Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Клинический протокол производства жировой ткани производные стромальные сосудистой дроби для потенциальных регенерации хряща

Published: September 29, 2018 doi: 10.3791/58363
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2, 2, 2, 2
1Mipro Medical Clinic, 2National Leading Research Laboratory, Department of Biological Sciences, Myongji University
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы представляем протокол производить жировой ткани производные стромальные сосудистой дроби и ее применение для улучшения функции коленного сустава путем регенерировать ткани хряща человека больных с остеоартрозом.

Abstract

Остеоартрит (ОА) является одним из наиболее распространенных негативных расстройств. Недавно были предприняты многочисленные попытки улучшить функции колени с помощью различных форм мезенхимальных стволовых клеток (МСК). В Корее, костного концентраты и шнур стволовые клетки крови производные были одобрены Корейский продовольствия и наркотиков администрации (КФДА) для регенерации хряща. Кроме того жировой ткани, полученных стромальные сосудистой дроби (СФДВ) было разрешено от КФДА для совместных инъекций в человека пациентов. Аутологичные жировой ткани производные СФДВ содержит внеклеточного матрикса (ECM) помимо мезенхимальных стволовых клеток. ECM выделяет различные цитокины, которые, наряду с гиалуроновой кислоты (HA) и тромбоцитов богатые плазмы (PRP) активируются хлористого кальция, может помочь MSCs для регенерации хряща и улучшить функции коленного сустава. В этой статье мы представили протокол для улучшения функции коленного сустава путем регенерировать ткани хряща человека больных ОА. В результате протокол впервые сообщалось в 2011 году последовали несколько дополнительных публикаций. Протокол включает Липосакция для получения аутологичной lipoaspirates, смешиваются с коллагеназы. Эта смесь lipoaspirates коллагеназа затем вырежьте и гомогенизированные для удаления больших фиброзной ткани, которые могут засорить иглы во время инъекции. После этого смесь инкубированы для получения жировой ткани производные СФДВ. Результате жировая ткань производные СФДВ, содержащие жировой ткани производные MSCs и пережитков ECM, вводят в колени пациентов, в сочетании с ха и хлорида кальция активирован ОТР. Включены три случая пациентов, которые лечились с нашими протоколом, что приводит к повышению колено боль, отек и диапазон движения наряду с МРТ доказательства гиалинового хряща как ткани.

Introduction

Знаны, что имеют возможность регенерации хряща1,2,3,4,5,6мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Они могут быть легко получены из различных источников: костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани, среди многих других. Среди этих источников жировой ткани является единственным источником, где можно получить достаточное количество MSCs без какого-либо расширения культуры для регенерации хряща в клинических параметров7,,8. Аутологичные костного стромальные сосудистой дроби (СФДВ) может быть легко получены также. Однако количество стволовых клеток, содержащихся в расширенной костного мозга-культура является очень низким7,8. Пуповинной крови может содержать достаточное количество MSCs. Однако пуповинной крови не является доступный источник аутологичной СФДВ.

Многочисленные методы обработки жировой ткани для получения СФДВ доступны для клинического применения. Среди них, метод получения MSCs из жировой ткани с помощью коллагеназы, разработаны и подтверждена Зук и др. 5 , 6, очень хорошо приняли. Этот метод использования коллагеназы был изменен для клинического применения в ортопедии. Для того, чтобы применяться к клинических параметров, система должна быть закрытой системы для поддержания стерильности при сохранении удобства. Один частности изменения, представленные в этой статье включает гомогенизацию lipoaspirates. Малого размера lipoaspirates перевариваются относительно быстрее, чем крупные, которые приводят к неравномерное распределение жировой ткани. Кроме того эти большего размера lipoaspirates может производить фиброзной ткани, которые засоряют шприцы и иглы при выполнении совместных инъекций9,10. Для того, чтобы предотвратить эти проблемы, lipoaspirates может гомогенизированные резки и мясорубки lipoaspirates до инкубации с коллагеназы. Результате жировая ткань производные СФДВ может содержать более равномерным внеклеточного матрикса (ECM), по сравнению с lipoaspirates, которые не являются гомогенизированные11. Разбитых ECM, содержащихся в СФДВ может работать как леска12.

В 2009 году аутологичной жировой ткани производные СФДВ позволило Корейский продовольствия и наркотиков администрации (КФДА) при обработке в медицинское учреждение с минимальной обработкой врач13. Впоследствии аутологичные жировой ткани производные СФДВ был использован как потенциального агента для улучшения функций колена в больных остеоартрит (ОА), потенциально регенерировать ткани хряща10,14,15 , 16 , 17 , 18 .

В 2011 году Пак в первый раз показал, что жировая ткань производные стволовых клеток (ИСС) содержащихся в жировой ткани, полученных СФДВ может улучшить функции коленного сустава, потенциально регенерации хрящевой ткани человека больных ОА, когда вводят с тромбоцитов богатые плазмы (PRP) 14. Кроме того Пак et al. сообщили о безопасности данных в 2013 году с участием 91 пациентов. Средняя эффективность в этом безопасность данных составила 67%15. Впоследствии дополнительные исследования Пак et al. показали улучшение коленного функции потенциально вследствие регенерации хрящевой ткани у больных с мениска слезы и Хондромаляция голени10,16,17 ,18. На основании статей сообщалось, известно, что количество стволовых клеток, содержащихся в 100 г жировой ткани, обрабатываемых протоколом, представленные в этой статье может варьироваться от 1 000 000-40,000,000 в зависимости от пациентов характеристики8, 19 , 20 , 21 , 22 , 23.

