Summary
Nous avons déjà utilisé un hybride de peptide or nanoparticule à livrer par voie intraveineuse un peptide synthétique, un inhibiteur de protéine kinase C-delta, qui a réduit la lésion pulmonaire aiguë induite par l’ischémie-reperfusion. Ici, nous montrons le protocole détaillé de la formulation de médicaments. Autres peptides intracellulaires peuvent être formulées de la même façon.
Abstract
Inhibiteur de la protéine kinase C-delta (PKCδi) est un médicament prometteur pour prévenir toute blessure induite par l’ischémie-reperfusion orgue. Il est souvent conjugué à un peptide pénétration cellulaire, TAT, pour la délivrance intracellulaire. TAT a toutefois montré des activités biologiques non spécifiques. Nanoparticules d’or (PNB) peuvent servir comme entreprises de livraison de drogue sans toxicité reconnue. Par conséquent, nous avons utilisé un hybride de GNP/peptide pour livrer PKCδi. Deux courtes peptides (P2 : CAAAAE et P4 : CAAAAW), dans une proportion de 95 : 5, ont été utilisées pour modifier les propriétés de surface du PNB. PNB conjugués avec PKCδi (GNP/PKCi) sont stables dans l’eau distillée, 0,9 % NaCl et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant de l’albumine de sérum bovin ou de sérum de veau fœtal. Une injection intraveineuse de GNP-PKCi a déjà été démontrée pour prévenir l’ischémie-reperfusion du poumon. Cet article décrit un protocole pour formuler le GNP/PKCi et évaluer les propriétés physico-chimiques du GNP/PKCi. Nous avons utilisé des méthodes similaires à formuler d’autres médicaments à base de peptides dont le PNB. Cet article sera je l’espère attirer davantage l’attention à cette technologie de délivrance intracellulaire de nouveaux médicaments et de ses applications in vivo.
Introduction
Transplantation pulmonaire enregistre les patients avec la phase terminale de maladie pulmonaire1. Toutefois, des complications graves après une greffe de poumon restent un obstacle. Dans les premiers stades, consécutive à une transplantation pulmonaire, dysfonction du greffon primaire est le plus nocif de la complication1, et sa cause principale est l’ischémie-reperfusion (IR)-induite de lésion pulmonaire aiguë2.
Sous conservation froide, métabolisme dans un poumon de donneur est limité à un niveau très bas. Toutefois, les espèces réactives de l’oxygène et la synthèse de l’oxyde nitrique sont activées en raison de la cessation de l' écoulement de sang3. Après la transplantation, la circulation sanguine est rétablie et les espèces réactives de l’oxygène et l’oxyde nitrique générée au cours de l’ischémie froide améliorent l’inflammation et la mort cellulaire, entraînant des lésions tissulaires.
Pour éviter toute blessure de IR, un inhibiteur Cδ protéine kinase (PKCδi) a été utilisé dans le coeur, le cerveau et le poumon4,5,6,7,8. Ces études ont montré que PKCδi diminue l’inflammation et l’apoptose durant la reperfusion. Il a également empêché des blessures IR pulmonaire chez le rat et un poumon greffe modèle6. PKCδi est généralement conjugué avec un peptide pénétration cellulaire, TAT, pour la délivrance intracellulaire. Toutefois, il a été démontré que le peptide TAT seul a des effets biologiques non spécifiques, y compris la promotion de l’angiogenèse, l’apoptose et l’inhibition de plusieurs cytokines9,10,11. Nanoparticules, particules allant de 1 à 100 nm de diamètre12, ont été explorées comme candidats pour faciliter la livraison de drogue13. En particulier, les nanoparticules d’or (PNB) sont considérés comme non invasive et non toxique. Par conséquent, nous avons développé des PNB comme supports de livraison de drogue pour les médicaments à base de peptides14,15.
