करने से पहले ०.४५-µm फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं ।
नोट: इन प्रयोगों में, TET2 एंजाइम बहुत स्थिर था, लेकिन अगर जरूरत एक को छेड़ने वाला अवरोधक कॉकटेल युक्त 1 मिमी benzamidine-एचसीएल, 1 मिमी phenylmethylsulphonyl फ्लोराइड (PMSF), और ०.५ मिमी 1, 10-o-phenanthroline करने के लिए सेल lysate करने के लिए जोड़ा जा सकता है TET2 एंजाइम की गिरावट को रोकने के । अवरोधक कॉकटेल में EDTA या EGTA का उपयोग करने से बचें क्योंकि ये निम्न कटियन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. - एक FPLC कॉलम में एक मजबूत कटियन एक्सचेंज राल के 30 मिलीलीटर पैक । Equilibrate एक FPLC प्रणाली का उपयोग कर ०.३ मिलीलीटर की निरंतर प्रवाह की दर पर (५० mM एमईएस बफर, पीएच 6) धो बफर के 10 बिस्तर मात्रा के साथ कॉलम ।
- पूर्व equilibrated कॉलम पर स्पष्ट lysate लोड और धो बफर के ∼ 10 बिस्तर मात्रा के साथ धो जब तक प्रवाह के माध्यम से स्पष्ट हो जाता है ।
- Elute TET2 एक 0-100% ग्रैडिएंट से वॉश बफ़र के लिए रेफरेंस बफ़र (५० mM एमईएस बफ़र, पीएच 6, 1 M NaCl) में 15 बिस्तर वॉल्यूम के लिए १००% रेफरेंस बफ़र पर पकड़ के बाद का उपयोग कर दो-बिस्तर वॉल्यूम ।
नोट: सभी रेफरेंस अंशों के साथ कॉलम लोडिंग करने से पहले और बाद में सेल lysate के नमूनों (१०० µ l प्रत्येक) को एकत्र करें और एसडीएस-पृष्ठ को हल करने पर 10% विश्लेषण करे । - पूल TET2 प्रोटीन युक्त अंश, सूखी फ्रीज, 10 मिलीलीटर पानी में एंजाइम फूस भंग और दुकान पर-८० ° c ।
2. TET2 Dioxygenase द्वारा 5mC ऑक्सीकरण
- सब्सट्रेट (25-मेर डबल असहाय डीएनए, 2 तालिका) के 3 µ जी के साथ तपसिल में सभी मिथाइल प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करें ।
- कुल प्रतिक्रिया बफर के ५० µ एल में शुद्ध TET2 एंजाइम के १०० µ जी जोड़ें ५० मिमी HEPES (पीएच ८.०), २०० µ एम FeSO4, 2 मिमी 2OG (2-oxoglutarate/α-ketoglutarate), और 2 मिमी ascorbate और 1 एच21के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
- ५०० mM EDTA के 5 µ l के साथ TET2 catalyzed ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं बुझाने ।
- TET2 प्रतिक्रियाओं शमन के बाद, TET2 प्रतिक्रिया मिश्रण से डीएनए अलग oligo शोधन कॉलम का उपयोग करके नियंत्रण रेखा के लिए नमूने तैयार एमएस/
- जोड़ें १०० µ oligo बाइंडिंग बफ़र के ५५ µ l के लिए बुझती प्रतिक्रिया ।
- इस के बाद, मिश्रण करने के लिए १००% इथेनॉल के ४०० µ एल जोड़ें । एक oligo बाध्यकारी कॉलम के माध्यम से इस मिश्रण दर्रा ।
- ७५० µ l धो बफर और 20 µ l पानी में elute के साथ बंधे डीएनए धो लो ।
- DNase मैं और ६० इकाइयों के 2 इकाइयों के साथ अलग डीएनए को पचाने में ३७ ° c nuclease के लिए 12 एच के लिए व्यक्तिगत nucleoside-monophosphates उत्पादन ।
- पाचन के बाद, nucleoside-monophosphates से टर्मिनल फॉस्फेट समूहों को दूर करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इसके अलावा 12 एच के लिए नमूने और मशीन में बछड़ा आंत्र क्षारीय फॉस्फेट (CIAP) की 2 इकाइयों को जोड़ने nucleosides प्राप्त करने के लिए ।
- सभी nucleosides, विशेष रूप से संशोधित cytosines, नियंत्रण रेखा-ms/
3. मात्रात्मक LC-एमएस/
- सभी संशोधित cytosine nucleosides [5-मिथाइल-2′-deoxycytidine (5mdC) के १०० µ m शेयर हल तैयार करें, 5-hydroxymethyl-2′-deoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2′-deoxycytidine (5fdC), और 5-carboxy-2′-deoxycytidine (5cadC)] और सामान्य डीएनए कुर्सियां (adenine, thymine, cytosine, और guanine) के विकास के लिए HPLC ग्रेड पानी में LC-ms/
