Name: Purificazione efficiente e sviluppo di analisi LC-MS/MS-based per dieci-undici traslocazione-2 5-metilcitosina diossigenasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Impara la purificazione efficiente di TET2 mediante cromatografia a scambio ionico e l'analisi dell'attività con LC-MS/MS. Questo metodo consente di studiare mutazioni normali e cliniche nel campo dell'epigenetica.

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Questa ricerca è stata finanziata dal dipartimento della difesa sotto forma di un'Idea Award (W81XWH-13-1-0174), Anemia aplastica & MDS Foundation Grant e grant UMRB a M.M. Authors ringraziare Mohit Jaiswal e Subhradeep Bhar per clonazione iniziale di TET2 nel vettore pDEST14.

1. clonazione e purificazione di TET2 umana senza tag diossigenasi
<ol><li>Clone umano TET2 diossigenasi (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) nel vettore pDEST14 destinazione usando la tecnica di ricombinazione site-specific come descritto in precedenza22. Nota: Gli studi precedenti hanno dimostrato che il dominio C-terminale TET2 diossigenasi (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) è il minimo cataliticamente attiva dominio21,23. Per poter esprimere senza tag TET2 diossigenasi dominio utilizzando il vettore pDONR221, sequenze di Shine Dalgarno e Kozak sono state incorporate nell'iniettore in avanti durante la PCR (tabella 1).</li>
	<li>Per trasformazione batterica, aggiungere 1 µ l di vettore di espressione pDEST14 ricombinante contenente diossigenasi TET2 umana senza tag (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) a 100 µ l di chimicamente competente e. coli BL21 (DE3) cellule in un tubo di 1,7 mL. Mantenere la miscela sul ghiaccio per almeno 15 minuti, seguita da shock termico a 42 ° C per 30 s in un bagno d'acqua.<ol>
<li>Immediatamente dopo la scossa di calore, mantenere le cellule torna sul ghiaccio per minimo di 2 min. In seguito, aggiungere 250 µ l di brodo super ottima con la repressione dei cataboliti (S.O.C media) alle celle. Incubare le cellule batteriche per 1h a 37 ° C in un agitatore.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, rotazione verso il basso le cellule mediante centrifugazione il tubo a 9.000 x g per 1 min. Discard 70% surnatante pipettando e dissolva la pallina a sinistra sopra la media.</li>
		<li>Diffondere la sospensione cellulare su una piastra di agar di brodo (LB) di Luria contenente ampicillina di 100 µ g/mL. Incubare la piastra per 16 h a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare una colonia isolata e inoculare esso in 10 mL di terreno LB-ampicillina in una provetta da 50 mL. Incubare la provetta a 37 ° C in un agitatore per il pernottamento. In seguito, è possibile utilizzare 100 µ l di cultura dal tubo 50 mL per inoculare 100 mL di terreno LB-ampicillina. Incubare la beuta a 37 ° C in un agitatore a 180 giri/min e usarlo come coltura primaria. Giorno successivo, utilizzare 6 mL ciascuno di coltura primaria per inoculare 15 boccette, ciascuna contenente media mL 600 LB-ampicillina. Ora, Incubare 15 matracci a 37 ° C in un agitatore a 180 giri/min. Nota: Per la verifica di cloni trasformati, eseguire la digestione di restrizione o sequenziamento del DNA con il DNA del plasmide isolato.</li>