Здесь мы представляем клинический протокол человека коленного OA, аутологичной СФДВ, жировой ткани, полученных с помощью га и ОТР, активированный с хлорид кальция. Первая версия этой клинических протокола, связанных с закрытыми, ручной системы для поддержания стерильности, было сообщено в 201114. Идентичные протокол был оптимизирован, сохранение стерильности и было сообщено в 2013 и 201610,15. Здесь представлен оптимизированный протокол. Схематический обзор протокола представлена на рисунке 1.

Figure 1
Рисунок 1: схема Обзор протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Одобрения и согласия представить следующие доклады были waived Комитетом (MJUIRB) Мёнгчжийский университета институциональных Наблюдательный Совет. Кроме того этот клинический протокол был в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации и регулирование КФДА. Для выполнения процедур осознанного согласия были получены из пациентов.

1. липосакция

Примечание: Выполнение с стерильных.

  1. Используйте следующие критерии включения: (1) МРТ доказательства этапа 3 OA; (2) мужского или женского пола; (3) старше 18 лет; (4) достаточно жировой ткани (100-110 г) для липосакции; (5) нежелание приступить хирургического вмешательства; (6) неудачи консервативное управление; и (7) отключение постоянной боли.
  2. Используйте следующие критерии исключения: (1) активного заболевания воспалительного или соединительной ткани, как считается, воздействие состояние боли (т.е., волчанка, ревматоидный артрит, фибромиалгия); (2) активный эндокринных расстройств, которые могут повлиять на состояние боли (т.е.,, гипотиреоз, сахарный диабет); (3) активные неврологические расстройства, которые могут повлиять на состояние боли (т.е.,, периферической нейропатии, рассеянный склероз); (4) активные болезнь легких, требующих использования лекарств; и (5) не история совместных инъекции стероидов последние 3 месяца.
  3. Привести пациента в операционной комнате с капюшоном A класса биологической и место его (или ее) в лежачем положении.
  4. Чистота области живота пациента с 5% Бетадин (повидон йод) и драпировка пациента с использованием метода стерилизации, подвергая очищаемой области живота для липосакции.
  5. Приблизительно в 5 см infero боков от пупка, анестезировать двух сайтов (один слева, а другой на правой стороне пупка) разрез к-быть-с (25, 1½ дюймов) иглы в 5-мл шприц 2 мл 2% лидокаин без адреналина путем инъекций каждого сайта на уровне эпидермиса.
  6. Анестезировать сайт разрез к-быть-с 5 мл раствора Тумесцентная (500 мл обычной соли, 40 мл 2% лидокаин, 20 мл 0,5% Бупивакаин, 0,5 мл эпинефрин 1: 1000) в 10-мл шприц с иглой (25 колеи, 1½ дюймов).
  7. Сделайте 2 разрезов 0.5 см примерно 5 см ниже пупка боково, щипал кожу, чтобы повысить глубину уровня подкожной.
  8. С помощью лезвия № 11, совать поднял кожу проникают до уровня подкожной, но не проникают через брюшную стенку.
  9. С помощью канюли 20 см 16-го калибра, анестезировать подкожной уровень всей нижней области живота, которая является к-быть-liposuctioned, с 700 до 800 мл раствора Тумесцентная.
  10. После отделки проникновение всей нижней части живота с Тумесцентная решения, подготовить аппарат липосакция, подключив 3,0 мм канюля, подключенных к 60 мл (или 30 мл) шприц для ручной липосакция или специально разработанные 3,0 мм канюля, подключенных к Центрифуга комплект, закрытой системе шприц с целью сохранения стерильности, подключен к вакуумные машины для вакуум-липосакция.
  11. Проведения липосакции для получения 100-110 г жировой ткани, исключая Тумесцентная решения. При выполнении липосакции, жировой ткани будет получен вместе с Тумесцентная решение, которое должны быть отделены и удалены.
  12. Чтобы отделить Тумесцентная решение, сначала под действием силы тяжести, передать 60 мл шприц жировой ткани в комплект центрифуги и поместите шприц вниз (т.е. та часть шприца внизу). Подождав 5-6 мин, жировой ткани и Тумесцентная жидкости будут разделены. Удалите жидкость в нижней части шприц, нажав на верхней части поршень шприца.
  13. Выполните перечисленные выше действия 1.9-1.11, до тех пор, пока накоплен в общей сложности 100-110 г жировой ткани (lipoaspirates) за колено.

