Summary
Здесь мы представляем протокол для эффективной одного шага очистки активных непомеченным человека десять-одиннадцать транслокации-2 (TET2) 5-метилцитозин dioxygenase с помощью ионообменной хроматографии и его анализа, с помощью жидкой массы хроматографии тандем спектрометрия (LC-MS/MS)-подход на основе.
Abstract
Эпигеномные транскрипции регулирования, при посредничестве 5-метилцитозин (5мс) играет решающую роль в эукариотических развития. Деметилирования этих эпигенетических меток осуществляется путем последовательного окисления десять-одиннадцать транслокации dioxygenases (TET1-3), после ремонта glycosylase зависимых базовых иссечение тимин ДНК. Инактивация гена TET2 из-за генетической мутации или других эпигенетические механизмы связаны с плохим прогнозом у больных с различными рака, особенно кроветворных злокачественных опухолей. Здесь мы Опишите эффективной одного шага очистки ферментативно активной непомеченным человека TET2 dioxygenase с помощью хроматографии катионного обмена. Далее мы предоставляем жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS) подход, который можно отделить и количественно четыре обычных оснований ДНК (A, T, G и C), а также четырех баз модифицированных цитозином (5-метил, 5-гидроксиметил, 5-формил и 5-карбоксильных). Этот assay может использоваться для оценки деятельности дикого типа и мутантов TET2 dioxygenases.
Introduction
C5 позиция баз цитозина внутри CpG dinucleotides является преобладающим метилирования сайт (5mCpG) в млекопитающих геномов1. Кроме того, ряд недавних исследований обнаружили обширные метилирование цитозина C5 (5мс) в не CpG сайтах (5mCpH, где H = A, T, или C)2,3. модификация 5мс служит transcriptional глушителя на эндогенных retrotransposons и Джин промоутеров3,4,5. Метилирование ДНК на 5мс также играет важную роль в инактивации Х-хромосомы, Джин импринтинг, ядерной перепрограммирования и ткани специфических генов выражение5,6,7. Метилирование цитозина с позиции C5 осуществляется methyltransferases ДНК, и мутации в эти энзимы вызывают значительные пороки развития8. Удаление следов 5мс инициируются TET1-3 5мс оксидазы9,10. Эти тет семья dioxygenases превратить 5мс 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxylcytosine (5caC) путем последовательного окисления шаги11,12,13. Наконец тимин ДНК glycosylase заменяет 5fC или 5caC в неизмененном цитозин, с использованием базового иссечение ремонт путь11.
Человеческий геном TET2 была определена как часто мутировавших генов в различных гемопоэтических злокачественных опухолей, включая миелодиспластические синдромы (MDS)14,,1516, MDS-миелопролиферативных новообразования ( MDS-MPN) и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), происходящих из MDS и MDS-MPN16. Уровни 5hmC модификации в костном мозге ДНК ниже у пациентов с TET2 мутации, по сравнению с теми с дикого типа (wt)-TET214. Ряд групп разработали модели мыши TET2-нокаут для уточнения его роли в нормальное кроветворение и миелоидного преобразования17,18,19,20. Эти мыши с мутациями в гене TET2 были первоначально нормальной и жизнеспособным, но проявляется различных злокачественных опухолей кроветворной, как они в возрасте вызывая их ранней смерти. Эти исследования показали важную роль, которую играют wt-TET2 в нормальные гемопоэтические дифференциации. В этих моделях мыши, гетерозиготных гемопоэтических стволовых клеток (TET2+ / СКК) и гомозиготных TET2- / - СКК были конкурентное преимущество перед СКК гомозиготных wt-TET2 в заселив гемопоэтических линии как оба TET2+ /- и TET2- / - СКК различных злокачественных опухолей кроветворной17,18. Эти исследования показывают, что haploinsufficiency TET2 dioxygenase изменяет развития СКК и приводит к гемопоэтических злокачественных опухолей.