	<li>Per controllare la densità di coltura batterica, misurare sua OD600 utilizzando uno spettrofotometro. Dopo la cultura raggiunge una densità di 0,8 a OD600, indurre l'espressione della proteina TET2 con 300 µ l di 1 M (concentrazione finale di 0,5 mM in 600 mL) IPTG in ciascuna beuta e crescere ulteriormente la cultura per 16 h a 17 ° C.</li>
	<li>Dopo le 16h, trasferire la coltura batterica a centrifuga bottiglie. Centrifugare la coltura batterica che esprimono l'enzima TET2 a 5.250 x g per 45 min. uso il pellet batterico per TET2 purificazione. Nota: Eseguire tutti i passaggi di purificazione della proteina rimanenti sul ghiaccio o a 4 ° C.</li>
	<li>Risospendere il pellet batterico in 100 mL di 50mm MES (2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido) tampone, pH 6 e Sonicare per 5 × 30 s a potenza 20 con intervalli di raffreddamento di 60 s.</li>
	<li>Spin il lisato a 5.250 x g per 45 min. raccolta il surnatante contenente l'enzima TET2 solubile e passa attraverso 0,45 µm filtri prima di caricarla su un sistema FPLC. Nota: In questi esperimenti, l'enzima di TET2 era molto stabile, ma se necessario una proteasi inibitore cocktail contenenti 1 mM benzamidine-HCl, fenilmetilsolfonilfluoruro 1 mM (PMSF) e 0,5 mM 1,10 -o- fenantrolina può essere aggiunto alla cella lysata per prevenire il degrado di TET2 enzima. Evitare di utilizzare EDTA o EGTA nell'inibitore cocktail in quanto questi potrebbero interferire con la cromatografia di scambio cationico seguente.</li>
	<li>Confezione da 30 mL di una resina a scambio cationico forte in una colonna FPLC. Equilibrare la colonna con 10 volumi di letto di tampone di lavaggio (tampone MES 50 mM, pH 6) presso il tasso di flusso costante di 0,3 mL/min utilizzando un sistema FPLC.</li>
	<li>Caricare il chiarificato lisato nella colonna pre-equilibrato e lavare con ∼10 il volume del letto del tampone di lavaggio fino a quando il flusso attraverso diventa chiaro.</li>
	<li>Eluire TET2 usando un 0-100% di pendenza dal tampone di lavaggio per il buffer di eluizione (tampone MES 50 mM, pH 6, NaCl di 1m) in 15 volumi di letto seguita da holding al tampone di eluizione di 100% per i volumi di due letti. Nota: Raccogliere campioni (100 µ l) di cella lysata prima e dopo la colonna di carico insieme a tutte le frazioni di eluizione e analizzare il 10% SDS-PAGE di risoluzione.</li>
	<li>Piscina le frazioni contenenti proteina TET2, congelare asciutto, sciogliere pallet di enzima in 10 mL di acqua e conservare a-80 ° C.</li>
</ol>2. 5mC ossidazione di TET2 diossigenasi
<ol><li>Eseguire tutte le reazioni di demetilazione in triplice copia con 3 µ g del substrato (25-mer DNA a doppio filamento, tabella 2).<ol>
<li>Aggiungere 100 µ g di enzima purificato di TET2 in 50 µ l di tampone di reazione totale contenente 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 µM FeSO4, 2mm 2OG (2-ossoglutarato/α-chetoglutarato) e 2 mM l'ascorbato e incubare a 37 ° C per 1 h21.</li>
		<li>Placare le reazioni di ossidazione di TET2 catalizzata con 5 µ l di 500 mM EDTA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo tempra reazioni di TET2, preparare i campioni per analisi LC-MS/MS separando il DNA dalla miscela di reazione di TET2 utilizzando colonne di purificazione di oligo.<ol>
<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di associazione di oligo a 55 µ l di reazione estiguuto.</li>
		<li>In seguito, aggiungere 400 µ l di etanolo al 100% per la miscela. Passare questa miscela attraverso una colonna di associazione oligo.</li>
