Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des aktiven unmarkierten Menschen zehn-elf Translokation-2 (TET2) 5 Methylcytosine Dioxygenase mit Ionenaustausch Chromatographie und seine Assay mit eine flüssige Chromatographie-Tandem-Masse Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Ansatz.
Abstract
Die epigenetische Transkription Verordnung vermittelt durch 5-Methylcytosine (5mC) hat in eukaryotischen Entwicklung eine entscheidende Rolle gespielt. Demethylierung dieser epigenetischen Markierungen geschieht durch sequentielle Oxidation durch zehn-elf Translokation Dioxygenases (TET1-3), gefolgt von Thymin-DNA-Glycosylase-abhängige base Excision Repair. Inaktivierung des Gens TET2 aufgrund von genetischen Mutationen oder durch andere epigenetischen Mechanismen ist verbunden mit einer schlechten Prognose bei Patienten mit verschiedenen Krebsarten, vor allem hämatopoetischen Malignome. Hier beschreiben wir eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des enzymatisch aktive unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase mit KATIONENAUSTAUSCH-Chromatographie. Weiter bieten wir einen flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Ansatz, der trennen und die vier normale DNA-Basen (A, T, G und C), sowie die vier modifizierte Cytosin-Basen (5-Methyl, 5-Hydroxymethyl, 5-Formyl und 5-Carboxylgruppen) zu quantifizieren. Dieser Test kann verwendet werden, um die Aktivität der Wildtyp und Mutanten TET2 Dioxygenases zu bewerten.
Introduction
Die C5-Position von Cytosin-Basen innerhalb von CpG dinucleotid ist die vorherrschende Methylierung-Website (5mCpG) in Säugetier-Genome1. Eine Reihe neuerer Studien haben darüber hinaus umfangreiche C5 Cytosin Methylierung (5mC) in nicht-CpG Websites entdeckt (5mCpH, wo H = A, T, oder C)2,3. 5mC Änderung dient als transkriptioneller Schalldämpfer bei endogenen Retrotransposons und Gen Promotoren3,4,5. DNA-Methylierung bei 5mC spielt auch eine wichtige Rolle im x-Chromosom Inaktivierung, gen Prägung, nukleare Neuprogrammierung und gewebespezifische Gen Ausdruck5,6,7. Methylierung von Cytosin an der C5-Position erfolgt durch DNA-Methyltransferasen und Mutationen in diesen Enzymen verursachen erhebliche Entwicklungsschäden8. Die Entfernung von 5mC Marken werden von TET1-3 5mC oxidasen9,10initiiert. Diese Dioxygenases TET-Familie wandeln 5mC in 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-FU) und 5-Carboxylcytosine (5caC) durch sequentielle Oxidation Schritte11,12,13. Schließlich ersetzt Thymin-DNA-Glycosylase 5fC oder 5caC zu unveränderten Cytosin mit base Excision Repair Weg11.
Das menschliche Gen TET2 wurde als ein häufig mutierte Gen in vielfältigen hämatopoetischen Malignome einschließlich myelodysplastischen Syndromen (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferative Neoplasmen (identifiziert. MDS-MPN), und akute myeloische Leukämie (AML) aus MDS und MDS-MPN16. Die Höhe der 5hmC Änderung im Knochenmark DNA sind niedriger bei Patienten mit TET2 Mutationen im Vergleich zu denen mit Wildtyp (wt)-TET214. Eine Anzahl von Gruppen entwickelten TET2-Knockout-Maus-Modellen um ihre Rolle bei der normalen Hämatopoese und myeloischer Transformation17,18,19,20zu erhellen. Diese Mäuse mit Mutationen im TET2-gen wurden zunächst normal und lebensfähig, aber vielfältige hämatopoetischen Malignome manifestiert, als sie im Alter von ihrem frühen Tod verursacht. Diese Studien zeigten die wichtige Rolle der wt-TET2 in normaler Hämatopoetischer Differenzierung. Diese Maus-Modellen, die heterozygot Hämatopoetischen Stammzellen (TET2+ / HSCs) und homozygot TET2- / - hatte HSCs einen Wettbewerbsvorteil gegenüber homozygot wt-TET2 HSCs in repopulating hämatopoetische Linien als beide TET2+ /- und TET2- / - Hsz entwickelt vielfältige hämatopoetischen Malignome17,18. Diese Studien zeigen, dass Haploinsufficiency von TET2 Dioxygenase verändert die Entwicklung von Hsz und hämatopoetische Tumoren führt.