2. Подготовка смеси ASC/ECM с стерильных закрытой системы

  1. После разделения Тумесцентная решения по тяжести и накапливается 50-55 g lipoaspirates за каждый комплект центрифуги 60 мл, стерильные закрытой системы, место 2 центрифуги наборы в центрифуге контейнера ведро и спина на 1600 x g 5 мин, конденсационные lipoaspirates и разделение жидкости из жировой ткани. В этом процесс дальнейшего конденсируется, жирное масло, в некоторых случаях может привести к lipoaspirates.
  2. Быть осторожным, чтобы не поколебать, снять предохранительную крышку и подключите в нижней части комплекта центрифуги.
  3. Удаление нижней жидкости нажав медленно вниз на верхней части поршень комплект центрифуги.
  4. На отдельных 60 мл шприц Растворите 10 мг коллагеназы (5 мг коллагеназы, специфических для соединительной ткани24 ) и 5 мг коллагеназы, специфических для жировой ткани25с 50 мл физиологическим.
  5. Смешать примерно 25-30 мл конденсированных lipoaspirate с растворенными коллагеназы (5 мг коллагеназы, специфических для соединительной ткани) и 5 мг коллагеназы, специфических для жировой ткани в соотношении 1:1 (v: v) путем соединения 60 мл шприц с комплектом центрифуги с помощью Специализированный разъем.
  6. Тщательно перемешайте конденсированных lipoaspirate и коллагеназы, нажав содержание между 60 мл шприц и центрифуги наборы с помощью лозы или толкача.
  7. Передача смеси lipoaspirate и коллагеназы 60 мл-шприцы.
  8. Подключите каждый 60 мл шприц, содержащие смесь с гомогенизатор ткани, которая содержит лезвия.
  9. Соединить другой конец гомогенизатор пустой 60 мл шприц.
  10. Нажмите смесь других 60 мл шприца через гомогенизатор для 4 -6 раз, резки и фарша из lipoaspirate.
  11. Передать смесь коллагеназы и гомогенизированное lipoaspirate обратно в 60 мл центрифуги наборы через специализированный разъем
  12. Место центрифуги наборы в контейнере, чтобы быть помещены в инкубатор, который был предварительно нагретой на 37 ° C.
  13. Инкубируйте две центрифуги комплекты с Гомогенизированные смеси при 37 ° C 40 мин при вращении на 45 об/мин.
  14. После 40 минут инкубации снимите контейнер из инкубатора в стерильных моды. Затем удалите центрифуги наборы и поместите их в центрифуги машины.
  15. Центрифуга смеси на 800 x g 5 мин отделить жировой ткани производные СФДВ.
  16. После центрифугирования удалите супернатант (которая включает в себя коллагеназы и переваривается жировой ткани) из каждого центрифуги наборы, удалив колпачок шприца на вершине поршень и размещение 30 мл шприц на поршень открытия через шприц блокировки подключение.
  17. Медленно нажимайте часть ствола 30 мл шприц для супернатант заполнить в 30 мл шприц.
  18. Нажмите вниз баррель 30 мл шприц все, вплоть до последних 3-4 мл в нижней части комплекта центрифуги, оставляя только последние 3-4 мл жировой ткани производные СФДВ. Супернатант отбрасывается.
  19. Удаление 30 мл шприц из верхней части плунжера и заполните шприц с 5% декстрозы в раствор лактат Рингера (D5LR).
  20. Присоединив 30 мл шприц, заполнены с D5LR на вершине поршень открытия, заполните центрифуги комплекты, содержащие 3-4 мл жировой ткани производные СФДВ, с D5LR до 55 мл.
  21. Удаление 30 мл шприц, крышка поршень и центрифуги центрифуги наборы снова на 300 x g на 4 мин.
  22. Повторите шаги 2.17-2.21 для в общей сложности 4 мойки. Используемые коллагеназы ксеногенные. Таким образом большинство коллагеназы удаляется 4 мойки. Однако для утверждения FDA, тонкой настройки протокола может быть необходимо полностью удалить остатки коллагеназы в окончательном объеме, хотя текущее количество коллагеназы остатков может быть достаточно незначительным для пациентов, которые не имеют любые клинические побочные эффекты.
  23. После 4й центрифугирования для того чтобы получить окончательный счет для инъекций, удалите крышку безопасности и вилку на нижней открытия комплект центрифуги, без встряхивания или поворачивая комплект центрифуги.
  24. Прикрепите 20 мл шприц на дно комплект центрифуги, открытие с помощью специально разработанных соединителя.
  25. Потяните поршень шприца и обратно несколько раз встряхнуть клетки, которые поселились в нижней части комплекта центрифуги.
  26. Удалить желаемый объем СФДВ, содержащие ИСС и ECM, а также другие клетки и ткани (обычно около 3-4 мл из каждого комплекта центрифуги для колена совместного инъекции).

3. PRP подготовка с стерильных

  1. При подготовке ИСС и ECM, нарисуйте 30 мл с 2,5 мл раствора декстрозы антикоагулянт цитрат аутологичной крови.
  2. Передать Рисованные крови комплекты центрифуги 60 мл.
  3. Центрифуга Рисованные кровь на 730 x g 5 минут и удалить супернатант в новый комплект центрифуги 60 мл. Центрифуга супернатант в 1300 x g 4 минут, что приводит к 3-4 мл ОТР.
  4. Прямо перед инъекцией, добавить 3% (w/v) хлорид кальция в соотношении 10:2 (ОТР: хлорид кальция, v: v) для политики репликации Паролей для того чтобы активировать его.
  5. Добавьте 0,5% (w/v) Ха, как леска, ОТР, активированный с хлорид кальция. Эти ИСС с ECM, наряду с ОТР, активированный, хлорид кальция, и Ха стенд для смеси ASC/ECM.