		<li>Lavare il DNA associato con 750 µ l di tampone di lavaggio ed eluire in acqua di 20 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digerire il DNA isolato con 2 unità di dnasi I e 60 unità di nucleasi S1 a 37 ° C per 12 h per produrre singoli nucleosidici-monofosfati.</li>
	<li>A seguito di digestione, aggiungere 2 unità della fosfatasi alcalina intestinale di vitello (CIAP) nei campioni e incubare per oltre 12 ore a 37 ° C per rimuovere i gruppi fosfato terminale da nucleosidici-monofosfati ottenere nucleosidi.</li>
	<li>Quantificare tutti i nucleosidi, specialmente modificate cytosines, utilizzando il metodo di LC-MS/MS descritto di seguito.</li>
</ol>3. sviluppo di analisi LC-MS/MS-based quantitativa
<ol><li>DNA normale basi (adenina, e preparare la soluzione di riserva 100 µM di tutti i nucleosidi modificati citosina [5-metil-2 '-deoxycytidine (5mdC), 5-idrossimetil-2 '-deoxycytidine (5hmdC), 5-formil-2 '-deoxycytidine (5fdC) e 5-carbossi-2 '-deoxycytidine (5cadC)] timina, citosina e guanina) in acqua di grado HPLC per lo sviluppo del metodo LC-MS/MS.</li>
	<li>Ottimizzare i parametri di MS/MS di nucleosidici-dipendente mediante infusione di soluzioni di riserva, uno alla volta, in uno spettrometro di massa ad una portata di 10 µ l/min a EMS modalità di scansione. Ottimizzare i seguenti parametri: Declustering potenziale (DP), ingresso potenziale (EP), collisione cella ingresso potenziale (CEP), energia di collisione (CE) e collisione cella uscita potenziale (CXP) per ogni utilizzo di analoghi nucleosidici DNA automatizzato ottimizzazione quantitativa funzionalità del software.</li>
	<li>Ottimizzare i parametri di MS/MS di origine-dipendente da iniettare 10 µ l di soluzione madre utilizzando un gradiente con solvente B al 25% ad una portata di 0,3 mL/min dove solvente A è 10 mM ammonio acetato (pH 4.0) e solvente B è 20% acetonitrile con acetato di ammonio 10 mM (pH 4.0). Ottimizzare i seguenti parametri: tenda Gas (CUR): 10-50, temperatura: 0-600 ° C, Gas Flow 1 (GS1): 0-50, Gas Flow 2 (GS2): 0-50, dissociazione collisioni attivato (CAD): bassa-media-alta, Ion spruzzo tensione (IS): 4000-5500 per ogni nucleosidici DNA facendo uso del manuale funzionalità di ottimizzazione quantitativa del software in modalità FIA (Flow Injection Analysis).</li>
	<li>Per separare tutti i nucleosidi di DNA otto, eseguire cromatografia liquida utilizzando il seguente gradiente: solvente B 0% (0-2 min), 0-20% di solvente B (2-5 min.), 20-60% di solvente B (5-9 min.), solvente di 60-0% B (9-10 min) e poi equilibrare con solvente A per 5 min ad una portata di 0,3 mL/min su una colonna C18 (dimensione delle particelle: 5 µm, dimensione dei pori: 120 Å).</li>
	<li>Utilizzando i parametri ottimali di MS/MS (passo 3.2 e 3.3) accoppiati con il gradiente di cromatografia liquida di cui sopra (punto 3.4), determinare la linearità di risposta, limite di rilevabilità (LOD) e limite inferiore di quantificazione (LLOQ) utilizzando un duplice diluizione seriale di una miscela standard di 100 µM contenenti tutti i otto nucleosidi. Disegnare curve standard per tutte le otto nucleosidi di DNA.</li>
	<li>Rilevare e quantificare tutti i nucleosidi, specialmente modificate cytosines, prodotte nel passaggio 2.4 utilizzando il metodo di LC-MS/MS e curve standard.</li>
</ol>