Ähnlich wie Mäuse mit Mutationen im TET2-gen, die meisten Leukämie-Patienten manifestieren Haploinsufficiency TET2 Dioxygenase Aktivität. Diese meist heterozygoten somatischen Mutationen sind Frame-Shift und Unsinn Mutationen, die verstreut im ganzen TET2 gen Körper während Missense-Mutationen, die meisten sind gruppiert in der Dioxygenase Domäne12. Bisher ist wenig Charakterisierung des wt und Mutant-TET2 in der Literatur vor allem aufgrund von Schwierigkeiten mit der Produktion von TET2-Dioxygenase und seine Assay21beschrieben. Hier berichten wir über einer einfachen einstufigen Läuterung der native TET2 Dioxygenase mit Ionenaustausch-Chromatographie. Darüber hinaus wurde eine quantitative LC-MS/MS-Assay optimiert und verwendet, um die enzymatische Aktivität von native TET2 Dioxygenase messen.
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Protocol
1. Klonen und Reinigung des unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase
- Klonen Sie menschlichen TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) in den pDEST14-Ziel-Vektor mit der ortsspezifische Rekombination Technik wie zuvor beschrieben22.
Hinweis: Frühere Studien haben gezeigt, dass die C-terminale TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) Domäne der minimalen katalytisch aktiven Domain21,23. Um die unmarkierten TET2 Dioxygenase Domäne mithilfe des pDONR221-Vektors auszudrücken, Flossen Shine-Dalgarno und Kozak-Sequenzen in der forward Primer während der PCR (Tabelle 1). - Für bakterielle Transformation hinzufügen 1 µL des rekombinanten pDEST14 Expressionsvektor mit unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843), 100 µL chemisch kompetenten E. Coli BL21 (DE3) Zellen in einer 1,7 mL Tube. Halten Sie die Mischung auf dem Eis für mindestens 15 Minuten, gefolgt durch einen Hitzeschock bei 42 ° C für 30 s in einem Wasserbad.
- Sofort nach der Hitzeschock halten Sie die Zellen wieder auf Eis für mindestens 2 Minuten. Im Anschluss daran fügen Sie 250 µL super optimale Brühe mit Catabolite Repression (S.O.C Medien ein) in Zellen Inkubieren Sie die Bakterienzellen für 1 h bei 37 ° C in einen Shaker geben.
- Nach der Inkubation spin-down der Zellen durch Zentrifugieren der Röhre bei 9.000 x g für 1 min. verwerfen 70 % Überstand durch pipettieren und das Pellet in Links über Medien zu lösen.
- Die Zellsuspension auf eine Luria Brühe (LB) Agarplatte mit 100 µg/mL Ampicillin zu verbreiten. Inkubieren Sie die Platte für 16 h bei 37 ° c
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie und in 10 mL LB-Ampicillin Medien in ein 50 mL-Tube zu impfen. Über Nacht inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C in einem Shaker. Im Anschluss daran verwenden Sie 100 µL der Kultur aus der 50 mL Tube 100 mL LB Ampicillin Medien zu impfen. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 ° C auf einem Boston-Shaker mit 180 u/min und verwenden Sie es als Primärkultur. Verwenden Sie am nächsten Tag 6 mL Primärkultur impfen 15 Flaschen, jede mit 600 mL LB Ampicillin-Medien. Jetzt, inkubieren Sie 15 Flaschen bei 37 ° C auf einem Boston-Shaker mit 180 u/min.