- nucleoside-निर्भर एमएस/एमएस पैरामीटर का अनुकूलन स्टॉक समाधान, एक समय में एक, मास स्पेक्ट्रोमीटर में 10 µ एल के एक प्रवाह की दर पर/ अनुकूलन निंनलिखित मानकों: संभावित (डीपी), प्रवेश क्षमता (EP), टक्कर सेल प्रवेश क्षमता (वयक), टक्कर ऊर्जा (CE), और टक्कर सेल से बाहर निकलने की क्षमता (CXP) प्रत्येक डीएनए nucleoside स्वचालित मात्रात्मक अनुकूलन का उपयोग करने के लिए सॉफ्टवेयर की सुविधा ।
- 25% विलायक B के साथ ०.३ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर एक ढाल का उपयोग शेयर समाधान के 10 µ एल इंजेक्शन द्वारा स्रोत पर निर्भर एमएस//मिन जहां विलायक एक 10 मिमी अमोनियम एसीटेट (पीएच ४.०) है और विलायक बी 10 मिमी अमोनियम एसीटेट (पीएच ४.०) के साथ 20% acetonitrile है । निम्न पैरामीटर्स ऑप्टिमाइज़ करें: पर्दा गैस (CUR): 10-50, तापमान: 0-600 ° c, गैस प्रवाह 1 (GS1): 0-50, गैस प्रवाह 2 (GS2): 0-50, टकराव सक्रिय पृथक्करण (सीएडी): कम मध्यम उच्च, आयन स्प्रे वोल्टेज (है): प्रत्येक डीएनए nucleoside मैनुअल का उपयोग कर के लिए 4000-5500 मात्रात्मक अनुकूलन FIA में सॉफ्टवेयर की सुविधा (प्रवाह इंजेक्शन विश्लेषण) मोड ।
- सभी आठ डीएनए nucleosides को अलग करने के लिए, तरल क्रोमैटोग्राफी निंनलिखित ढाल का उपयोग कर: 0% विलायक बी (0-2 मिनट), 0-20% विलायक बी (2-5 मिनट), 20-60% विलायक बी (5-9 मिनट), 60-0% विलायक बी (9-10 मिनट) और फिर equilibrate के साथ विलायक एक के लिए एक प्रवाह की दर पर 5 मिनट ०.३ एक C18 स्तंभ पर एमएल/मिनट (कण आकार: 5 µm, ताकना आकार: १२० Å) ।
- इष्टतम एमएस का उपयोग करना/ms पैरामीटर (चरण ३.२ और ३.३) उपर्युक्त तरल क्रोमैटोग्राफी ढाल के साथ युग्मित (चरण ३.४), निर्धारित प्रतिक्रिया रैखिकता, पता लगाने की सीमा (लोद), और ठहराव की निचली सीमा (LLOQ) का उपयोग कर एक दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने की एक १०० µ मीटर मानक सभी आठ nucleosides युक्त मिश्रण. सभी आठ डीएनए nucleosides के लिए मानक curves ड्रा ।
- पता लगाने और सभी nucleosides, विशेष रूप से संशोधित cytosines, चरण २.४ में उत्पादित नियंत्रण रेखा-ms/एमएस विधि और मानक curves का उपयोग कर ।
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Representative Results
TET द्वारा डीएनए में 5mC का गतिशील संशोधन-परिवार dioxygenases epigenetic transcriptional विनियमों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. TET2 dioxygenase अक्सर विविध टेम द्रोह12में रूपांतरित हो जाता है । सामांय विकास और रोग में TET2 एंजाइम की भूमिका की जांच करने के लिए, हम pDEST14 वेक्टर22में किसी भी संबंध टैग के बिना अपनी ंयूनतम उत्प्रेरक सक्रिय डोमेन क्लोन किया है । untaggeded TET2 dioxygenase जीवाणु ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं में एसडीएस द्वारा कुल घुलनशील प्रोटीन के ∼ 5% पर उत्पादन किया गया था । TET2 के उत्प्रेरक डोमेन के बाद से एक अपेक्षाकृत उच्च isoelectric बिंदु (∼ ७.४९), सबसे स्वदेशी ई. कोलाई प्रोटीन के साथ तुलना में24,25,26, एक कुशल शुद्धि एक कटियन का उपयोग प्रक्रिया एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी का विकास हुआ । यह शुद्धि एक ही कदम में > 90% शुद्ध TET2 एंजाइम झुकेंगे (चित्रा 1) ।