4. ASC/ECM смесь на основе лечения

  1. Очистить колено пациента с 5% Бетадин и драпировка ее стерильной образом.
  2. Ощупывайте передней колена для совместного пространства между бедренной и большеберцовой костей.
  3. Анестезировать укола поверхностно с разбавленным лидокаина (1 мл 1% лидокаина, разбавленным с 4 мл физиологическим) из кожи просто вне капсулы сустава.
  4. Анестезировать внутри суставной капсулы с разбавленным ропивакаина (ропивакаина 0,75% 1 мл разбавляют 3 мл физиологическим).
  5. Смешайте 2 мл HA до 6-8 мл СФДВ, содержащихся в 20 мл шприца через шприц шприц соединитель.
  6. С помощью соединителя шприц шприц, добавьте 0,4 мл хлорида кальция в 3-4 мл аутологичной ОТР, который уже подготовлен и готов в 5-мл шприц.
  7. 3.5-4.5 мл хлорида кальция ОТР в шприц 5 мл в сочетании с 8-10 мл смеси HA/СФДВ в 20 мл шприца через шприц шприц соединитель.
  8. Сразу же, медленно inject смесь (около 12-15 мл) в передней tibio бедренного сустава коленям, используя 38-мм 18-иглы, с или без указания УЗИ.
  9. После инъекции бандаж инъекции с давлением, складывания 4 x 4 хлопчатобумажной марли 4 раза и поместив ленты над сложенном марлевые 4 x 4.
  10. Проинструктируйте пациента оставаться еще на 60 мин для клеток вложения.
  11. Проинструктируйте пациента, чтобы ограничить деятельность для минимальной 1 недели после выписки из клиники.
  12. Вернуться в клинику для трех дополнительных инъекций ОТР, активированную хлорид кальция за 3 недели.

5. после лечения следить

  1. Оценить пациента на неделе 2, 4 и 16 (18 или 22) для боли улучшение с точки зрения визуального аналоговой шкале (VAS) и улучшение функции с точки зрения параметров физической терапии. Определите функциональные рейтинг индекса (Пт), VAS и диапазон движения (ROM), как описано в26,27.
  2. Следить за пациента после лечения МРТ 3 месяца после лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Трое больных (один 87-летняя женщина с этап 3 ОА, 68-летний мужчина с этапа 3 ОА, и один 60-летняя женщина с этапа 3 ОА) без каких-либо значительных прошлом медицинской истории представил в клинику с стойких колено боль и желаемого для потенциальных Аутологичные жировой ткани производные СФДВ лечение. Все три пациента имели их колена, рассмотренных ортопед и были предложены иметь полная замена коленного сустава (ТКР) и желали иметь хирургии. До процедуры все три пациента получил множественные инъекции стероидов и HA без какого-либо длительного улучшения.

87-летний корейский женский пациент, во время экзамена, пожаловался на сильную боль (VAS Оценка 8; Рисунок 2A) время на отдых. Она описала боль усиливается ([Пт: 37; Рисунок 2A) при ходьбе по лестнице. На физический экзамен были отмечены мягкая Совместное опухоль с снижение ROM и нежность с сгибания (рис. 2B). Однако был оценен не слабость связок. McMurray и Apley и тесты были отрицательными. До лечения МРТ продемонстрировал уменьшение размера медиального мениска наряду с деформации и мацерации. (Рис. 2 c, 2E, 2 Gи 2I).

Вторым пациентом, 68-летний корейский мужчина, жаловались на боль тяжелой левое колено (оценка VAS: 7; На рисунке 3A) время на отдых. Боль (Пт: 33; На рисунке 3A) был описан как увеличение при ходьбе по лестнице. Физический экзамен там был мягкий деформации с мягким совместное припухлость. ROM (рис. 3B) было уменьшено. Кроме того был оценен не слабость связок. McMurray и Apley и тесты были отрицательными. До лечения МРТ показало хряща, истончение наряду с уменьшение размера и деформированные медиального мениска вторичным по отношению к предыдущей meniscectomy (рис. 3 c, 3E, 3 Gи 3I). Пациент был поставлен на сцене 3 ОА.

Третий пациент, 60-летний корейский девушки, сообщили также сильная боль (оценка VAS: 8; На рисунке 4A) на отдых. Боль (Пт: 36; На рисунке 4A) был описан как увеличение при ходьбе. Пациент также имели мягкой колено опухоль и снижение ROM (рис. 4В). Ценилась не слабость связок. McMurray и Apley и тесты были отрицательными. До лечения МРТ показало снизился размер медиального мениска с деформацией и мацерация, и истончение хряща (Рисунок 4 c, 4E, 4 Gи 4I).

План лечения. Все три представителя пациентов были ограничены от принимая стероиды, аспирин, нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) и азиатских травяные лекарства по крайней мере за 1 неделю до процедуры. После взятия МРТ изображений исследования, lipoaspirates были получены и обработаны как указано выше. Впоследствии аутологичной жировой ткани производные СФДВ содержащие ИСС, ECM, HA и кальция хлорид активированных аутологичных PRP вводили на колени в день 0. Существовал без осложнений липосакций за совместное инъекций. Впоследствии пациентов возвращается в клинику в одну неделю, затем 2 недели, а затем 3 недели для ввода дополнительных инъекций HA и аутологичных ОТР, активированный с хлорид кальция.

Итоги. После второй недели инъекции смесь ASC/ECM боль и ROM 87-летнего женского пациента улучшилось (рисунок 2A и 2B). На 16 неделе, боль и ROM пациента значительно улучшить более чем 70% (рисунок 2A и 2B). После лечения МРТ, после 16-й недели показали увеличение толщины ткани гиалинового хряща как на медиальной стороне колена (Рисунок 2D, 2F, 2 Hи 2J). Для сравнения средняя эффективность составила 67% в данных используя этот клинический протокол, с участием пациентов, 91 и сообщили в 201315.