Hinweis: Führen Sie für die Überprüfung der transformierten Klone, DNA-Sequenzierung oder Einschränkung Verdauung mit isolierter Plasmid DNA. - Prüfen Sie die Dichte der Bakterienkultur, Messen Sie die OD600 mit einem Spektralphotometer. Nachdem die Kultur eine Dichte von 0,8 bei OD600erreicht, induzieren die Expression von TET2-Protein mit 300 µL 1 M (Endkonzentration von 0,5 mM in 600 mL) IPTG in jedem Kolben und weiteres Wachstum der Kultur für 16 h bei 17 ° C.
- Übertragen Sie nach 16 h die Bakterienkultur auf Zentrifuge Flaschen. Zentrifugieren Sie der Bakterienkultur mit dem Ausdruck TET2 Enzym bei 5.250 x g für 45 min. Einsatz der bakteriellen Pellets für TET2 Reinigung.
Hinweis: Führen Sie alle verbleibenden Protein Reinigungsschritte auf dem Eis oder bei 4 ° C. - Aufschwemmen der bakterielle Pellet in 100 mL 50 mM MES (2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure)-Puffer, pH 6 und 5 × 30 s bei Leistung 20 mit 60 s Kühlung Abständen beschallen.
- Spin lysate 5.250 x g für 45 min. sammeln den überstand enthält lösliche TET2 Enzym und durchlaufen 0,45-µm Filter vor dem Verladen auf einem FPLC-System.
Hinweis: In diesen Experimenten wurde die TET2 Enzym sehr stabil, aber ggf. eine Protease Inhibitor cocktail mit 1 mM Benzamidine-HCl, 1 mM Phenylmethylsulphonyl Fluorid (PMSF) und 0,5 mM 1,10 -o- Phenanthroline zugesetzt werden, um die Zelle lysate Abbau von TET2 Enzym verhindert. Vermeiden Sie die Verwendung von EDTA oder EGTA in der Inhibitor cocktail, als diese die folgenden KATIONENAUSTAUSCH Chromatographie stören können. - 30 mL Pack von einem starken kationenaustauschermembran Harz in einem FPLC Spalte. Equilibrate der Spalte mit 10 bettvolumen von Waschpuffer (50 mM-MES-Puffer, pH 6) bei konstantem Volumenstrom von 0,3 mL/min mit einem FPLC-System.
- Laden Sie die geklärte lysate auf Pre äquilibriert Spalte und Waschen mit ∼10 bettvolumen von Waschpuffer bis der Durchfluss deutlich wird.
- TET2 eluieren mit einem 0-100 % Steigung aus den Waschpuffer auf den Puffer, Elution (50 mM-MES-Puffer, pH 6, 1 M NaCl) in 15 bettvolumen gefolgt von zu 100 % Elution Buffer für zwei bettvolumen Betrieb.
Hinweis: Proben (100 µL) Zelle lysate, vor und nach der Spalte laden zusammen mit allen Fraktionen der Elution sammeln und analysieren auf 10 % Lösung von SDS-PAGE. - Pool mit TET2 Protein Fraktionen, Einfrieren trocken, Auflösen von Enzym-Palette in 10 mL Wasser und speichern bei-80 ° C.
2. 5mC Oxidation von TET2-Dioxygenase
- Führen Sie alle Demethylierung Reaktionen in dreifacher Ausführung mit 3 µg des Substrats (25-Mer Doppel stranded DNA, Tabelle 2).
- Fügen Sie 100 µg des gereinigten TET2 Enzym in 50 µL der gesamten Reaktion Puffer mit 50 mM HEPES (pH 8,0), 200 µM FeSO4, 2 mM 2OG (2-Oxoglutarate/α-Ketoglutarate), und 2 mM Ascorbat und Inkubation bei 37 ° C für 1 h21.
- TET2 katalysierte Oxidationsreaktionen mit 5 µL von 500 mM EDTA zu stillen.