आदेश में अलग करने के लिए और अलग deoxycytidines डेरिवेटिव और अंय चार प्राकृतिक डीएनए कुर्सियां TET2 एंजाइमी प्रतिक्रिया, एक संवेदनशील नियंत्रण रेखा-ms/ तरल क्रोमैटोग्राफी एक उलट-चरण C18 स्तंभों का इस्तेमाल किया । मानक curves सभी nucleosides (चित्रा 2) युक्त एक मिश्रण के धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग कर तैयार किया गया । तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए इस्तेमाल किया ढाल, प्रयोगात्मक प्रक्रिया में वर्णित है, सभी आठ nucleosides (चित्रा 3) को हल करने में सक्षम था । नियंत्रण रेखा अवधारण समय (tr) सभी आठ nucleosides के लिए तालिका 3में वर्णित हैं । हम आगे प्रत्येक माता पिता आयन nucleoside (Q1), सबसे तीव्र उत्पाद आयन (Q3) का निर्धारण उनके क्लस्टरिंग संभावित (डीपी), प्रवेश क्षमता (EP), टक्कर सेल प्रवेश क्षमता (वयक), टक्कर ऊर्जा (CE), की सीमा के एमएस का पता लगाने अनुकूलित डिटेक्शन (लोद), और ठहराव (LLOQ) (तालिका 3) की निचली सीमा । अंत में, एक नियंत्रण रेखा-ms/एमएस विधि विकसित किया गया है कि अलग कर सकते हैं और चार सामान्य डीएनए कुर्सियां (एक, टी, जी, और सी), साथ ही चार संशोधित cytosine कुर्सियां (5-मिथाइल, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, और 5-carboxyl) (चित्रा 3) ।
untaggeded TET2 dioxygenase की गतिविधि एक 25-मेर dsDNA प्रत्येक डीएनए कतरा (तालिका 2) में एक CpG द्वीप में एक 5mC युक्त का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । TET2 एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के बाद, डीएनए oligonucleotides शुद्ध और nucleosides में बदल रहे थे । फिर इन nucleosides को नियंत्रण रेखा के अधीन किया गया-ms/ TET2 एंजाइम (नकारात्मक नियंत्रण) के बिना प्रतिक्रियाओं में, केवल डा, डीटी, डीजी, डीसी, और 5mdC चोटियों मनाया गया । हालांकि, सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया है, जो TET2 dioxygenase, d5hmC और d5fC के लिए इसी दो नई चोटियों में निहित थे में मनाया गया । हम d5caC nucleoside के गठन संभवतः अपने गरीब पता लगाने के स्तर (चित्रा 2) के कारण का पता लगाने में सक्षम नहीं थे । ये परिणाम प्रदर्शित करता है कि untaggeded TET2 dioxygenase इस प्रक्रिया में शुद्ध उत्प्रेरक सक्रिय है और wt-TET2 एंजाइम और उसके नैदानिक म्यूटेंट को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
चित्र 1. एसडीएस- ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं से शुद्ध TET2 dioxygenase के पृष्ठ विश्लेषण । लेन एक मार्कर इंगित करता है, जबकि लेन बी इंगित करता है TET2 प्रोटीन सपा sepharose आयन एक्सचेंज राल का उपयोग कर शुद्ध । untaggeded TET2 dioxygenase का कुल आकार ∼ ५४ केडीए के रूप में तीर द्वारा दर्शाया गया है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. मानक curves चार प्राकृतिक डीएनए nucleosides और विभिंन cytosine डेरिवेटिव है, जो तब उनके ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया के लिए आकर्षित किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3. तरल क्रोमैटोग्राफी (नीचे) और एमएस/ms (ऊपर) विधि अलग और चार प्राकृतिक डीएनए nucleosides और अलग cytosine डेरिवेटिव की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया ।
| प्राइमरी का नाम | प्राइमरी सीक्वेंस | |||
| TET2 फॉरवर्ड प्राइमरी | 5 '-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3 ' | |||
| TET2 रिवर्स प्राइमर | 5 '-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3 ' | |||