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<li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-Eleven-Translocation+2+%28TET2%29+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li>
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<li>Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nessun interessi finanziari di dichiarare.

Mutazioni nel gene TET2 sono alcuni dei cambiamenti genetici più frequentemente rilevati in pazienti con malignità ematopoietiche diversificata. Ad oggi centinaia di diverse mutazioni di TET2, sono sciocchezze, frame-shift e mutazioni di senso sbagliato, sono state identificate in pazienti12. Pazienti con mutazioni di TET2 mostrano bassi livelli di genomica 5hmC nel midollo osseo rispetto a quelli con wt-TET214. TET2 mutante knock-in esperimenti hanno rica...

La posizione di C5 della citosina basi all'interno di dinucleotidi CpG è il sito di metilazione predominante (5mCpG) nel genoma di mammiferi1. Inoltre, una serie di studi recenti hanno scoperto vasta metilazione della citosina C5 (5mC) in siti non-CpG (5mCpH, dove H = A, T, o C)2,3. modifica di 5mc serve come un silenziatore trascrizionale retrotrasposoni endogeno e gene promotori3,4,5. La metilazione del DNA a 5mC inoltre svolge ruoli importanti nell'inattivazione del cromosoma X, gene imprinting, riprogrammazione nucleare e genica tessuto-specifica espressione5,6,7. La metilazione della citosina nella posizione C5 è svolta da methyltransferases del DNA e le mutazioni in questi enzimi causano difetti inerenti allo sviluppo significativo8. La rimozione di segni di 5mC vengono avviate da TET1-3 5mC ossidasi9,10. Questi diossigenasi TET-famiglia convertono 5mC in 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) di ossidazione sequenziale passaggi11,12,13. Infine, timina-DNA glicosilasi sostituiscono 5fC o 5caC a citosina non modificato utilizzando riparazione bassa di asportazione percorso11.
Il gene TET2 umano è stato identificato come un gene mutato frequentemente in varie malignità ematopoietiche compreso myelodysplastic (MDS) le sindromi14,15,16, neoplasie mieloproliferative MDS ( MDS-MPN) e leucemia mieloide acuta (AML) provenienti da MDS e MDS-MPN16. I livelli di modificazione di 5hmC nel midollo osseo del DNA sono più bassi nei pazienti con mutazioni di TET2 rispetto a quelli con wild type (wt)-TET214. Alcuni gruppi hanno sviluppato modelli murini TET2 knock-out per delucidare il suo ruolo nell'ematopoiesi normale e trasformazione mieloide17,18,19,20. Questi topi con mutazioni del gene TET2 erano inizialmente normale e praticabile, ma manifesta varie malignità ematopoietiche come età causando la loro morte prematura. Questi studi hanno dimostrato il ruolo importante svolto da wt-TET2 nel differenziamento ematopoietico normale. In questi modelli di topo, cellule staminali ematopoietiche eterozigoti (TET2+ /- HSCs) e omozigotica TET2- / - HSCs aveva un vantaggio competitivo rispetto omozigoti wt-TET2 HSCs a ripopolare filiere emopoietiche come entrambi TET2+ /- e TET2- / - HSCs sviluppato varie malignità ematopoietiche17,18. Questi studi dimostrano che il haploinsufficiency di TET2 diossigenasi altera lo sviluppo di HSCs e risultati nelle malignità ematopoietiche.
Simili ai topi con mutazioni del gene TET2, maggior parte dei pazienti affetti da leucemia manifestano haploinsufficiency di TET2 diossigenasi attività. Queste mutazioni somatiche principalmente eterozigoti comprendono mutazioni frame-shift e sciocchezze dislocate in tutto il corpo del gene TET2 mentre mutazioni missenso che sono la maggior parte dei cluster nel dominio diossigenasi12. Fin qui, poco caratterizzazione di TET2 wt e mutante è segnalato nella letteratura principalmente a causa di difficoltà con la produzione di TET2 diossigenasi e relativi test21. Qui, segnaliamo un semplice singolo passaggio di purificazione del nativo dioxygenase di TET2 mediante cromatografia a scambio ionico. Ulteriormente, un dosaggio quantitativo di LC-MS/MS è stato ottimizzato e utilizzato per misurare l'attività enzimatica di nativo TET2 diossigenasi.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Carbosynth</td><td>FH31182</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ferro (II) eptaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8633</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Acido chetoglutarico (acido 2-ossoglutarico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1750</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminetraacetico sale disodico diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Oligo pulito e concentratore</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>S1 Nucleasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>ENO321</td><td></td></tr><tr><td>CIAP (Fosfatasi alcalina intestinale di vitello)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>LB Media</td><td>Affymetrix</td><td>J75852</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Carbosynth</td><td>EI05931</td><td></td></tr><tr><td>MES [2-(N-Morpholino)acido etansolfonico monoidrato]</td><td>Carbosynth</td><td>FM37015</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientifico</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>SP Sepharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-002-934</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deossi-5-metilcitidina</td><td>TCI</td><td>D3610</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deossi-5-idrossimetialcitidina</td><td>TCI</td><td>D4220</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deossicitidina-5-acido carbossilico, sale di sodio</td><td>Berry & Amp; Associates</td><td>PY 7593</td><td></td></tr><tr><td>5-Formil-2'-deossicitidina</td><td>Bacca & Associati</td><td>PY 7589</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deossicitidina</td><td>Bacca & Associates</td><td>PY 7216</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deossiadenosina</td><td>Carbosynth</td><td>ND04011</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deossiguanosina</td><td>Carbosynth</td><td>ND06306</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deossitimidina</td><td>VWR Life Science</td><td>97061-764</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologia gateway</td><td>Thermo Fisher</td><td>11801016</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Allegra X-15R centrifuga&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Smembratore Sonico 550</td><td>Fisher Scientific</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Sistema KTA FPLC</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>18116468</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di liofilizzazione FreeZone 4.5 Colonne di purificazione</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td></td></tr><tr><td>Zymo Oligo</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>BDS Hypersil C18 colonna</td><td>Keystone Scientific, INC</td><td>105-46-3</td><td></td></tr><tr><td>3200 Spettrometro di massa Q-Trap</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC&nbsp;</td><td>Shimadzu HPLC&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna FPLC XK16/20</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>28988937</td><td></td></tr></tbody></table>