Подобно мышей с мутациями в гене TET2, большинство больных лейкемией манифеста haploinsufficiency TET2 dioxygenase деятельности. Эти главным образом гетерозиготных соматические мутации включают рама shift и нонсенс мутации, рассеянных по всему телу гена TET2 во время Миссенс-мутации, которые являются наиболее сосредоточены в домен dioxygenase12. На сегодняшний день, маленькая характеристика wt - и мутанта TET2 сообщается в литературе главным образом из-за трудностей с производством TET2 dioxygenase и его пробирного21. Здесь мы приводим простой одношаговый очищение родной TET2 dioxygenase с помощью ионообменной хроматографии. Кроме того количественные assay LC-MS/MS был оптимизирован и используется для измерения Ферментативная активность родной TET2 dioxygenase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. клонирование и очистки непомеченным человека TET2 Dioxygenase
- Клонирование человека TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) в pDEST14 назначения вектор с использованием метода участкам рекомбинации как описано22.
Примечание: Предыдущие исследования показали, что домен dioxygenase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) TET2 C-терминал является минимальным каталитически активных доменных21,23. Для того чтобы выразить непомеченным TET2 dioxygenase домен с помощью вектора pDONR221, обуви Dalgarno и Козак последовательности были включены в вперед грунт во время ПЦР (Таблица 1). - Для бактериальных трансформации, добавить 1 мкл рекомбинантных pDEST14 вектора выражения содержащие непомеченным человека TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) до 100 мкл химически сведущее Escherichia coli BL21 (DE3) клетки в 1,7 мл трубку. Храните смесь на льду по крайней мере 15 минут после теплового шока при 42 ° C за 30 s на водяной бане.
- Сразу же после теплового шока держите клетки обратно на льду для минимум 2 мин. После этого добавьте 250 мкл супер оптимального бульон с catabolite репрессий (S.O.C СМИ) клеток. Инкубируйте бактериальные клетки за 1 ч при 37 ° C в шейкере.
- После инкубации спина вниз клетки центрифугированием трубки на 9000 x g за 1 мин отменить 70% супернатанта, закупорить и растворяют гранулы в левой над средствами массовой информации.
- Распространение суспензию клеток на табличке агар Лурия бульон (LB), содержащий ампициллина 100 мкг/мл. Инкубировать пластину для 16 ч при 37 ° C.
- Выберите один из изолированной колонии и инокуляции в 10 мл LB-ампициллин СМИ в 50 мл трубки. Инкубируйте трубки при 37 ° C в шейкер для ночлега. После этого используйте 100 мкл культуры из 50 мл трубки для инокуляции 100 мл LB-ампициллин средств массовой информации. Инкубировать настой при 37 ° C на шейкер на 180 об/мин и использовать его как основной культуры. Следующий день, используйте 6 мл основной культуры для инокуляции 15 колбы, каждый содержащий 600 мл LB-ампициллин СМИ. Теперь Инкубируйте 15 колбы при 37 ° C на шейкер на 180 об/мин.
Примечание: Для проверки преобразованные клоны, выполняют ДНК последовательности или ограничение пищеварение с изолированной плазмидной ДНК. - Чтобы проверить плотность бактериальной культуры, измерьте его ОД600 с помощью спектрофотометра. После того, как культура достигает плотность 0,8 в ОД600, побудить выражение TET2 белка с 300 мкл 1 IPTG М (конечная концентрация 0,5 мм в 600 мл) в каждый флакон и далее расти культуру для 16 h 17 ° c.
- После 16 ч передать центрифуги бутылки бактериальной культуры. Центрифуга бактериальной культуры, выражая фермента TET2 в 5250 x g 45 мин использования бактериального гранулы для TET2 очистки.
Примечание: Выполните все оставшиеся шаги очистки белков, либо на льду или на 4 ° C. - Ресуспензируйте бактериальных Пелле в 100 мл 50 мм MES (2-(N-Морфолино) ethanesulfonic кислота) буфер, рН 6 и sonicate для 5 × 30 s на мощность 20 с 60 s охлаждения интервалов.