तालिका 1: डीएनए oligonucleotide प्राइमरों के अनुक्रम untaggeded मानव TET2 dioxygenase के उत्प्रेरक डोमेन की पीसीआर प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया ।
| प्राइमरी का नाम | प्राइमरी सीक्वेंस |
| नब्ज कतरा | 5 '-AGCCCGCGCCG/iMe-dC/GCCGGTCGAGCGG-3 ' |
| Antisense किनारा | 5 '-CCGCTCGACCGGCG/iMe-dC/GGCGCGGGCT-3 ' |
तालिका 2: भाव और विरोधी भावना के अनुक्रम 25-मेर dsDNA oligonucleotide के लिए एक TET2 सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया इन विट्रो ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं ।
| Nucleosides | Q1 | Q3 | टीआर (मिन) | डीपी (वि.) | EP (V) | वयक (वि.) | CE (V) | लोद (pmol) | LLOQ | आर2 | |
| 2 '-deoxyadenosine | २५२.२ | १३६.१ | १२.०७ | ४१ | 9 | 14 | 17 | ०.०६ | ०.१९८ | ०.९९७ | |
| 2 '-deoxythymidine | २४३.२ | ११७.१ | १०.९५ | 16 | 8 | 14 | 15 | १.८ | ५.९४ | ०.९९९ | |
| 2 '-deoxyguanosine | २६८.२ | १५२.१ | १०.६ | 21 | 7 | 14 | ३७ | ७.८ | २५.७४ | ०.९९९ | |
| 2 '-deoxycytidine | २२८.१ | ११२.१ | ६.२९ | 21 | 7 | 14 | 15 | ०.१ | ०.३३ | ०.९९८ | |
| 5-मिथाइल-2'-deoxycytidine | २४२.२ | १२६.१ | ९.८५ | 31 | ६.५ | 24 | 13 | ०.०३ | ०.१ | ०.९९८ | |
| 5-hydroxymethyl-2 '-deoxycytidine | २५८.२ | १४२.१ | ७.१५ | 16 | 6 | 14 | 13 | ०.६ | १.९८ | ०.९९३ | |
| 5-formyl-2'-deoxycytidine | २५६.२ | १४०.१ | १०.९२ | 11 | 6 | 14 | 15 | ०.२ | ०.६६ | ०.९९८ | |
| 5-carboxy-2'-deoxycytidine | २७२.२ | १५६.१ | ४.१ | 6 | 7 | ९४ | 23 | ३.९ | १२.८७ | ०.९९३ | |
तालिका 3: अनुकूलित नियंत्रण रेखा-ms/चार प्राकृतिक डीएनए nucleosides और सकारात्मक आयन मोड के तहत विभिंन cytosine डेरिवेटिव के एमएस पैरामीटर । प्रत्येक पैरेंट आयन nucleoside (Q1) के लिए, सबसे तीव्र उत्पाद आयन (Q3) का पता लगाया गया था ।
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Discussion
TET2 जीन में उत्परिवर्तनों के कुछ सबसे अक्सर विभिंन टेम द्रोह के साथ रोगियों में आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाया है । विभिंन TET2 उत्परिवर्तनों, जो बकवास, फ्रेम बदलाव, और अर्थ में परिवर्तन के सैकड़ों तारीख को12रोगियों में पहचान की गई है । TET2 उत्परिवर्तनों के साथ रोगियों wt-TET214के साथ उन की तुलना में अस्थि मज्जा में जीनोमिक 5hmC के निम्न स्तर दिखाते हैं । उत्परिवर्ती TET2 दस्तक-प्रयोगों में transfected कोशिकाओं में 5hmC के स्तर पर इन उत्परिवर्तनों के प्रभाव recapitulated है14। TET2-नॉकआउट माउस मॉडलों से परिणाम TET2 एंजाइम व्युत्क्रम के स्तर टेम द्रोह17,18,19,20की प्रगति के साथ संबंधित का प्रदर्शन किया । लगातार, झांग एट अल । हाल ही में प्रदर्शित किया है कि नीचे TET2 अभिव्यक्ति के स्तर के विनियमन एक संभावित शकुन और cytogenetically सामांय गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया27में पूर्वानुमानात्मक निशाना है ।
बढ़ते सबूत है कि TET2 सामांय hematopoiesis और माइलॉयड परिवर्तन में एक मौलिक भूमिका निभाता है के बावजूद, wt के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन-और उत्परिवर्ती TET2 सक्रिय TET2 के उत्पादन के साथ जुड़े कठिनाइयों के कारण मामूली चरणों में रहना और इसकी परख की । अधिकांश अध्ययनों से रिकॉमबिनेंट TET2 का उत्पादन किया है या तो समय की खपत baculovirus प्रणाली का उपयोग कीट कोशिकाओं में14, या एक glutathione S-ट्रांस्फ़्रेज़ संबध टैग के रूप में बैक्टीरियल कोशिकाओं में जो संबध टैग हटाने की आवश्यकता है21.
इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया में, हम untaggeded मानव TET2 dioxygenase उत्प्रेरक डोमेन का उपयोग कर एक साइट विशेष पुनर्संयोजन तकनीक और अपने कुशल गंतव्य सदिश (pDEST14) का उपयोग कर ई. कोलाईमें अभिव्यक्ति की क्लोनिंग का वर्णन किया । क्योंकि untaggeded TET2 के isoelectric बिंदु अपेक्षाकृत अधिक है (∼ ७.४९) सबसे स्वदेशी ई. कोलाई प्रोटीन के साथ तुलना में, हम एक कुशल शोधन प्रक्रिया एक कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी उपज का उपयोग विकसित > 90% शुद्ध untaggeded TET2 एक ही कदम में एंजाइम ।
इसके अलावा, अतिरिक्त चुनौतियों wt के ठहराव में मौजूद-और उत्परिवर्ती TET2 dioxygenase गतिविधि । इन प्रयोगों के लिए ज्यादातर अध्ययनों ने एंटीबॉडी पर भरोसा किया है जैसे डॉट-ब्लाट्स14,28, एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा)29, आदि के रूप में है क्योंकि इन परख आम तौर पर केवल एक एंटीबॉडी का उपयोग करें, जैसे, 5hmC या 5fC or5caC, सब्सट्रेट डीएनए में 5mC संशोधन का पता लगाने के लिए, वे TET isoforms द्वारा किए गए उत्प्रेरक प्रतिक्रिया की एक पूरी तस्वीर प्रदान नहीं करते. इन कारणों के लिए, नियंत्रण रेखा-ms/ms-आधारित परख ही परख के रूप में उभरा है अलग cytosine संशोधनों यों । इस संबंध में, हमने एक उपंयास लिक्विड क्रोमैटोग्राफी पद्धति विकसित की है जो चार सामान्य डीएनए आधारों (ए, टी, जी, और सी) को अलग कर सकती है, साथ ही चार संशोधित cytosine कुर्सियां (5mC, 5hmC, 5fC, और 5caC) ।
TET2 catalyzed प्रतिक्रियाओं से आठ nucleosides यों तो, हम मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ हमारे बेहतर तरल क्रोमैटोग्राफी विधि युग्मित है । इस संवेदनशील नियंत्रण रेखा-ms/एमएस परख तो रिकॉमबिनेंट की गतिविधि untaggeded मानव TET2 एंजाइम का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया गया था । दृष्टिकोण यहां वर्णित बहुत wt के मूल्यांकन में वृद्धि होगी-और उत्परिवर्ती TET2 dioxygenase गतिविधियों ।
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Disclosures
लेखकों को कोई वित्तीय हितों की घोषणा नहीं है ।
Acknowledgments
यह शोध अमेरिकी रक्षा विभाग द्वारा एक विचार पुरस्कार (W81XWH-13-1-0174), अप्लास्टिक एनीमिया और MDS फाउंडेशन अनुदान के रूप में वित्त पोषित किया गया था, और M.M के लिए UMRB अनुदान । लेखक मोहित जायसवाल और Subhradeep Bhar TET2 में pDEST14 की प्रारंभिक क्लोनिंग के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
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