Summary
我们提出的方案, 以检查小鼠心脏的发展使用整个安装视网膜显微镜从心室特异性 Mlc-2v-t分解番茄记者敲入小鼠解剖小鼠胚胎。这种方法使我们能够直接想象小鼠心脏发育过程中心室形成的每个阶段, 而无需劳动密集型组织化学方法。
Abstract
该协议的目的是描述一种方法, 解剖小鼠胚胎和可视化胚胎小鼠室在心脏发育过程中使用心室特异性荧光记者敲入小鼠 (Mlc-2v-tdtocoto 小鼠)。心脏发育涉及一个线性心脏管形成, 心脏管循环, 和四个室间隔。这些复杂的过程在所有脊椎动物中都是高度保守的。小鼠胚胎心脏已被广泛用于心脏发育研究。然而, 由于其非常小的尺寸, 解剖老鼠胚胎心脏是技术上具有挑战性的。此外, 心脏室形成的可视化往往需要原位杂交, β-半乳糖苷酶染色使用 LacZ 报告小鼠, 或免疫染色的切片胚胎心脏。在这里, 我们描述了如何解剖小鼠胚胎心脏和直接可视化室形成的 Mlc-2v-td 番茄小鼠使用整个安装上皮荧光显微镜。利用这种方法, 可以直接检查心脏管的形成和循环, 四腔形成, 而无需进一步的实验操作小鼠胚胎。尽管本协议中使用了 Mlc-2v-td-tdato 记者敲门砖线, 但该协议可应用于其他心脏特定荧光记者转基因鼠标线。
Introduction
心脏发育过程中的腔形成是一个复杂的过程,通过几个形态上不同的胚胎阶段 1,2进行过渡。心脏祖细胞的新月形态形成一个线性心脏管, 然后经过伸长和循环, 形成发育中的心脏的螺旋状。在它的败血症过程后, 发育中的心脏转化为四腔的心脏。这些过程中的任何一个都会导致发育性心脏缺陷。因此, 了解心脏发育过程中室形成的分子机制是很重要的。尽管以前对心脏发育进行了许多研究, 但我们对这一复杂过程的理解仍然有限。
原位杂交、免疫组织化学和β-半乳糖苷酶染色使用 lacz 记者小鼠已被广泛用于研究小鼠心脏发育过程中的腔体形成, 通过标记心脏特异性或腔体特异性结构基因或蛋白质 (例如, nppa、coup-tfii、irx4、mlc-2a 和 mlc-2v)3、4、5、6、7、8、9、10.然而, 这些使用小鼠胚胎的实验需要大量的时间和专业知识, 因为必须按顺序执行几个不同的实验步骤11。在这里, 我们描述了一个简单的整体安装上皮荧光显微镜方法, 以可视化发展中的心室使用胚胎解剖从 Mlc-2v-t分解番茄记者敲门砖 12.与以前使用的方法相比, 这种方法的优点是避免复杂的实验步骤, 这些步骤往往会造成实验变化。该方案的主要目的是描述如何解剖小鼠胚胎和发展心脏, 并检查每个阶段的小鼠心脏室发展, 而无需繁琐的组织化学实验。这种方法可以很容易地应用于评估心脏发育使用各种其他转基因小鼠线标记早期心脏标记 (例如, Mesp1cor:roas26eyfp13, isl1cor:roasa26eyfp13, hcn4h2bgfp14, Hcn4cre: rosa mt"mgg14, Nkx2-5core:rosa mtmg14, Hcn4-egfp15, isl1cor:rosa Mt/2 g 14, Nkx2.5 Cre:roas26ttomato15和 tgmef2c ahf-gfp16小鼠).