- Спин lysate на 5250 x g 45 мин собирать супернатанта, содержащий водорастворимые фермент TET2 и пройти через 0.45 мкм фильтров перед загрузкой на ПСОК систему.
Примечание: В этих экспериментах, фермент TET2 было весьма стабильным, но при необходимости протеазы ингибитор коктейль содержащий 1 мм benzamidine-HCl, 1 мм phenylmethylsulphonyl фторид (PMSF) и 0,5 мм 1,10 -o- фенантролиновый могут быть добавлены к ячейке lysate для предотвращения деградации TET2 фермента. Избегайте использования ЭДТА или EGTA в ингибитор коктейль, как они могут мешать следующие хроматографии катионного обмена. - Пакет 30 мл сильной катионообменной смолы в столбец ПСОК. Сбалансировать столбец с 10 томов кровать стирка буфера (MES буфера 50 мм, pH 6) со скоростью 0,3 мл/мин с помощью ПСОК систему постоянного потока.
- Загрузить осветленный lysate на предварительно уравновешенной столбцов и промыть ∼10 кровать тома мыть буфера до тех пор, пока через поток становится ясно.
- Элюировать TET2 с помощью 0-100% градиент из буфера мытья Элюирующий буфер (MES буфера 50 мм, pH 6, 1 M NaCl) в 15 томах кровать следуют Холдинг на 100% Элюирующий буфер для 2-х местный томов.
Примечание: Сбор образцов (по 100 мкл) lysate до и после загрузки наряду с все фракции элюции столбца ячейки и анализировать на 10%, урегулировании SDS-PAGE. - Бассейн фракций, содержащих белок TET2, заморозить сухой, распустить фермента поддон в 10 мл воды и хранить при температуре-80 ° C.
2. 5мс окисления TET2 Dioxygenase
- Выполните все деметилирования реакции в трех экземплярах с 3 мкг субстрата (25-mer двойной мель ДНК, Таблица 2).
- Добавить 100 мкг очищенный TET2 фермента в 50 мкл буфера общая реакция, содержащий 50 мм HEPES (рН 8,0), 200 мкм FeSO4, 2OG 2 мм (2-oxoglutarate/α-ketoglutarate) и 2 мм аскорбат и инкубировать при 37 ° C для 1 h21.
- Утолите TET2 катализируемых реакций окисления с 5 мкл 500 мм ЭДТА.
- После закалки TET2 реакций, подготовьте образцы для анализа LC-MS/MS, разделив ДНК от TET2 реакционной смеси с использованием oligo очистки столбцов.
- Добавьте 100 мкл буфера привязки oligo 55 мкл закаленном реакции.
- После этого добавьте в смесь 400 мкл, 100% этанола. Передайте эту смесь через столбец привязки oligo.
- Вымойте привязанного ДНК с 750 мкл буфера мытья и элюировать в 20 мкл воды.
- Дайджест изолированной ДНК с 2 единицы DNase I и 60 единиц Нуклеаза S1 при 37 ° C в течение 12 ч, для производства отдельных нуклеозидов monophosphates.
- После переваривания добавить 2 единицы икры кишечной щелочной фосфатазы (CIAP) в образцах и инкубировать для добавления 12 ч при 37 ° C для удаления терминала фосфатные группы из нуклеозидов monophosphates для получения нуклеозидов.
- Подсчитать все нуклеозидов, особенно модифицированных cytosines, используя описанный ниже метод LC-MS/MS.
3. количественные LC-MS/MS-на основе анализа развития
- Подготовка 100 мкм Стоковый раствор всех цитозина модифицированных нуклеозидов [5-метил 2′ Дезоксицитидин (5mdC), 5-гидроксиметил 2′ Дезоксицитидин (5hmdC), 5-формил 2′ Дезоксицитидин (5fdC) и 5-карбоксильную 2′ Дезоксицитидин (5cadC)] и нормальной ДНК баз (аденин, тимин, цитозином и гуанина) в воде ВЭЖХ класса для разработки метода LC-MS/MS.