La surface des PNB peut être manipulée pour des applications spécifiques telles que la reconnaissance moléculaire16,17, détection chimique18, imagerie19et délivrance de médicaments. Un système hybride de GNP/peptide a été développé, contenant 20 nm PNB et deux petits peptides (P2 : CAAAAE et P4 : CAAAAW) à un ratio de 95 : 5, pour modifier les propriétés de surface des PNB. Le peptide P2, avec la charge négative l’acide glutamique (E) à la fin, stabilise le PNB dans une solution aqueuse, et le peptide de P4, avec le tryptophane hydrophobe (W) à la fin, aide des PNB entrée dans les cellules14. Les résidus de cystéine (C) à l’extrémité N terminale de ces peptides contient un groupe de thiol qui peut conjuguer les surfaces d’or14. Cet hybride de peptide/PNB a été utilisé pour fournir des PKCδi (CSFNSYELGSL). Le rapport molaire optimisé de P2:P4 à PKCδi est 47.5:2.5:50. PNB conjugués avec PKCδi (GNP/PKCi) sont stables dans l’eau distillée, 0,9 % NaCl et PBS contenant de l’albumine bovine ou sérum de veau fœtal14. Une injection intraveineuse de GNP/PKCi a été démontrée pour prévenir l’ischémie-reperfusion du poumon15. Cet article décrit une méthode pour formuler le GNP/PKCi et comment évaluer les propriétés physico-chimiques du GNP/PKCi. Nous avons utilisé des méthodes similaires à formuler d’autres médicaments à base de peptides conjugués au GNP20,21,22. Nous espérons que cet article attirera davantage d’attention à cette nouvelle formulation pour la livraison de drogue intracellulaire.
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Protocol
1. préparation des Solutions de Peptide
- Récupérer les peptides (P2 : CAAAAE, P4 : CAAAAW, PKCδi : CSFNSYELGSL) du congélateur-20 ° C et décongélation à température ambiante (RT).
Remarque : Conservez la bouteille fermée pour empêcher l’humidité de condensation sur les peptides. - Peser 0,01 g de chaque peptide sur un microscopique. Mettre chaque peptide dans un tube conique séparé de 50 mL.
- Ajouter 18,74 mL d’eau désionisée de (DI) dans le tube de P2.
- Ajouter 16,93 mL de l’eau distillée dans le tube de P4.
- Ajouter 8,21 mL d’acétonitrile 50 % dilué dans l’eau distillée au tube PKCδi.
- Vortex brièvement les solutions de peptide. Mettre les tubes coniques 50 mL dans un sonicateur (40 MHz) pendant 5 min.
- Apporter les solutions de peptide à une armoire de sécurité biologique. Toutes les solutions de peptide préparées devraient être de 1 mM.
- Transférer 1 mL de chaque solution de peptide dans un nouveau tube conique de 50 mL. Ajouter 19 mL de l’eau distillée dans les tubes de P2 et P4 et ajouter 19 mL d’acétonitrile de 50 % dans le tube de la PKCδi, telle que chaque solution est diluée à 50 µM et stockée dans son propre tube.
2. formulation du PNB/PKCi
- Peptides devraient être ajoutés à la solution du GNP tout en restant dans le BSC
- Ajouter 475 μL de P2, 25µL de P4 et 500 μl de solution de δPKCi dans un tube de 15 mL. Ajouter 9 mL de solution de GNP 20 nm (11 7.0x10 particules/mL) dans le même tube de 15 mL.
- Sortie du cabinet de prévention des risques biotechnologiques. Enrouler le tube de 15 mL avec du papier aluminium. Laisser la nuit sur un agitateur à RT.
- Retourner les échantillons à la biosécurité du cabinet. ML 1 aliquote du GNP/PKCi dans chaque microtubes de 1,5 mL.
- Centrifuger les tubes dans un micro-centrifuge pendant 30 min à 15 294 x g à 4 ° C.
- Retirez le surnageant de chaque éprouvette sous une armoire de sécurité biologique.
Remarque : Veillez à enlever le surnageant tout en veillant à ce que le culot de GNP demeure intact et qu’il n’est pas aspiré. - Resuspendre le culot dans le solvant désiré selon la concentration requise. Solvants applicables peuvent être DI eau, PBS et 0,9 % NaCl.
NOTE : À partir de 1 mL de GNP/PKCi, le culot de GNP contient 6,3 x 1011 particules, basées sur la concentration de GNP fournie par le fabricant. Pour administrer 1,3 x 1012 particules dans 500 µL de 0,9 % NaCl, nous ajoutons 232 µL de 0,9 % NaCl à chacun des trois pastilles. Après les regroupant, nous pouvons ensuite recueillir 500 µL de solution de GNP/PKCi.
NOTE : Mélanger le désiré solvant bien avant de diluer le culot de GNP/PKCi, sinon le GNP/PKCi regroupera.
3. Evaluation des PNB/PKCi hybride solubilité
- Verser 0,5 mL de solution de GNP/PKCi dans une cupule acryl. Placez la cuve acrylique sur un spectrophotomètre UV-Vis et tester le pic d’absorption15.