- Nach dem abschrecken TET2 Reaktionen bereiten Sie Proben für LC-MS/MS-Analyse durch die Trennung der DNS von TET2 Reaktionsgemisch Oligo Reinigung Spalten verwenden vor.
- 100 µL der Oligo Bindung Puffer zu 55 µL abgeschreckt Reaktion hinzufügen.
- Im Anschluss daran fügen Sie 400 µL 100 % Ethanol zu der Mischung hinzu. Übergeben Sie diese Mischung durch eine Oligo-Bindung-Spalte.
- Waschen der gebundenen DNA mit 750 µL Waschpuffer und eluieren in 20 µL Wasser.
- Verdauen die isolierte DNA mit 2 Einheiten der DNase I und 60 Einheiten der S1 Nuklease bei 37 ° C für 12 h, individuelle Nukleosid-Monophosphates zu produzieren.
- Fügen Sie nach Verdauung 2 Einheiten von Kalb Darm alkalische Phosphatase (CIAP) in den Proben und inkubieren Sie Ergänzung 12 h bei 37 ° C zu terminal Phosphatgruppen von Nukleosid-Monophosphates Nukleoside zu entfernen.
- Alle Nukleoside, speziell modifizierte Cytosines, unter Verwendung der unten beschriebenen LC-MS/MS-Methode zu quantifizieren.
3. quantitative LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung
- Bereiten Sie 100 µM-Stammlösung von allen geänderten Cytosin Nukleoside [5-Methyl-2 '-Deoxycytidine (5mdC), 5-Hydroxymethyl-2 '-Deoxycytidine (5hmdC), 5-Formyl-2 '-Deoxycytidine (5fdC) und 5-Carboxy-2 '-Deoxycytidine (5cadC)] und normale DNA Basen (Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin) in HPLC-Grade Wasser für die Entwicklung der LC-MS/MS-Methode.
- Optimierung von Nukleosid-MS/MS Parameter durch Infusion Stammlösungen, einzeln nacheinander, im Massenspektrometer mit einer Durchflussrate von 10 µL/min in EMS scan-Modus. Nach Parametern optimieren: Declustering potenzielle (DP), potenzielle Eingang (EP) Kollision Zelle Eingang potenzielle (CEP), Kollision Energie (CE) und Kollision Zelle Ausfahrt potenzielle (CXP) für jede DNA-Nukleosid mit quantitative Optimierung automatisierte Funktion der Software.
- Quelle-MS/MS Parameter durch Injektion 10 µL der Stammlösung mit einem Farbverlauf mit 25 % Lösungsmittel B mit einer Durchflussrate von 0,3 mL/min wo Lösungsmittel A 10 mM Ammoniumacetat (pH 4,0) und Lösungsmittel B ist 20 % Acetonitril mit 10 mM Ammoniumacetat (pH 4,0) zu optimieren. Optimierung nach Parametern: Vorhang Gas (CUR): 10-50, Temperatur: 0-600 ° C, Gas Flow 1 (GS1): 0-50, Gas Flow 2 (GS2): 0-50, Collisionally aktiviert Dissoziation (CAD): niedrig, Mittel, hoch, Ion Sprühen Spannung (IS): 4000-5500 für jede DNA-Nukleosid mit Handbuch quantitative Optimierungsfunktion der Software im FIA (Injektion Strömungsanalyse) Modus.
- Um alle acht DNA Nukleoside zu trennen, führen Flüssigchromatographie mit folgenden Farbverlauf: 0 % Lösungsmittel B (0-2 min), 0-20 % Lösungsmittel B (2-5 min), 20-60 % Lösungsmittel B (5-9 min), 60-0 % Lösungsmittel B (9-10 min) und dann mit Lösungsmittel A für 5 min bei einer Durchflussmenge von 0,3 equilibrate mL/min auf einer C18-Säule (Partikelgröße: 5 µm, Pore Größe: 120 Å).