- Оптимизировать параметры МС/МС нуклеозидов зависимых вливая акций решения, по одному, в масс-спектрометр со скоростью потока 10 мкл/мин в EMS режим сканирования. Оптимизировать следующие параметры: Declustering потенциал (DP), вход потенциальных (EP), столкновение потенциал клеток вход (КЭП), столкновение энергии (CE) и столкновения потенциал клеток выхода (CXP) для каждого нуклеозидов ДНК с помощью автоматизированного количественного оптимизации особенность программного обеспечения.
- Оптимизация параметров зависит от источника МС/МС путем инъекций 10 мкл Стоковый раствор, с использованием градиента с 25% растворителем B со скоростью потока 0,3 мл/мин где растворителя A Ацетат аммония 10 мм (рН 4,0) и растворителей B 20% ацетонитриле с 10 мм аммония ацетат (рН 4,0). Оптимизировать следующие параметры: занавес газ (CUR): 10-50, температура: 0-600 ° C, газового потока 1 (ГС1): 0-50, 2 потока газа (GS2): 0-50, Collisionally активированный диссоциации (CAD): низкий-средний-высокий, ионного распыления напряжения (IS): 4000-5500 для каждого ДНК нуклеозидов, используя руководство функция в количественных оптимизации программного обеспечения в режиме ФИА (анализ потока инъекций).
- Чтобы отделить все восемь ДНК нуклеозидов, выполняют жидкостной хроматографии с использованием следующих градиент: 0% растворителем B (0-2 мин), 0-20% растворителем B (2-5 мин), 20-60% растворителем B (5-9 мин.), 60-0% растворителем B (9-10 мин) и затем сбалансировать с растворителем A для 5 минут при скорости потока 0,3 Мл/мин на C18 столбца (размер частиц: 5 мкм, размер поры: 120 Å).
- Использование оптимальных параметров МС/МС (Шаг 3.2 и 3.3), в сочетании с вышеупомянутой жидкостной хроматографии градиента (Шаг 3.4), определить ответ линейности, предел обнаружения (LOD) и нижний предел количественного определения (LLOQ) с помощью два раза последовательного растворения 100 мкм стандартной смеси, содержащей все восемь нуклеозидов. Рисование стандартных кривых для всех восьми ДНК нуклеозидов.
- Выявления и количественной оценки всех нуклеозидов, особенно модифицированных cytosines, производимых на Шаг 2.4 с использованием метода LC-MS/MS и стандартных кривых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Динамические изменения в ДНК 5мс, тет семья dioxygenases играет важную роль в эпигеномные транскрипционный анализ правил. TET2 dioxygenase часто мутирует в различных злокачественных опухолей кроветворной12. Расследовать роль фермента TET2 в нормального развития и болезней, мы клонировали его минимальной каталитически активных домена без какой-либо тег сходства в вектор pDEST1422. ∼5% общего растворимого белка непомеченным dioxygenase TET2 был подготовлен анализ SDS-PAGE в бактериальных E. coli BL21 (DE3) клетки. Так как катализатора домен TET2 имеет относительно высокий Изоэлектрическая точка (∼7.49), по сравнению с наиболее коренных E. coli белки24,25,26, процесс эффективной очистки, используя катиона Обмен хроматографии была разработана. Это очистка принесли > 90% чистой TET2 фермента в один шаг (рис. 1).
Для того чтобы отделить и количественной оценки различных deoxycytidines производные и другие четыре природных оснований ДНК после TET2 ферментативные реакции, чувствительных LC-MS/MS-на основе анализа был оптимизирован. Жидкостной хроматографии используется обратная фаза C18 столбцы. Стандартные кривые были нарисованы с помощью серийных разведений смеси, содержащей все нуклеозидов (рис. 2). Градиент, используемый для жидкостной хроматографии, описано в экспериментальной процедуре, был в состоянии решить все восемь нуклеозидов (рис. 3). В таблице 3описаны LC удержания раз (tr) для всех восьми нуклеозидов. Далее мы оптимизировали MS обнаружение каждого родителя Ион нуклеозидов (Q1), наиболее интенсивные продукт Ион (Q3), определяя их declustering потенциала (DP), вход потенциал (EP), столкновение клеток вход потенциальных (КЭП), энергию столкновения (CE), предел обнаружения (LOD), а нижний предел количественного определения (LLOQ) (Таблица 3). Наконец, был разработан метод LC-MS/MS, который можно отделить и количественно четыре обычных оснований ДНК (A, T, G и C), а также четырех баз модифицированных цитозином (5-метил, 5-гидроксиметил, 5-формил и 5-карбоксильных) (рис. 3).