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Representative Results
Il faut pour évaluer les propriétés biophysiques de l’hybride de GNP/PKCi, comme GNP tend à agrégat dans le solvant. Lorsque GNP est agrégé, la couleur de la solution passe du rose au violet (Figure 1 a). Spectrophotomètre UV-Vis est capable de détecter les changements plus sensiblement. Si le GNP/PKCi n’est pas agrégé le pic d’absorption doit être à 525 nm (Figure 1 b). Si le PNB est agrégé, le pic d’absorption sera déplacé vers la droite. Comme méthode alternative d’analyse, lorsque les agrégats ont formé le ΔOptical densité (ΔOD = OD à 525 nm - OD à 440 nm) diminue.
Figure 1 : Qualité du PNB/PKCi. (A) correctement préparé GNP/PKCi est rose en couleur (à gauche). Agrégées GNP/PKCi apparaît lumière violet (à droite). (B) bon GNP/PKCi préparation est stable dans l’eau, PBS, ou en solution de NaCl à 0,9 %. Lectures sur un spectromètre UV-visible a indiqué que le pic d’absorption à 525 nm dans toutes les solutions. (C) un exemple de bonnes et de mauvaises préparations GNP/PKCi. Quand le PNB était regroupé, le pic d’absorption a été décalé vers la droite. Par ailleurs, ΔOD a diminué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Afin d’assurer la bonne formulation, il est crucial que la solution de δPKCi subit l’étape de sonication décrite au point 1.6. Séquence peptidique δPKCi contient des portions hydrophobes, donc un sonicateur aide à dissoudre PKCi dans la solution de 50 % d’acétonitrile. En outre, il est très important de mélanger le solvant méticuleusement, comme indiqué dans l’étape 2.7. Le GNP/PKCi hybride ne sera pas bien formulé si ces étapes ne sont pas faites correctement, en raison de l’agrégation du peptide δPKCi23.
Formulation de drogue fondée sur le PNB présente plusieurs avantages. Tout d’abord, le PNB peuvent être synthétisés facilement dans des tailles bien contrôlés, allant de quelques nanomètres à ~ 100 nm. Habituellement, le PNB la plus petite taille peut libérer des médicaments dans les cellules plus efficacement que les plus grands comme les petits peuvent se diffuser facilement dans leur cible région24. En second lieu, PNB sont non-toxiques in vitro et in vivo25, rendant les transporteurs de drogue sans danger. Troisièmement, hydrophobes de médicaments peuvent être chargées dans le PNB mis à jour26. En arrière, la chimie de surface des PNB est facilement modifiée pour des applications spécifiques. Dans nos études, deux petits peptides sont utilisés pour modifier la surface du GNP, afin de les stabiliser dans des conditions physiologiques et de répandre des bioactivités nouvelles. Les peptides ont été conçus avec trois régions y compris or binding, espacement et régions fonctionnelles. Plus précisément, l’extrémité N terminale du peptide a résidu de cystéine (C) contenant le groupe de thiol qui peut se lier avec de l’or. La partie centrale a quatre résidus hydrophobes alanine pour promouvoir ensemble du peptide dans une monocouche dense sur les PNB. L’acide aminé à l’extrémité C terminale est un acide aminé fonctionnel pointant vers l’extérieur, qui peut être utilisé pour manipuler les propriétés de surface du PNB. Le rapport entre ces deux peptides 95 : 5 a été systématiquement sélectionné dans une précédente étude14. Le rapport entre les peptides PKCi et P2/P4 a été également systématiquement testé et sélectionné15.
En revanche, le système de livraison de drogue GNP a des limites. PNB ne sont pas type de cellules ou de tissus spécifiques. PNB sont principalement accumulés dans le poumon, le foie et la rate, après administration intraveineuse27,28,29. Jusqu'à présent, cette formule n’a été testée en culture cellulaire et de petits animaux modèles. Pour le traduire en application clinique, d’autres études sur des modèles animaux de grande taille et sa pharmacocinétique, nécessaire de déterminer la toxicité de distribution et le potentiel des tissus.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer sur ce projet.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par des subventions de recherche des instituts de recherche en santé du Canada (PJT-148847), ministère de la recherche et l’Innovation de l’Ontario (RE-08-029) Canada première recherche du programme d’Excellence, médecine de Design à l’Université de Toronto. Dr. Mingyao Liu est James et Mary Davie chaire de lésions pulmonaires, la réparation et la régénération.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A.
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