Figure 2
Рисунок 2: результат измерений боли (A) и диапазон движения (B); и МРТ Сагиттальная (C-F) и корональный (G-J) последовательных T2 просмотров коленного сустава от случай пациента 1. * указывает вывод о статистически значимой (p < 0,05). Предварительная обработка МРТ (C: последовательные изображения, 5/20; E: 6/20; G: 10/20; и я: 11/20) показывают поражения хряща (стрелки). После лечения МРТ сканирование на 16 недель (D: 6/20; F: 7/20; H: 10/20; и J: 11/20) указывают регенерации хрящевой ткани (стрелки), которая была отремонтирована ASC/ECM смесь на основе лечения. Этот рисунок был изменен из предыдущего доклада Пак и др. 10. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

68-летний мужчина пациента боли и ROM улучшилась после второй недели инъекции смесь ASC/ECM (Рисунок 3А и 3Б). На 18-й недели, его боль и ROM значительно усовершенствовать до 80% (Рисунок 3А и 3Б). Повторяется после 18 МРТй неделе показали увеличение высоты гиалинового хряща ткани на передней стороне медиальной коленного сустава (рис. 3D, 3F, 3 H и 3J).

Figure 3
Рисунок 3 : Результаты измерений боли (A) и диапазон движения (B); и МРТ Сагиттальная (C-F) и корональный (G-J) последовательных T2 просмотров коленного сустава от случай пациента 2. * указывает вывод о статистически значимой (p < 0,05). Предварительная обработка МРТ (C: последовательные изображения, 6/20; E: 7/20; G: 13/20; и я: 14/20) показывают поражения хряща (стрелки). После лечения МРТ сканирование на 16 недель (D: 6/20; F: 7/20; H: 13/20; и J: 14/20) указывают регенерации хрящевой ткани (стрелки), которая была отремонтирована ASC/ECM смесь на основе лечения. Этот рисунок был изменен из предыдущего доклада Пак и др. 10. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

60-летняя женщина пациента боли и ROM улучшилась примерно 50% после второй недели ASC/ECM смесь впрыска (рис. 4A и 4B). На 22-й неделе боль и ROM значительно улучшен более чем 80% (рис. 4A и 4B). Повторное МРТ после 22-й неделе показали рост в высоту гиалинового хряща типа ткани на медиальной стороне колена (Рисунок 4 d, 4F, 4 Hи 4J).

Figure 4
Рисунок 4 : Результаты измерений боли (A) и диапазон движения (B); и МРТ Сагиттальная (C-F) и корональный (G-J) последовательных T2 просмотров коленного сустава от случай пациента 3. * указывает вывод о статистически значимой (p < 0,05). Предварительная обработка МРТ (C: последовательные изображения, 4/20; E: 5/20; G: 10/20; и я: 11/20) показывают поражения хряща (стрелки). После лечения МРТ сканирование на 16 недель (D: 4/20; F: 5/20; H: 10/20; и J: 11/20) указывают регенерации хрящевой ткани (стрелки), которая была отремонтирована ASC/ECM смесь на основе лечения. Этот рисунок был изменен из предыдущего доклада Пак и др. 10. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В 2001 году Зук и др. изолированные стволовых клеток из жировой ткани, разбив коллагеновой матрицы с коллагеназы6. Впоследствии группа показала, что эти стволовые клетки из жировой ткани может превратить в хрящ и других тканях мезодермы в происхождения, доказав, что эти стволовые клетки были мезенхимальных происхождение.

Аналогично процедуры, представленные в этой статье является измененный Протокол применить аналогичный метод для человека пациентов. Основные модификации протокола является включение шприцы закрытой системы получения и обработки lipoaspirates для того, чтобы свести к минимуму контакт воздуха при сохранении простоты выполнения процедуры. Используя такой закрытой системы шприцы, жировой ткани был получен через липосакции. Затем lipoaspirates были смешаны с коллагеназы внутри закрытой системы шприцы. После этого коллагеназа был удален из смеси путем разбавления коллагеназы концентрации в пределах закрытой системы шприцы. Конечным результатом является стерильной жировой ткани производные СФДВ, полученные с легкостью процесса.

Используя аналогичный метод, Пак показал в 2011 году, в первый раз, что аутологичной жировой ткани производные СФДВ может использоваться для лечения больных ОА, потенциально регенерации хрящевой ткани. Позже, Пак и др. также показали, что аутологичной жировой ткани производные СФДВ может использоваться для лечения мениска слезы и Хондромаляция голени путем регенерировать фиброзной ткани хряща как и ткани гиалинового хряща, соответственно. В 2013 году Пак и др. сообщили безопасности исследования с участием 91 пациентов с аутологичной жировой ткани производные СФДВ. Средняя эффективность исследования сообщили 67%, проложив путь к возможности применения аутологичных жировой ткани производные СФДВ ущерб популяции в целом пациентов с хряща.

Один из наиболее распространенных побочных эффектов, сообщает Пак и др. в 2013 году исследование безопасности было совместное припухлость колена после лечения, который можно объяснить гибель 1) стволовых клеток, 2) воспаление, RBCs содержащихся в НРП, или 3) остаточных коллагеназы, который остался в окончательный объем жировой ткани производные СФДВ. Так как MSCs существуют в ECM жировой ткани11,12, переваривание lipoaspirates с коллагеназы сломать матрицы в аренду стволовых клеток является обязательным процессом12. Однако после разрушения матрицы, чтобы освободить стволовые клетки, оставшиеся остаточного коллагеназы полностью исключить из окончательный объем с целью предотвращения любых потенциальных воспаление, которое могут быть произведены остаточного коллагеназы28. Хотя коллагеназы может вызвать воспаление, незначительное количество коллагеназы в окончательный объем жировой ткани производные СФДВ не могут вызвать совместное припухлость. Такой конечный объем аутологичной жировой ткани производные СФДВ с незначительным количеством коллагеназы безопасно использовать для последних нескольких лет для лечения ОА колен путем регенерировать ткани хряща.