Деятельность без тегов TET2 dioxygenase был определен с помощью 25-mer dsDNA, содержащие один 5мс острова CpG в каждой стренге дна (Таблица 2). После TET2 ферментативных реакций ДНК-олигонуклеотиды были очищены и превращен в нуклеозидов. Затем эти нуклеозидов были подвергнуты пробирного LC-MS/MS. В реакциях без фермента TET2 (отрицательный контроль) наблюдались только да, dT, ГД, dC и 5mdC вершины. Однако в реакции, положительный контроль, который содержал TET2 dioxygenase, были замечены два новых вершин, соответствующий d5hmC и d5fC. Мы не смогли обнаружить формирования d5caC нуклеозидов, возможно из-за его плохой обнаружения уровней (рис. 2). Эти результаты показывают, что непомеченным TET2 dioxygenase, очищенный в этой процедуре каталитически активных и может использоваться для характеристики wt-TET2 фермента и его клинических мутантов.
Рисунок 1. SDS-PAGE анализ очищенный TET2 dioxygenase от E. coli BL21 (DE3) клетки. Лейн A указывает маркер во время Лейн, B указывает на TET2 белка очищается с помощью SP sepharose ионообменные смолы. Общий размер помечен dioxygenase TET2 является ∼54 кДа, как указано стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Стандартные кривые привлекли четырех естественных ДНК нуклеозидов и различные цитозина производные, которые затем использовались для их количественной оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Жидкостная хроматография (внизу) и МС/МС (см. выше) метод, используемый для разделения и характеризуют четыре природных ДНК нуклеозидов и различные цитозина производных.
| Грунтовка имя | Грунтовка последовательность | |||
| TET2 вперед грунт | 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3' | |||
| TET2 Обратный грунт | 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3' | |||
Таблица 1: Последовательность ДНК праймеры олигонуклеотида используемых для амплификации PCR каталитического домена непомеченным человека TET2 dioxygenase.
| Грунтовка имя | Грунтовка последовательность |
| Смысл Strand | 5'-AGCCCGCGCCG/iMe-dC/GCCGGTCGAGCGG-3' |
| Антисмысловые Strand | 5'-CCGCTCGACCGGCG/iMe-dC/GGCGCGGGCT-3' |
Таблица 2: Последовательность и анти чувство олигонуклеотида dsDNA 25-mer, используется в качестве TET2 субстрат для в vitro реакций окисления.