purificazione efficiente e sviluppo di analisi lc-ms/ms-based per dieci-undici traslocazione-2 5-metilcitosina diossigenasi

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

La regolazione della trascrizione epigenetica mediata da 5-metilcitosina (5mC) ha svolto un ruolo critico nello sviluppo eucariotico. Demetilazione di questi segni epigenetici avviene mediante ossidazione sequenza di dieci-undici traslocazione diossigenasi (TET1-3), seguita dalla riparazione bassa di asportazione glicosilasi-dipendente timina-DNA. Inattivazione del gene TET2 a causa di mutazioni genetiche o da altri meccanismi epigenetici è associato con una prognosi difficile in pazienti con diversi tipi di cancro, specialmente malignità ematopoietiche. Qui, descriviamo una purificazione efficiente singolo passaggio di enzimaticamente attivo dioxygenase di TET2 umana senza tag mediante cromatografia a scambio cationico. Forniamo inoltre un approccio liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS) che può separare e quantificare le quattro basi di DNA normale (A, T, G e C), così come le quattro basi modificate citosina (5-metil, 5-idrossimetil, 5-formil e 5-carbossilico). Questa analisi può essere usata per valutare l'attività del wild type e mutanti TET2 diossigenasi.

Modifica dinamica di 5mC nel DNA di diossigenasi TET-famiglia svolge i ruoli importanti nel regolamento trascrizionale epigenetica. Dioxygenase di TET2 è frequentemente mutato in varie malignità ematopoietiche12. Per studiare il ruolo dell'enzima TET2 nello sviluppo normale e nella malattia, abbiamo clonato il suo dominio cataliticamente attivo minimo senza qualsiasi tag di affinità nel vettore pDEST1422. Il dioxygenase di TET2 senza tag è s...