Недавно два неферментативного методы получения жировой ткани производные СФДВ были введены29,30. Эти методы используют либо механической силы или УЗИ (колебательных) силы, вместо коллагеназы. В 2018 году D'Ambrosi и др. сообщили в результате лечения четыре остеохондральные повреждения осыпи лодыжки с микро трещиноватых, очищенный аутологичной жировой ткани, которая была получена с помощью механической силы к пробою матрица29. Не коллагеназы был использован чтобы сломать матрицы. Четверо пациентов лечили с микро трещиноватых жировой ткани (то есть, механически поврежденных жировой ткани), для их осыпи29. Все эти четыре больных показали клиническое улучшение через шесть месяцев после процедуры. Никто не имел каких-либо осложнений. Однако это исследование29, был не доклад о потенциальных регенерации хряща. Другое исследование, опубликованное в этом году, с участием колебательной энергии показал, что не достаточно, чтобы изолировать стволовые клетки30колебательной энергии в определенной частоты.

Как показано выше, различные группы имеют различные протоколы за использование аутологических жировой ткани для лечения различных дегенеративных заболеваниях суставов. Протокол может отличаться от размера канюли для липосакции, количество жировой ткани используется, тип и количество коллагеназы (если таковые имеются), методом инъекции и так далее. Так как MSCs существуют в ECM жировой ткани, коллагеназа, или метод очищения с помощью механических сил, могут играть важную роль. Особенно эффективность коллагеназы может зависеть от таких факторов, как размер жировой ткани, количество жировой ткани, концентрация коллагеназы, время и температуры инкубации с коллагеназы и процесс удаления остатков коллагеназы, который может вызвать повреждение клеток28.

Следует отметить, что коллагеназы, как он является важным компонентом этой процедуры для получения стволовых клеток, содержащих жировой ткани производные СФДВ, могут иметь негативное влияние на окончательный объем жировой ткани производные СФДВ. В этой процедуре коллагеназа смешивается с конденсированных lipoaspirates, гомогенизации, инкубировали и затем смывается. На протяжении всего этого процесса стволовые клетки подвергаются воздействию коллагеназы, который может иметь негативное воздействие на выживание стволовые клетки28. Слишком много концентрации или длительного воздействия коллагеназы может привести к снижению жизнеспособности стволовых клеток в конечный объем28. Кроме того слишком много коллагеназы оставил в окончательный объем может вызвать воспаление сустава так как коллагеназы может сломать хряща матрицы совместных вводят28.

В дополнение к потенциальные негативные последствия коллагеназы липосакция может нести другие потенциальные осложнения. С целью получения жировой ткани производные СФДВ, липосакция должны выполняться в первую очередь. Выполнение липосакций, как другие медицинские процедуры, носит несколько потенциальных осложнений, таких как нарушения в кожу контура, серомы, инфицирования, перфорация брюшной стенки, некротизирующий фасциит, жировой эмболии и эмболии легочной артерии. Среди этих осложнений контурных неровностей кожи являются очень распространенным побочным эффектом, которые можно легко предотвратить с помощью небольших канюли и избегая поверхностного липосакций31,32. Серомы, который представляет собой коллекцию серозной жидкости в проблемных области, также может быть результатом агрессивной Липосакция33. Другие потенциальные осложнения, как инфекция, некротизирующий фасциит, перфорация брюшной стены, жировой эмболии или эмболии легочной артерии, все возможно. Однако эти осложнения также могут быть предотвращены путем использования строго стерильных методов и улучшения соблюдение пациентом34.

Кроме того, все три пациента, включенных в исследование, первоначально представленные с мягким совместных выпота, четкое проявление синовита. После лечения с жировой ткани производные СФДВ, все эти пациенты совместных отек улучшения. По этой причине это также разумно предположить, что улучшение клинических симптомов является не в силу регенерации возможных хряща, а вместо этого, модулирующее и противовоспалительный эффект стволовых клеток и/или ОТР на синовиальной оболочки35 , 36. Кроме того, улучшение симптомов может быть вклад модулирующее и противовоспалительное воздействие стволовых клеток и/или ОТР на синовиальной оболочки наряду с возможным регенерацию хрящевой ткани. Хотя дополнительные исследования необходимо определить истинный механизм улучшения симптомов, это перкутанная Внутрисуставных инъекций клеточной терапии в виде аутологичной, гомогенизированные жировой ткани производные СФДВ с аутологичной ОТР, активированный с Хлорид кальция и/или HA может предложить альтернативное лечение для текущей стратегии лечения коленного О.А.

Что касается введения PRP Аутологичная обеспокоен, общепризнано, что ПРП содержит различные факторы роста и дифференциации факторов для вводят MSCs расти и дифференцировать37,,3839. ОТР также показал иметь коллагеназы, нейтрализуя действие40. Что касается введения гиалуроновой кислоты (га), ха было показано, имеют потенциальную роль в качестве материала леса, из-за его высокое сродство к хрящевой ткани и потенциальную роль для оказания помощи стволовых клеток в проникновении хряща матрица41.