- Mit der optimalen Parameter der MS/MS (Schritt 3.2 und 3.3) in Verbindung mit den oben genannten Flüssigkeitschromatographie Farbverlauf (Schritt 3.4), bestimmen die Antwort Linearität der Nachweisgrenze (LOD) und untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) mit einem zweifach serielle Verdünnung einer 100 µM standard Mischung enthält alle acht Nukleoside. Standardkurven für alle acht DNA Nukleoside zu zeichnen.
- Erkennung und Quantifizierung der alle Nukleoside, speziell modifizierte Cytosines in Schritt 2.4 mit der LC-MS/MS-Methode und Standardkurven produziert.
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Representative Results
Dynamisierung der 5mC in der DNA durch Dioxygenases TET-Familie spielt eine wichtige Rolle in epigenetische transkriptionelle Verordnungen. TET2 Dioxygenase ist häufig in diversen hämatopoetischen Tumoren12mutiert. Um die Rolle des Enzyms TET2 in der normalen Entwicklung und Krankheit zu untersuchen, haben wir seine minimale katalytisch aktiven Domain ohne jede Affinität-Tag in pDEST14 Vector22geklont. Die unmarkierten TET2 Dioxygenase entstand bei ∼5 % des gesamten löslichen Proteins durch SDS-PAGE-Analyse in bakterielle E. Coli BL21 (DE3) Zellen. Da die katalytische Domäne von TET2 einen relativ hohen isoelektrischen Punkt (∼7.49) hat, im Vergleich zu den meisten indigenen E. Coli Proteine24,25,26, einer effizienten Reinigungsprozess eine kation nutzen Austausch-Chromatographie wurde entwickelt. Diese Reinigung ergab > 90 % reines TET2 Enzym in einem einzigen Schritt (Abbildung 1).
Um zu trennen und unterschiedliche Deoxycytidines-Derivate und andere vier natürlichen DNA-Basen nach der enzymatischen Reaktion von TET2 zu quantifizieren, wurde eine sensible LC-MS/MS-basierten Test optimiert. Die liquide Chromatography verwendet eine rückgängig-Phase C18 Spalten. Standardkurven wurden mithilfe von Verdünnungsreihen ein Gemisch mit allen Nukleoside (Abbildung 2) gezeichnet. Der Farbverlauf verwendet für die Flüssigchromatographie, beschrieben in der Versuchsdurchführung war in der Lage, alle acht Nukleoside (Abbildung 3) zu lösen. Die LC-Aufbewahrung Zeiten (tR) für alle acht Nukleoside sind in Tabelle 3beschrieben. Wir weiter optimiert die MS-Erkennung von jedem Elternteil Ion Nukleosid (Q1), das intensivste Produkt Ion (Q3) durch die Bestimmung ihrer declustering Potenzial (DP), Eingang Potenziale (EP), Kollision Zelle Eingang potenzielle (CEP), Aufprallenergie (CE), maximal Nachweisgrenze (LOD) und untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) (Tabelle 3). Zu guter Letzt eine LC-MS/MS-Methode wurde entwickelt, trennen und quantifizieren der vier normalen DNA-Basen (A, T, G und C), sowie die vier modifizierte Cytosin-Basen (5-Methyl, 5-Hydroxymethyl, 5-Formyl und 5-Carboxylgruppen) (Abbildung 3).
Die Aktivität der unmarkierten TET2 Dioxygenase war bestimmt mit einem 25-Mer DsDNA mit einem 5mC in einer CpG-Insel in jeder DNA-Strang (Tabelle 2). Nach TET2 enzymatischen Reaktionen wurden DNA-Oligonukleotide gereinigt und in Nukleosiden umgewandelt. Dann wurden diese Nukleoside LC-MS/MS-Test unterzogen. In den Reaktionen ohne TET2 Enzym (Negativkontrolle) beobachtet nur dA, dT, GD, dC und 5mdC Gipfeln. Allerdings wurden in der Positivkontrolle Reaktion, die enthielt die TET2-Dioxygenase, zwei neue Spitzen entsprechend d5hmC und d5fC beobachtet. Wir waren nicht in der Lage, die Bildung von d5caC Nukleosid möglicherweise aufgrund seiner schlechten Erfassungsebenen (Abbildung 2) zu erkennen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die unmarkierten TET2-Dioxygenase in diesem Verfahren gereinigt katalytisch aktiv ist und verwendet werden, kann um die wt-TET2 Enzym und seiner klinischen Mutanten zu charakterisieren.