Qui, presentiamo un protocollo per una purificazione efficiente unico passaggio dell'essere umano senza tag attivo dieci-undici traslocazione-2 (TET2) 5-metilcitosina diossigenasi usando la cromatografia a scambio ionico e sua analisi utilizzando una massa liquida di cromatografia-tandem spettrometria (LC-MS/MS)-approccio basato.

Purificazione efficiente e sviluppo di analisi LC-MS/MS-based per dieci-undici traslocazione-2 5-metilcitosina diossigenasi

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in epigenetica e tet2 mediato campo di demetilazione 5-metilcitosina tale analisi dell'attività delle mutazioni TET2 normali e cliniche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il TET2 nativo può essere purificato in un unico passaggio e la sua attività può essere analizzata in termini di formazione di tutti e tre i prodotti. Diversi laureati diranno la procedura.La purificazione delle proteine sarà eseguita da Chayan Bhattacharya, il saggio TET2 di Aninda Sundary Dey e l'analisi LC-MS/MS di Navid Ayon. Per la trasformazione batterica, aggiungere un microlitro di vettore di espressione di destinazione pDEST 14 ricombinante contenente TET2 diossigenasi umana non registrata a 100 microlitri di cellule E.coli BL21 DE3 chimicamente competenti in un tubo da 1,7 millilitri. Dopo l'incubazione sul ghiaccio per almeno 15 minuti, scaldare la miscela a 42 gradi Celsius per 30 secondi in un bagno d'acqua.Immediatamente dopo lo shock termico, riposizionare le cellule sul ghiaccio per un minimo di due minuti. In seguito, aggiungi 250 microlitri di brodo super ottimale con la repressione dei cataboliti alle cellule. Incubare le cellule batteriche per un'ora a 37 gradi Celsius in uno shaker.Dopo l'incubazione, spingi le cellule centrifugando il tubo a 9.000 volte la gravità per un minuto. Scartare il 70% del supernatante con la pipettazione e sciogliere il pellet nel supporto rimanente. Stendere la sospensione cellulare su una piastra di agar di brodo Lirua contenente 100 microgrammi per ampicillina millilitro.Incubare la piastra per 16 ore a 37 gradi Celsius. Selezionare una colonia isolata e inocularla in 10 millilitri di mezzi di ampicillina LB. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius in uno shaker durante la notte.In seguito, utilizzare 100 microlitri di coltura batterica per inoculare 100 millilitri di mezzi di ampicillina LB come coltura primaria. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius in uno shaker durante la notte. Il giorno successivo, inoculare 15 mastri, ognuno contenente 600 millilitri di mezzi di ampicillina LB con sei millilitri di coltura primaria per pallone.Incubare i contenitori a 37 gradi Celsius su uno shaker a 180 giri/min. Per controllare la densità della coltura batterica, misurare la sua densità ottica a 600 nanometri, o OD600, usando uno spettrofotometro. Dopo che la coltura raggiunge una densità di 0,8 a OD600, indurre l'espressione della proteina TET2 con 300 microlitri di un IPTG molare in ogni pallone e far crescere la coltura per altre 16 ore a 17 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, trasferire la coltura batterica in bottiglie di centrifuga. Centrifugare la coltura batterica esprimendo l'enzima TET2 a 5.250 volte la gravità per 45 minuti. Utilizzare il pellet batterico per la purificazione TET2.Lavorando sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius, sospendere di nuovo il pellet batterico in 100 millilitri di tampone MES da 50 millimolare, pH sei. Quindi prendere cinque millilitri della sospensione cellulare e portarlo a 45 millilitri con il tampone. Sonicare la sospensione per cinque volte 30 secondi a potenza 20, con intervalli di raffreddamento di 60 secondi.Ruotare il lysate a 5.250 volte la gravità per 45 minuti. Raccogliere il supernatante contenente l'enzima TET2 solubile e passarlo attraverso filtri da 0,45 micron prima di caricarlo su un sistema FPLC. Imballare 30 millilitri di una forte resina scambiata di cationi in una colonna FPLC.Equilibrare la colonna con 10 volumi di tampone di lavaggio alla portata costante di 0,3 millilitri al minuto utilizzando un sistema FPLC. Caricare il llysate chiarificato sulla colonna pre-equilibrata e lavare con circa 10 volumi di letto di tampone di lavaggio fino a quando il flusso non diventa chiaro. Elute TET2 con una sfumatura da zero a 10% dal buffer di lavaggio al buffer di eluizione in 15 volumi di letto, seguito da un blocco al buffer di eluizione del 10% per due volumi di letto.Raccogliere 100 campioni di microliter di lisato