Как более новые процессы получения жировой ткани производные СФДВ доступны, необходимо стандартизировать процесс оптимизации метода обработки lipoaspirates. Однако это может быть трудной задачей из-за количество возможных вариантов в процессе получения и обработки аутологичной жировой ткани производные СФДВ. Например различия в текстуре подкожной жировой клетчатки в каждого отдельного пациента, из-за старения или степень ожирения, могут иметь разные ответы на коллагеназы деятельности, приводящей к различное количество ИСС в аутологичной жировой ткани производные СФДВ,42. Кроме того количество стволовых клеток в каждом грамме жировой ткани может отличаться от одного пациента в другую, как показано на большие вариации числа зарегистрированных стволовых клеток в многочисленных публикациях7,19,20, 21 , 22 , 23.

Этот протокол, представленный в этой статье является процедура роман, инновационные, пытаясь улучшить нынешнюю стратегию лечения человека колена OA, потенциально регенерации хряща-ткани с перкутанеус инъекции аутологичных жировой ткани производные СФДВ. Правильное использование коллагеназы является важный и критический шаг в настоящем Протоколе. С помощью закрытой системы шприцы держать стерильности при сохранении удобства выполнения процедуры основных модификации протокол, разработанный Зук и др. 5 Кроме того, для человека приложения, остаточное количество коллагеназы, содержащихся в окончательный жировой ткани производные СФДВ должно быть незначительным предотвратить любые воспаления суставов. Существуют ограничения настоящего Протокола: коллагеназа остатков в окончательный объем (хотя это может быть незначительным), без контрольных групп, которые поодиночке вводили PRP и ха, не биопсий, никаких доказательств, за исключением улучшение клинических симптомов вследствие ОТР, малых количество пациентов (экспериментальное исследование), не бросая вызов компонентов жировой ткани производные СФДВ и спецификация не количество стволовых клеток в каждой из 3 больных. Применяя жировой ткани производные СФДВ для расстройств, таких как разрыв мениска, Хондромаляция голени, спинного диска расстройств, задержка исцеления (или незаживающие) кости перелом, незаживающие язвы кожи, реконструкция груди, и других медицинских расстройств может улучшить клинические результаты. Хотя эти потенциальные клинического применения жировой ткани производные СФДВ, более тщательной и энергичные клинические исследования необходимы для включения производных жировой ткани СФДВ в фактических клинических параметров.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Автор признает поддержку от сотрудников медицинской клиники Mipro и дизайн Jaepil/Дэвид ли рисунок. Эта работа была поддержана научно-исследовательских грантов от био и медицинской программы развития технологии НРФ, финансируемого MSIT (номер СР 2017M3A9E4078014); и Национальный исследовательский фонд из Кореи (СР НАТО) финансируется министерством науки и ИКТ (числа СР 2017R1A2B4002315 и СР 2016R1C1B2010308).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
5% Betadine (povidone-iodine)  Firson Co., Ltd. 657400260
2% Lidocaine  Daehan Pharmaceutical Co. 670603480
Tumescent solution  Myungmoon Pharm. Co. Ltd. N01BB01 The solution was composed of 500 mL normal saline, 40 mL 2% lidocaine, 20 mL 0.5% marcaine, and 0.5 mL epinephrine 1:1000.
Liberase TL and TM research grade  Roche Applied Science 5401020001
D5LR Dahan Pharm. Co., Ltd. 645101072 Dextrose 5% in lactated Ringer's solution 
Anticoagulant citrate dextrose solution  Fenwal, Inc. NDC:0942-0641 The solution was composed of 0.8% citric acid,
0.22% sodium citrate, and 0.223% dextrose.
3% (w/v) Calcium chloride  Choongwae Pharmaceutical Co. 644902101
0.5% (w/v) HA (Hyaluronic acid ) Dongkwang pharm. Co., Ltd. 645902030
0.25% Ropivacaine Huons Co., Ltd. 670600150
Equipment
3.0 mm Cannula  WOOJU Medical Instruments Co. ML30200
60-mL Luer-Lock syringe BD (Becton Dickinson)  309653
Centrifuge Barrel Kit  CPL Co., Ltd. 30-0827044
Tissue homogenizer that contains blades CPL Co., Ltd. 30-0827045
Rotating incubator mixer Medikan Co., Ltd MS02060092
Centrifuge Hanil Scientific Inc. CE1133
Magnetic Resonance Imaging Philips Medical Systems Inc. 18068
Ultrasound Imaging System Samsung Medison co., Ltd CT-LK-V10-ICM-09.05.2007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnoczky, S. P. Building a meniscus. Biologic considerations. Clinical Orthopaedics and Related Research. (367 Suppl), S244-S253 (1999).
  2. Barry, F. P. Mesenchymal stem cell therapy in joint disease. Novartis Foundation Symposium. 249, 86-241 (2003).
  3. Usuelli, F. G., et al. Adipose-derived stem cells in orthopaedic pathologies. British Medical Bulletin. 124 (1), 31-54 (2017).
  4. Zhang, H. N., Li, L., Leng, P., Wang, Y. Z., Lv, C. Y. Uninduced adipose-derived stem cells repair the defect of full-thickness hyaline cartilage. Chinese Journal of Traumatology. 12 (2), 92-97 (2009).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  7. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
  8. Zhu, Y., et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC. Cell Biochemistry and Function. 26 (6), 664-675 (2008).
  9. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015 (2017).
  10. Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. Regeneration of Cartilage in Human Knee Osteoarthritis with Autologous Adipose Tissue-Derived Stem Cells and Autologous Extracellular Matrix. BioResearch Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).
  11. Alexander, R. W. Understanding Adipose-derived Stromal Vascular Fraction (AD-SVF) Cell Biology and Use on the Basis of Cellular, Chemical, Structural and Paracrine Components: A Concise Review. Journal of Prolotherapy. 4, e855-e869 (2012).