| Нуклеозидов | Q1 | Q3 | tr (мин) | DP (V) | EP (V) | КЭП (V) | CE (V) | LOD (пмоль) | LLOQ | R2 | |
| 2'-деоксиаденозин | 252.2 | 136.1 | 12.07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0,06 | 0,198 | 0,997 | |
| 2'-deoxythymidine | 243.2 | 117.1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5.94 | 0.999 | |
| 2'-deoxyguanosine | 268.2 | 152.1 | 10.6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7.8 | 25.74 | 0.999 | |
| 2'-Дезоксицитидин | 228,1 | 112.1 | 6.29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0.1 | 0,33 | 0,998 | |
| 5-метил-2'-Дезоксицитидин | 242.2 | 126.1 | 9.85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0,03 | 0.1 | 0,998 | |
| 5-гидроксиметил-2'-Дезоксицитидин | 258,2 | 142.1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0.6 | 1,98 | 0.993 | |
| 5-формил-2'-Дезоксицитидин | 256.2 | 140.1 | 10.92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0.2 | 0.66 | 0,998 | |
| 5-карбоксильную-2'-Дезоксицитидин | 272.2 | 156.1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12.87 | 0.993 | |
Таблица 3: Оптимизированные параметры LC-MS/MS четыре природных ДНК нуклеозидов и различные цитозина производных режиме положительных ионов. Для каждого родительского Ион нуклеозидов (Q1) был обнаружен наиболее интенсивные продукт Ион (Q3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мутации в гене TET2 являются одними из наиболее часто обнаруживаемые генетические изменения у больных с различными гемопоэтических злокачественных. На сегодняшний день сотни различных TET2 мутации, которые включают нонсенс, рамка shift и Миссенс-мутации, были определены12пациентов. У больных с TET2 перегласовок показывают низкий уровень геномной 5hmC костного мозга по сравнению с теми с wt-TET214. Черепашки TET2 стучите в эксперименты резюмировалась воздействие этих мутаций на уровнях 5hmC в transfected клеток14. Результаты от TET2-нокаут мыши модели показали, что уровень фермента TET2 обратно коррелирует с прогрессии злокачественных опухолей кроветворной17,18,19,20. Последовательно, Zhang et al. недавно продемонстрировали что вниз регулирование TET2 уровни выражения является потенциальным прогностические и прогнозирования биомаркера в cytogenetically нормальной острый миелолейкоз27.
Несмотря на растущие доказательства того, что TET2 играет основополагающую роль в нормальное кроветворение и миелоидного трансформации, биохимическая характеристика wt - и мутанта TET2 остаются на элементарные стадии из-за трудностей, связанных с производством активных TET2 и ее анализа. Большинство исследований дали рекомбинантной TET2 либо с использованием времени бакуловирусы системы насекомых клетки14, или как глутатион S-трансферазы сродство тег в бактериальных клетках, который требует удаления близости тег21.
В этой экспериментальной процедуре мы описали, клонирование непомеченным человека TET2 dioxygenase каталитического домена с использованием техники участкам рекомбинации и его эффективного выражения с помощью назначения вектор (pDEST14) в E. coli. Потому что Изоэлектрическая точка непомеченным TET2 сравнительно высока (∼7.49) по сравнению с наиболее коренных E. coli белков, мы разработали процесс эффективной очистки, используя катионообмен хроматографии приносит > 90% чистой непомеченные TET2 фермента в один шаг.
Кроме того, дополнительные проблемы существуют в квантификации wt - и мутанта TET2 dioxygenase деятельности. Для этих экспериментов, большинство исследований полагались на основе антител анализов, такие как точка кляксы14,28, иммуноферментного assays (ELISA)29и т.д. , потому что эти анализы, как правило, используют только один антител, например 5hmC или or5caC 5fC, для обнаружения 5мс модификации в субстрат ДНК, они не дают полную картину о каталитической реакции, перевозимых тет изоформ. По этим причинам LC-MS/MS-на основе анализа стала только проба для количественного определения различных цитозина изменения. В этой связи мы разработали метод Роман жидкостной хроматографии, который можно разделить четыре обычных оснований ДНК (A, T, G и C), а также четырех баз модифицированных цитозином (5мс, 5hmC, 5 ФК и 5caC).
Для количественной оценки восьми нуклеозидов от TET2 катализируемых реакций, мы сочетании наш метод улучшения жидкостной хроматографии с тандем масс-спектрометрии. Этот assay чувствительных LC-MS/MS затем был использован для определить активность рекомбинантного непомеченным человеческого фермента TET2. Подход, описанный здесь значительно повысит оценки деятельности, wt - и мутанта dioxygenase TET2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют без финансовых интересов объявить.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось министерством обороны США в виде идея премии (W81XWH-13-1-0174), апластической анемии и Грант Фонда MDS, и Грант UMRB м.м. авторам спасибо Mohit Jaiswal и Subhradeep Bhar для первоначального клонирования TET2 в pDEST14 вектора.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