cellulare prima e dopo il caricamento della colonna, insieme a tutte le frazioni di eluizione, e analizzare sul gel SDS-PAGE risolutivo al 10%. Mettere in comune le frazioni contenenti proteine TET2 e congelare la proteina. Quindi sciogliere l'enzima in 10 millilitri di acqua e conservare a meno 80 gradi Celsius.Eseguire tutte le reazioni di demetilazione in triplice copia con tre microgrammi di substrato. Aggiungere 100 microgrammi di enzima TET2 purificato a 50 microlitri di tampone di reazione totale. Dopo un'ora di incubazione a 37 gradi, dissetare le reazioni di ossidazione catalizzate da TET2 con cinque microlitri di EDTA da 500 millimolari.Per preparare campioni per l'analisi, separare il DNA dalla miscela di reazione TET2 aggiungendo prima 100 microlitri di tampone di legame Oligo a 55 microlitri di reazione temprato. In seguito, aggiungere 400 microlitri di 100% di etanolo alla miscela. Passare questa miscela attraverso una colonna di legame Oligo.Dopo aver lavato il DNA legato con 750 microlitri di tampone di lavaggio, elutare il DNA in 20 microlitri di acqua. Ora, digerire il DNA isolato con due unità di DNA I e 60 unità di nucleasi S1 a 37 gradi Celsius per 12 ore per produrre singoli monofosfati nucleoside. Dopo la digestione, aggiungere due unità di fosfatasi alcalina intestinale del polpaccio ai campioni.Incubare per un'aggiunta di 12 ore a 37 gradi Celsius per rimuovere i gruppi fosfatici terminali dai monofosfati nucleoside e ottenere i nucleosidi. Preparare una soluzione di stock di 100 micromolari di tutti i nucleosidi citosina modificati e le normali basi di DNA in acqua di grado HPLC per lo sviluppo del metodo LC-MS/MS. Ottimizzare i parametri MS/MS nucleoside-dipendenti infondendo soluzioni stock una alla volta nello spettrometro di massa a una portata di 10 microlitri al minuto in modalità di scansione MS avanzata.Diversi parametri possono essere ottimizzati utilizzando la funzione di ottimizzazione quantitativa automatizzata del software per ogni nucleoside del DNA. A questo punto, ottimizzare i parametri rimanenti per ogni nucleoside del DNA utilizzando la funzione di ottimizzazione quantitativa manuale del software in modalità di analisi dell'iniezione di flusso. Ora, ottimizza i parametri MS/MS dipendenti dalla sorgente iniettando 10 microlitri di soluzione stock utilizzando un gradiente con il 25% di solvente B a una portata di 0,3 millilitri al minuto.Per separare tutti e otto i nucleosidi del DNA, eseguire la cromatografia liquida come descritto nel protocollo di testo su una colonna C18. Infine, rilevare e quantificare tutti i nucleosidi utilizzando il metodo LC-MS/MS nelle curve standard. Poiché il dominio catalitico del TET2 ha un punto isoelettrico relativamente alto rispetto alla maggior parte delle proteine indigene E.coli, è stato sviluppato un efficiente processo di purificazione che utilizza una cromatografia a scambio di cationi.Questa purificazione ha prodotto un enzima TET2 puro superiore al 90% in un unico passaggio. Al fine di separare e quantificare diversi derivati della deossicitidina e le quattro basi naturali di DNA a seguito della reazione enzimatica TET2, è stato ottimizzato un saggio sensibile a base di LC-MS/MS. Le curve standard sono state disegnate utilizzando diluizioni seriali di una miscela contenente tutti i nucleosidi.I risultati della cromatografia liquida metodo MS/MS sono mostrati qui. Il metodo consente la separazione e la quantificazione delle quattro normali basi di DNA, così come delle quattro basi di citosina modificate. In questa procedura sperimentale, descriviamo la clonazione di dominio catalitico tet2 umano senza ostazioni utilizzando la tecnica di ricombinazione specifica del sito e un'espressione sufficiente in un vettore di destinazione in E.Coli.Abbiamo purificato in modo efficiente l'enzima TET2 non registrato utilizzando la cromatografia a scambio di cationi per produrre una purezza superiore al 90% in un unico passaggio. Inoltre, abbiamo sviluppato un nuovo metodo di cromatografia liquida per separare le quattro normali basi di DNA e le quattro basi di citosina modificate. Per quantificare gli otto nucleosidi delle reazioni catalizzate da TET2, abbiamo accoppiato il nostro metodo di cromatografia liquida migliorato con la spettrometria di massa tandem.Il saggio sensibile LC-MS/MS è stato quindi utilizzato per determinare l'attività dell'enzima TET2 umano non appiccato ricombinante. L'approccio qui descritto migliorerà notevolmente la valutazione della tet2 diossigenasi di tipo selvatico e mutante.