  12. Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
  13. Korean Food and Drug Administration (KFDA). Cell therapy: Rules and Regulations. KFDA. , (2009).
  14. Pak, J. Regeneration of human bones in hip osteonecrosis and human cartilage in knee osteoarthritis with autologous adipose-tissue-derived stem cells: a case series. Journal of Medical Case Reports. 5, 296 (2011).
  15. Pak, J., Chang, J. J., Lee, J. H., Lee, S. H. Safety reporting on implantation of autologous adipose tissue-derived stem cells with platelet-rich plasma into human articular joints. BMC Musculoskeletal Disorders. 14, 337 (2013).
  16. Pak, J., Lee, J. H., Kartolo, W. A., Lee, S. H. Cartilage Regeneration in Human with Adipose Tissue-Derived Stem Cells: Current Status in Clinical Implications. BioMed Research International. 2016, 4702674 (2016).
  17. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. A novel biological approach to treat chondromalacia patellae. PLoS One. 8 (5), e64569 (2013).
  18. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. BioMed Research International. 2014, 436029 (2014).
  19. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  20. De Ugarte, D. A., et al. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow. Cells Tissues Organs. 174 (3), 101-109 (2003).
  21. Guilak, F., et al. Clonal analysis of the differentiation potential of human adipose-derived adult stem cells. Journal of Cellular Physiology. 206 (1), 229-237 (2006).
  22. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  23. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  24. Liberase TL information available from Sigma Millipore online. , https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US (2018).
  25. Liberase TM information available from Sigma Millipore online. , https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/Libtmro?lang=en®ion=US (2018).
  26. Childs, J. D., Piva, S. R. Psychometric properties of the functional rating index in patients with low back pain. European Spine Journal. 14 (10), 1008-1012 (2005).
  27. Price, D. D., McGrath, P. A., Rafii, A., Buckingham, B. The validation of visual analogue scales as ratio scale measures for chronic and experimental pain. Pain. 17 (1), 45-56 (1983).
  28. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicine. 3 (5), 705-715 (2008).
  29. D'Ambrosi, R., Indino, C., Maccario, C., Manzi, L., Usuelli, F. G. Autologous Microfractured and Purified Adipose Tissue for Arthroscopic Management of Osteochondral Lesions of the Talus. Journal of Visualized Experiments. (131), e56395 (2018).
  30. Packer, J. D., Chang, W. T., Dragoo, J. L. The use of vibrational energy to isolate adipose-derived stem cells. Plastic Reconstructive Surgery-Global Open. 6 (1), e1620 (2018).
  31. Hanke, C. W., Bernstein, G., Bullock, S. Safety of tumescent liposuction in 15,336 patients. National survey results. Dermatologic Surgery. 21 (5), 459-462 (1995).
  32. Illouz, Y. G. Complications of liposuction. Clinics in Plastic Surgery. 33 (1), 129-163 (2006).
  33. Dixit, V. V., Wagh, M. S. Unfavourable outcomes of liposuction and their management. Indian Journal of Plastic Surgery. 46 (2), 377-392 (2013).
  34. Lehnhardt, M., et al. Major and lethal complications of liposuction: a review of 72 cases in Germany between 1998 and 2002. Plastic and Reconstructive Surgery. 121 (6), 396e-403e (2008).
  35. Iyer, S. S., Rojas, M. Anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cells: novel concept for future therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (5), 569-581 (2008).
  36. Zhang, J., Middleton, K. K., Fu, F. H., Im, H. J., Wang, J. H. HGF mediates the anti-inflammatory effects of PRP on injured tendons. PLoS One. 8 (6), e67303 (2013).
  37. Li, N. Y., Yuan, R. T., Chen, T., Chen, L. Q., Jin, X. M. Effect of platelet-rich plasma and latissimus dorsi muscle flap on osteogenesis and vascularization of tissue-engineered bone in dogs. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 67 (9), 1850-1858 (2009).
  38. Parsons, P., et al. The biological effect of platelet rich-plasma on the fracture healing process. The Journal of bone and joint surgery. British volume. 91-B, 293 (2009).
  39. Wu, W., Chen, F., Liu, Y., Ma, Q., Mao, T. Autologous injectable tissue-engineered cartilage by using platelet-rich plasma: experimental study in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 65 (10), 1951-1957 (2007).
  40. Cooper, T. W., Eisen, A. Z., Stricklin, G. P., Welgus, H. G. Platelet-derived collagenase inhibitor: characterization and subcellular localization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2779-2783 (1985).
  41. Uzuki, M., Sawai, T. A. A comparison of the affinity of sodium hyaluronate of various molecular weights for degenerated cartilage: a histochemical study using hyaluronic acid binding protein. International Congress Series. 1223, 279-284 (2001).
  42. Pagano, C., et al. Molecular and morphometric description of adipose tissue during weight changes: a quantitative tool for assessment of tissue texture. International Journal of Molecular Medicine. 14 (5), 897-902 (2004).

Tags

Медицина выпуск 139 медицины стволовые клетки жировой ткани производные внеклеточная матрица регенерации хряща человека артроз восстановительной медицины мезенхимальных стволовых клеток
Клинический протокол производства жировой ткани производные стромальные сосудистой дроби для потенциальных регенерации хряща
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pak, J., Lee, J. H., Pak, N. J.,… More

Pak, J., Lee, J. H., Pak, N. J., Park, K. S., Jeon, J. H., Jeong, B. C., Lee, S. H. Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (139), e58363, doi:10.3791/58363 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter