Summary
Wij hebben vroeger een gouden nanoparticle peptide hybride intraveneus leveren een synthetische peptide, proteïne kinase C-delta Inhibitor van de omwenteling, die verminderd acute lung ischemie-reperfusie-veroorzaakte schade. Hier laten we het gedetailleerde protocol van de formulering van de drug. Andere intracellulaire peptiden kunnen ook worden geformuleerd.
Abstract
Protein kinase C-delta remmer (PKCδi) is een veelbelovende drug ter voorkoming van ischemie-reperfusie-veroorzaakte orgel schade. Het is meestal geconjugeerd met een cel-penetrating peptide, TAT, voor intracellulair levering. TAT heeft echter aangetoond dat niet-specifieke biologische activiteit. Gouden nanodeeltjes (BNP) kan worden gebruikt als drug delivery dragers zonder erkende toxiciteit. Daarom hebben we een hybride GNP/peptide gebruikt voor PKCδi. Twee korte peptides (P2: CAAAAE en P4: CAAAAW), op een 95:5-verhouding, werden gebruikt voor het wijzigen van de oppervlakte-eigenschappen van het BNP. Geconjugeerd met PKCδi (GNP/PKCi) van het BNP zijn stabiel in gedistilleerd water, 0.9% NaCl, en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende bovien serumalbumine of foetale runderserum. Intraveneuze injectie van GNP-PKCi werd eerder aangetoond dat het voorkomen van ischemie-reperfusie blessures van de longen. Dit artikel schetst een protocol voor het formuleren van GNP/PKCi en het beoordelen van de physiochemical eigenschappen van GNP/PKCi. We hebben soortgelijke methoden gebruikt voor het formuleren van andere drugs peptide gebaseerde met BNP. Dit artikel zal hopelijk meer aandacht vestigen op deze roman intracellulaire drug delivery technologie en haar toepassingen in vivo.
Introduction
Longtransplantatie slaat patiënten met einde-fase Long ziekte1. Ernstige complicaties na longtransplantatie blijven echter een obstakel. In de vroege stadia na longtransplantatie, primaire graft disfunctie is de meest schadelijke complicatie1, en de primaire oorzaak is ischemie-reperfusie (IR)-geïnduceerde acute lung injury2.
Onder koude bewaring is stofwisseling in een donor Long beperkt tot een zeer laag niveau. Echter, reactieve zuurstof soorten en synthese van stikstofmonoxide worden geactiveerd als gevolg van de beëindiging van de bloed stroom3. Na de transplantatie, bloedcirculatie wordt hersteld, en reactieve zuurstof soorten en stikstofmonoxide gegenereerd tijdens koude ischemie verbeteren ontsteking en cel dood, wat resulteert in weefsel schade.
IR om letsel te voorkomen, is een proteïne kinase Cδ inhibitor (PKCδi) gebruikt in het hart, hersenen en longen4,5,6,7,8. Deze studies toonden aan dat PKCδi ontsteking en apoptosis tijdens reperfusie daalde. Het heeft ook verhinderd pulmonaire IR letsel bij ratten en in een Long transplantatie model6. PKCδi is meestal geconjugeerd met een cel-penetrating peptide, TAT, voor intracellulair levering. Het heeft echter aangetoond dat de TAT peptide alleen aspecifieke biologische effecten heeft, met inbegrip van de bevordering van de angiogenese, apoptosis en remming van meerdere cytokines9,10,11. Nanodeeltjes, kleine deeltjes, variërend van 1 tot 100 nm in diameter12, werden onderzocht als kandidaten bij het vergemakkelijken van de drug delivery13. Gouden nanodeeltjes (BNP) worden met name beschouwd als noninvasive en niet giftig. Daarom hebben wij van het BNP als drug delivery dragers voor peptide gebaseerde drugs14,15ontwikkeld.
Het oppervlak van het BNP kan gemanipuleerd worden voor specifieke toepassingen zoals moleculaire erkenning16,17, chemische sensing18, imaging19en drug delivery. Een GNP/peptide hybridesysteem heeft ontwikkeld, met 20 nm BNP en twee korte peptides (P2: CAAAAE en P4: CAAAAW) op een 95:5-verhouding, wijzigen van de oppervlakte-eigenschappen van het BNP. De P2-peptide, met de negatief geladen glutaminezuur (E) aan het eind, stabiliseert het BNP in een waterige oplossing, en de P4-peptide, met de hydrofobe tryptofaan (W) aan het eind, helpt het BNP ingang in cellen14. Het residu van cysteïne (C) in het N-terminus van deze peptides bevat een thiol-groep die tot en met de gouden oppervlakken14 conjugaat kan. Deze hybride peptide/BBP werd verder gebruikt voor het leveren van PKCδi (CSFNSYELGSL). De geoptimaliseerde molaire verhouding van P2:P4 naar PKCδi is 47.5:2.5:50. BNP geconjugeerd met PKCδi (GNP/PKCi) zijn stabiele in gedistilleerd water, 0.9% NaCl en PBS met boviene albumine of foetale runderserum14. Intraveneuze injectie van GNP/PKCi heeft aangetoond dat het voorkomen van ischemie-reperfusie blessures van de Long-15. Dit artikel beschrijft een methode om te formuleren GNP/PKCi en wordt beschreven hoe om te evalueren van de fysisch-chemische eigenschappen van de GNP/PKCi. We hebben soortgelijke methoden gebruikt voor het formuleren van andere peptide gebaseerde drugs geconjugeerd met GNP20,21,22. Hopelijk dat dit artikel zal meer aandacht vestigen op deze nieuwe formulering voor intracellulaire drug delivery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van Peptide oplossingen
- Ophalen van de peptiden (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) uit de diepvries van-20 ° C en ontdooien bij kamertemperatuur (RT).
Opmerking: Houd de fles gesloten om te voorkomen dat vocht condenserend op de peptiden. - Weeg 0.01 g van elk peptide op een microscale. Zet elke peptide in een aparte 50 mL conische buis.
- Voeg 18.74 mL gedeïoniseerd water (DI) aan de P2-buis.
- Voeg 16.93 mL DI water aan de P4-buis.
- Voeg 8.21 mL acetonitril van 50% verdund in DI water aan de PKCδi buis.
- Vortex kort de peptide-oplossingen. Zet de conische buisjes van 50 mL in een ultrasoonapparaat (40 MHz) voor 5 min.
- De peptide-oplossingen brengen een kabinet bioveiligheid. Alle peptide oplossingen bereid moet 1 mM.
- 1 mL van de oplossing van elk peptide overbrengen in een nieuwe conische tube van 50 mL. 19 mL DI water aan de buizen van P2 en P4 toevoegt en 19 mL acetonitril van 50% op de PKCδi buis, zodanig dat elke oplossing is verdund tot 50 µM en in een eigen buis opgeslagen.
2. formulering van BNP/PKCi
- Peptiden moeten worden toegevoegd aan de oplossing van de GNP terwijl nog steeds in de BSC
- 475 μL van P2, 25μL van P4 en 500 μL van δPKCi oplossing in een tube van 15 mL toevoegen. Voeg 9 mL 20 nm GNP oplossing (7.0x1011 deeltje/mL) toe aan de dezelfde tube van 15 mL.
- Het kabinet van de bioveiligheid te verlaten. Wikkel de tube van 15 mL met aluminiumfolie. Laat het op een shaker op RT's nachts.
- Terug de monsters naar het biosafety kabinet. Aliquot 1 mL GNP/PKCi in elke 1,5 mL slangen.
- Centrifugeer de buizen in een micro-centrifuge gedurende 30 minuten bij 15,294 x g bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant uit elke buis onder een kast bioveiligheid.
Opmerking: Wees voorzichtig om de bovendrijvende vloeistof verwijderen en tegelijkertijd te garanderen dat de GNP pellet is niet aanzuiging en intact blijft. - Resuspendeer de pellet in het gewenste oplosmiddel volgens de concentratie vereist. Toepasselijke oplosmiddelen kunnen DI water, PBS, en 0,9% NaCl.
Opmerking: Vanaf 1 mL GNP/PKCi, bevat de GNP pellet 6.3 x 1011 deeltjes, gebaseerd op de concentratie van de GNP geleverd door de fabrikant. Voor het beheren van 1.3 x 1012 deeltjes in 500 µL van 0,9% NaCl, voegen we 232 µL van 0.9% NaCl aan elk van de drie pellets. Na hen bundelen, verzamelen we dan 500 µL van GNP/PKCi oplossing.
Opmerking: Meng de gewenste solvabel is goed voor het verdunnen van de GNP/PKCi pellet, anders de GNP/PKCi zal aggregaat.