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Un metodo di cultura alternativa per mantenere l'ipometilazione genomica delle cellule staminali embrionali del Mouse utilizzando PD0325901 inibitore MEK e vitamina C

Protocolli dettagliati per l'introduzione di un enzima derivati dal Spalato-TET2 (sidro) nelle cellule di mammiferi per chimica viscoelastica DNA hydroxymethylation e rimodellamento epigenetici sono presentati.

Un enzima Split-TET2 ingegnerizzati per chimica-inducible DNA Hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico

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La Lambda selezionare cII , sistema di rilevazione di mutazione

Protocatechuate 3,4-diossigenasi (PCD) può rimuovere ezimaticamente l'ossigeno diatomico libero da un sistema acquoso utilizzando il suo acido protocatechuico del substrato (PCA). Questo protocollo descrive l'espressione, la purificazione e l'analisi dell'attività di questo enzima di scavenging dell'ossigeno.

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Viene descritto un protocollo per la rilevazione sensibile e quantitativa dell'attività della topoisomerasi 1 utilizzando il saggio di rilevamento dell'attività enzimatica potenziata del rolling circle. Il metodo consente di rilevare l'attività della topoisomerasi 1 da componenti purificati o estratti di cellule/tessuti. Questo protocollo ha applicazioni ad ampio raggio in qualsiasi campo che coinvolga il rilevamento dell'attività enzimatica.

Rilevazione semplice e veloce basata sull'amplificazione del cerchio di rotolamento dell'attività della topoisomerasi 1 in campioni biologici grezzi

Qui, presentiamo una raccolta di saggi per misurare direttamente la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero indipendentemente dalla loro capacità di consumare ossigeno molecolare.

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

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Screening della modificazione degli istoni mediante cromatografia liquida, spettrometria di mobilità ionica intrappolata e spettrometria di massa a tempo di volo

Impara la purificazione efficiente di TET2 mediante cromatografia a scambio ionico e l'analisi dell'attività con LC-MS/MS. Questo metodo consente di studiare mutazioni normali e cliniche nel campo dell'epigenetica.

Purificazione efficiente e sviluppo di analisi LC-MS/MS-based per dieci-undici traslocazione-2 5-metilcitosina diossigenasi

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