Abbildung 1. SDS-PAGE-Analyse des gereinigten TET2 Dioxygenase aus E. Coli BL21 (DE3) Zellen. Spur A gibt Marker während Lane, die B zeigt TET2 Protein gereinigt mit SP Sepharose Ionenaustauschharz. Die Gesamtgröße des unmarkierten TET2 Dioxygenase ist ∼54 kDa, wie durch den Pfeil angedeutet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Standardkurven war Anziehungspunkt für vier natürliche DNA Nukleoside und verschiedenen Cytosin-Derivate, die dann für ihre Quantifizierung verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Flüssigkeitschromatographie (unten) und MS/MS-(Methode verwendet, um zu trennen und zu charakterisieren, vier natürliche DNA Nukleosiden und verschiedenen Cytosin-Derivate siehe oben).
| Primer-Name | Primer Sequenz | |||
| TET2 forward primer | 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3 " | |||
| TET2 Rückwärts-Primer | 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3 " | |||
Tabelle 1: Sequenz der DNA-Oligonukleotid Primer für PCR-Amplifikation der katalytischen Domäne der unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase verwendet.
| Primer-Name | Primer Sequenz |
| Sinnstrang | 5'-AGCCCGCGCCG/iMe-dC/GCCGGTCGAGCGG-3 " |
| Antisense Strand | 5'-CCGCTCGACCGGCG/iMe-dC/GGCGCGGGCT-3 " |
Tabelle 2: Sequenz des Gefühl und Anti-25-Mer DsDNA Oligonukleotids verwendet als TET2 Substrat für in-vitro- Oxidationsreaktionen.
| Nukleoside | Q1 | Q3 | tR (min) | DP (V) | EP (V) | CEP (V) | CE (V) | LOD (Pmol) | LLOQ | R2 | |
| 2'-deoxyadenosine | 252,2 | 136,1 | 12.07. | 41 | 9 | 14 | 17 | 0,06 | 0,198 | 0.997 | |
| 2'-deoxythymidine | 243.2 | 117,1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5,94 | 0,999 | |
| 2'-deoxyguanosine | 268.2 | 152,1 | 10.6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7.8 | 25,74 | 0,999 | |
| 2'-deoxycytidine | 228.1 | 112.1 | 6.29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0.1 | 0,33 | 0.998 | |
| 5-Methyl-2'-deoxycytidine | 242,2 | 126.1 | 9,85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0,03 | 0.1 | 0.998 | |
| 5-Hydroxymethyl-2'-deoxycytidine | 258.2 | 142.1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0,6 | 1,98 | 0.993 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | 256,2 | 140.1 | 10,92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0,2 | 0.66 | 0.998 | |
| 5-Carboxy-2'-deoxycytidine | 272.2 | 156,1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12.87 | 0.993 | |
Tabelle 3: Optimierte LC-MS/MS-Parameter der vier natürlichen DNA-Nukleoside und verschiedenen Cytosin Derivate unter positiven Ionen-Modus. Für jeden Elternteil Ion Nukleosid (Q1) war das intensivste Produkt Ion (Q3) erkannt.
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Discussion
Mutationen im TET2-gen sind einige der am häufigsten gefundenen genetischen Veränderungen bei Patienten mit unterschiedlichen hämatopoetischen Malignome. Bis heute hunderte von verschiedenen TET2 Mutationen, darunter Unsinn, Frame-Shift und Missense-Mutationen wurden in Patienten12identifiziert. Patienten mit TET2 Mutationen zeigen niedrige Konzentrationen von genomischen 5hmC im Knochenmark, im Vergleich zu denen mit wt-TET214. Mutierte TET2 Knock-in Experimenten haben die Auswirkungen dieser Mutationen auf 5hmC Ebenen in transfizierten Zellen14zusammengefaßt. Ergebnisse von TET2-Knockout-Mäusen gezeigt, dass Niveau von TET2 Enzym umgekehrt mit dem Fortschreiten der hämatopoetischen Malignome17,18,19,20 korreliert. Konsequent, Zhang Et Al. vor kurzem gezeigt, dass Down-Regulierung TET2 Ausdruck Niveaus ist eine mögliche prognostische und prädiktive Biomarker in cytogenetically normale akute myeloische Leukämie27.
Trotz immer mehr Hinweise, dass TET2 eine grundlegende Rolle in der normalen Hämatopoese und myeloischer Transformation spielt, biochemische Charakterisierung der wt und Mutant TET2 bleiben in rudimentären Phasen aufgrund von Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Herstellung von aktiven TET2 und seine Assay. Die meisten Studien ergaben rekombinante TET2 entweder über aufwändige Baculovirus System in Insektenzellen14oder als ein Glutathion S-Transferase Affinität Tag in Bakterienzellen, die Entfernung von Affinität Tag21erfordert.
In dieser experimentellen Verfahren beschrieben, das Klonen von unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase katalytische Domäne mithilfe eine ortsspezifische Rekombination-Technik und deren effiziente Ausdruck mit Ziel Vektor (pDEST14) in E. Coli. Weil der isoelektrischen Punkt des unmarkierten TET2 relativ hoch ist (∼7.49) im Vergleich zu die meisten indigenen E. Coli Proteine, entwickelten wir einen effizienten Reinigungsprozess Nutzung ein KATIONENAUSTAUSCH-Chromatographie nachgeben > 90 % reines untagged TET2 Enzym in einem einzigen Schritt.
Weitere, zusätzliche Herausforderungen bestehen in der Quantifizierung der wt und Mutant TET2 Dioxygenase Aktivität. Für diese Experimente, die meisten Studien haben sich verlassen auf Antikörpern basierende Assays wie Dot-Blot14,28, Enzym-linked Immunosorbentprobe assays (ELISA)29, etc. , da diese Tests in der Regel nur ein Antikörper, verwenden z. B. 5hmC oder 5fC or5caC, für die Erkennung von 5mC Modifikation im Substrat DNA, bieten sie kein vollständiges Bild über die katalytische Reaktion von TET Isoformen durchgeführt. Aus diesen Gründen hat der LC-MS/MS-basierten Test der einzige Test, verschiedene Cytosin Modifikationen zu quantifizieren entwickelt. In diesem Zusammenhang haben wir eine neuartige flüssige Chromatographie-Methode entwickelt, die die vier normale DNA-Basen (A, T, G und C), sowie die vier modifizierte Cytosin-Basen (5mC, 5hmC, 5 fC und 5caC) trennen können.
Zur Quantifizierung der acht Nukleoside von TET2 katalysierten Reaktionen haben wir unsere verbesserte flüssige Chromatographie-Methode mit Tandem-Massenspektrometrie gekoppelt. Dieser sensiblen LC-MS/MS-Assay wurde dann genutzt, um die Aktivität der rekombinanten unmarkierten menschlichen TET2 Enzym zu ermitteln. Der hier beschriebene Ansatz wird die Bewertung der wt und Mutant TET2 Dioxygenase Aktivitäten erheblich verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Interessen zu erklären.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde finanziert durch das US Department of Defense in Form eines Idea Award (W81XWH-13-1-0174), aplastischer Anämie & MDS Foundation Grant, und UMRB Grant, M.M. Authors Danke Mohit Jaiswal und Subhradeep Bhar für erste Klonen von TET2 in pDEST14 Vektor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
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