3. beoordeling van BNP/PKCi hybride oplosbaarheid
- Giet 0,5 mL GNP/PKCi-oplossing in een cuvet van acryl. Plaatsen van de acryl cuvette op een spectrofotometer UV-Vis en test de piek absorptie15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Moet worden gezorgd voor de evaluatie van de biofysische eigenschappen van de hybride GNP/PKCi, als GNP neiging om statistische in oplosmiddel. Wanneer de GNP wordt samengevoegd, verandert de kleur van de oplossing van roze tot paars (Figuur 1a). UV-Vis spectrofotometer is kundig voor speurder naar de veranderingen meer gevoelig. Als de GNP/PKCi is niet gecumuleerd het hoogtepunt van de absorptie dient bij 525 nm (Figuur 1b). Als het BNP is samengevoegd, zal de piek van absorptie worden verschoven naar rechts. Als een alternatieve methode voor de analyse, wanneer aggregaten hebben gevormd van de dichtheid van ΔOptical (ΔOD = OD op 525 nm - OD bij 440 nm) vermindert.
Figuur 1 : Kwaliteit van BNP/PKCi. (A) goed voorbereid GNP/PKCi is roze in kleur (links). Geaggregeerde GNP/PKCi verschijnt licht paars (rechts). (B) goede GNP/PKCi voorbereiding is stabiel in water, PBS, of 0.9% NaCl-oplossing. Lezingen op een UV-Vis-spectrometer aangegeven dat het hoogtepunt van absorptie 525 bedroeg nm in alle oplossingen. (C) een voorbeeld van goede en slechte GNP/PKCi preparaten. Wanneer het BNP was samengevoegd, was het hoogtepunt van absorptie naar rechts verschoven. Bovendien daalde ΔOD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om ervoor te zorgen de juiste formulering, is het van cruciaal belang dat de oplossing van de δPKCi het ultrasoonapparaat stap beschreven in 1.6 ondergaat. ΔPKCi peptide reeks bevat hydrofobe wordt, dus een ultrasoonapparaat helpt bij het oplossen van PKCi in de oplossing van 50% acetonitril. Bovendien is het zeer belangrijk te mengen het oplosmiddel minutieus, zoals beschreven in stap 2.7. De GNP/PKCi hybrid zal niet goed worden geformuleerd indien deze stappen zijn niet behoorlijk gedaan, als gevolg van de samenvoeging van de δPKCi peptide23.
BNP-basis drug formulering biedt verschillende voordelen. Eerst, BNP gemakkelijk kunnen worden gesynthetiseerd in goed gecontroleerde maten, variërend van een paar nanometer tot ~ 100 nm. Meestal kunnen de kleinere formaat van het BNP leveren drugs in cellen efficiënter dan de grotere als kleinere gemakkelijk in hun doel regio24 verspreiden kunnen. Ten tweede, zijn van het BNP niet-toxisch in vitro en in vivo25, waardoor ze veilig drug vervoerders. Derde, hydrofobe drugs kunnen worden geladen op de gewijzigde BNP-26. Weer, is de Oppervlaktechemie van het BNP gemakkelijk aangepast voor specifieke toepassingen. In onze studies, worden twee korte peptides gebruikt voor het wijzigen van het GNP oppervlak, om te stabiliseren ze in fysiologische omstandigheden en nieuwe bioactivities te geven. De peptiden zijn zorgvuldig ontworpen met drie regio's, met inbegrip van gouden bindende, spatiëring en functionele regio's. Specifiek, heeft het N-terminus van de peptide cysteïne (C) residu dat thiol-groep die zich met goud binden kan bevat. Het middengedeelte heeft vier hydrofobe alanine residuen te bevorderen van peptide vergadering in een dichtbevolkte verpakt enkelgelaagde op het BNP. Het aminozuur in het C-terminus is een functionele aminozuur wijzen naar buiten, die kan worden gebruikt om te manipuleren van de oppervlakte-eigenschappen van de BNP. De verhouding van de 95:5 van deze twee peptiden werd systemisch geselecteerd in een eerdere studie14. De verhouding tussen PKCi en P2/P4 peptiden is ook systemisch getest en geselecteerd van15.
Aan de andere kant, heeft de GNP drug delivery systeem beperkingen. Het BNP zijn geen celtype of specifieke weefsel. BNP na intraveneuze toediening27,28,29vooral geaccumuleerd in de longen, lever en milt. Tot nu toe is alleen deze formule getest in celkweek en klein dier modellen. Als u wilt vertalen naar klinische toepassing, verdere studies op grote diermodellen en haar farmacokinetiek, weefsel distributie en potentiële toxiciteit behoeft te worden vastgesteld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen aan dit project.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door onderzoekssubsidies uit de Canadese instituten van het gezondheidsonderzoek (PJT-148847), ministerie van onderzoek en innovatie van Ontario (RE-08-029) en Canada eerste onderzoek of Excellence Program, geneeskunde door Design aan de Universiteit van Toronto. Dr. Mingyao Liu is James en Mary Davie Chair in Long letsel, reparatie en regeneratie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A.
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