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Protocol
所有动物手术都是在范德比尔特大学医疗中心机构动物护理和使用委员会的批准下进行的。
1. 小鼠胚胎的采集和解剖
- 将8-10 大的女性 Mlc-2v-tto薯 +/-与8-10 龄的男性 Mlc-2v-tto薯+/-小鼠,以获得 MLC-2v-tdTomato+/+, Mlc-2v-tttocoto+/-和 mlc-2v-tttocoto-/---胚胎。
- 每天早上检查水坝是否有阴道塞。阴道塞检测当天中午被认为是 E0.5。
注: 阴道检查检测阴道插头应在早晨 (在性活动后8-24 内) 进行, 因为阴道堵塞可能会丢失一整天。 - 在 coitum 之后的不同日期 (例如 E8.5、E10.5 和 E12.5), 使用二氧化碳吸入, 然后进行颈椎脱位,对怀孕的水坝进行安乐死。
- 将小鼠仰绳放置, 并在小鼠腹部喷洒70% 的乙醇, 以避免在解剖过程中对小鼠的毛发污染。
- 用锋利的手术剪刀和钳子, 通过皮肤和腹壁的切口打开腹腔。
- 在腹腔的背侧找到双侧子宫角。
- 用锋利的手术剪刀和钳子在两侧的输卵管上方仔细切割, 将整个子宫分开。
- 将整个解剖子宫放入一个10厘米的 Petri 培养皿中, 用冰凉的 PBS, 用锋利的手术剪刀和一个钳子仔细地分离子宫角上的每个羊膜囊。
- 使用转移移液器将每个胚胎移植到6个井板的各个井中, 这些井板充满了冰凉的 PBS。
- 在解剖显微镜下, 打开羊膜囊, 用锋利的手术剪刀切断脐带, 并在6孔板的单井中切割脐带, 并将每个胚胎暴露出来。
- 在不使用锋利的手术剪刀和强制破坏胚胎的情况下, 尽可能地修剪出胚胎外组织。
注: 整个小鼠胚胎的全安装荧光成像通常在解剖发育中的心脏之前进行, 如下所述。 - 使用锋利的手术剪刀和强制和转移到含有100μl 缓冲液 A (25 mM NaOH 和 0.2 mM EDTA) 的 1.5 mL 管中切割胚胎头部, 以便进行基因分型, 从而与表位荧光成像结果相关。
- 使用精细的钳子打开胚胎的胸部, 用锋利的手术剪刀和钳子将心脏从肺部和血管中取出, 并使用转移移液器将解剖后的胚胎心脏转移到12孔板的井中。所有解剖过程都是在光纤显微镜照明器解剖显微镜下完成的。
注: 在 E8.0 或 E8.5 处解剖小鼠胚胎心脏在技术上是很困难的, 因为它们的体积非常小, 结构脆弱。早期胚胎心脏 (即 E8.0 和 E8.5) 可以在整个勃起胚胎中进行检查, 而无需解剖。
2. 全安装荧光成像
- 将12孔板与小鼠胚胎心脏置于附生荧光解剖显微镜下。
- 在使用细钳的表性荧光解剖显微镜下, 将胚胎心脏定位, 使发育中的心室位于检查器附近。
- 在明亮的现场模式下, 使用 0.63 x 目标 (3.15 x 和 18.9 x 之间的缩放范围) 调整图像的对焦。
- 拍摄明亮的曝光并捕获多个图像。这些图像通常是通过一秒钟曝光获得的。但是, 曝光时间可能因照明和相机规格而异, 需要针对每个设置进行优化。
- 关闭光纤显微镜照明器, 并设置红色荧光滤光片 (Ex545 nm/Em 605 nm), 以显示 tdTomato 的表达。
- 如有必要, 重新调整图像的对焦。
- 调整亮度和对比度, 拍摄红色荧光曝光, 并捕获多个图像。
注: 通常使用以下图像设置: 1秒曝光时间、2倍增益、1.0 饱和度和1.0 伽玛校正。每个实验都需要优化最佳设置。确定最佳设置后, 需要对整个实验使用相同的设置。
3. 基因分型
- 在100°c 下将步骤1.12 中的样品煮沸1小时。
- 在 11, 360 x g 处离心 2分钟, 将20Μl 上清液转移到含有20Μl 缓冲液 b (40 mm Tris Hcl, ph 5.5) 的 1.5 Ml 管中, 并将其混合。
- 以第3.2 步中混合上清液的4.5μl 作为 DNA 模板, 将其与每个特定正向和反向引物 (10Μm) 的0.5Μl、10Μl 预混聚聚合酶和反应缓冲液 (2x) (见材料表) 结合起来, 然后将水添加到总 v 中20Μl. 底漆序列如下。
F1: 5 '-TACCCACGAGAGAGAGAGAGACT-3 '
R1:5 '-TGGACTTTTTGACTGTGT-3 '
F2:5 '-ACGCCCCCTGATAGT-3 '
R2:5 '-TTGCCCCCCCCCGGGGGT-3 ' - 使用以下 PCR 程序运行聚合酶链反应 (PCR) (表 1和表 2)。
- 在 1x TAE (Tis-eate-edta) 缓冲液 (40 mm Tris-tis-eeta 和 1 mM edta) 中, 以 140 v 的形式在1% 琼脂糖凝胶上运行 PCR 样本和 DNA 阶梯 25分钟, 使用 100 bp dna 阶梯估计 PCR 带的大小。
- 将 DNA 凝胶放在 UV 透射光器上, 以识别 DNA 波段并打开 UV 光。
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Representative Results
在心脏发育过程中, MLC-2v 被认为是室腔规格17的最早标记。如图 1所示, 我们从 Mlc-2v-ttato 记者敲鼠标中分解了老鼠的整个胚胎和胚胎心脏, 并检查了 Mlc-2v-tdtoto 报告在心脏发育过程中的表达。在 Mlc-2v-td-tdato 记者敲不入小鼠中, 早在 e8.012 (图 2) 就通过显荧光整体贴装成像显示了发育中心脏中的本构 Tdtomto 表达 (图 2)。在 E8.0 的线性心脏管中, Td番茄的表达相对较弱, 在 E8.5 时变得更强。在 E10.5 中, MLC-2v-tdTomato 记者的表达表现在整个小鼠胚胎解剖环心的心室部分, 而在流入道、流出道或未来心房中没有表现出来。在 E12.15-e13.5, mlc-2v-t利特敲入记者小鼠胚胎的整个安装荧光成像显示, Td番茄记者完全表达在四腔心脏的心室。在 E16.5 的解剖小鼠胚胎中, Mlc-2v-tttato 记者的心室特异性表达模式相似。利用这种方法, 我们可以很容易地跟踪小鼠心脏发育过程中的心室室形成。
在对小鼠胚胎或解剖发育中的心脏进行整体安装荧光成像后, 我们用小鼠胚胎头回顾性地证实了胚胎的基因型。如图 3 a所示, 我们使用两组引物进行 PCR 基因分型。携带野生型等位基因的胚胎显示出 383 BP PCR 产物使用 F1 和 R1 引物集。携带 tdTomato 敲击型等位基因的胚胎显示 497 BP PCR 产物使用 f2 和 R2 引物集 (图 3b)。杂合胚胎的定义是通过演示 383 bp 和 487 bp 带, 而野生类型或纯合子基因型分别通过演示一个 383 bp 或 487 bp 波段来确定。
图1。胚胎 Mlc-2v-ttoto 记者鼠标心脏全安装荧光成像的逐步实验程序概述。请点击这里查看此图的较大版本.
图2。代表性的整个胚胎和发育心脏的图像从 Mcc-2v-ttoto 记者敲鼠标解剖.在不同胚胎阶段对整个胚胎和解剖心脏进行的荧光成像显示了 tdTomato 在发育中的心脏心室中的特异性表达。 (A) E8.0 处的全胚 (b) E8.0 处的全胚, E9.0 处的全胚, e9.0 处的 (d) 整体胚胎 e10.5, (e) E13.5 的全胚, (f) E16.5 的整体胚胎, (g) e9.0 (h) ( h)) 胚胎心脏在 E10.5, (i) 胚胎心脏在 E13.5, (j) 胚胎心脏在 e16.5。 A, 中庭;V、心室;IFT, 流入道;OFT, 流出通道。刻度杆 (A\ u2012f) = 1 毫米;刻度杆 (g-j) = 500μm。 此数字已根据允许从引用 #12 进行了修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图3。Mlc-2v-ttato 记者的基因分型敲进胚胎.(A) 基因分型引物设计示意图。(B) 使用 f1 和 r1 引物 (左) 以及 f2 和 r2 引物 (右) 的代表性基因分型结果。+/+: 纯合, +/-: 杂合,-/-: 野生型。Exon: 包含蛋白质合成所需信息的基因片段;IRES: 内部核糖体入口地点;FRT: 翻转酶重组目标.请点击这里查看此图的较大版本.
| 步 | 温度°c | 时间 | 注意 |
| 1 | 94 | 3分钟 | |
| 2 | 94 | 30秒 | |
| 3个 | 60 | 35秒 | |
| 4个 | 72 | 35秒 | |
| 5 | 重复步骤 2-4, 38次 | ||
| 6 | 72 | 5分钟 | |
| 7。 | 10 | 按住 |
表1:f1 和 R1 引物的 PCR 程序
| 步 | 温度°c | 时间 | 注意 |
| 1 | 94 | 3分钟 | |
| 2 | 94 | 30秒 | |
| 3个 | 61。7 | 35秒 | |
| 4个 | 72 | 35秒 | |
| 5 | 重复步骤 2-4, 38次 | ||
| 6 | 72 | 5分钟 | |
| 7。 | 10 | 按住 |
表 2: 使用 F2 和 R2 引物的 PCR 程序
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Discussion
这里描述的方法是相对简单的检查心室室的发展, 而不进行劳动密集型实验, 以标记心室或心脏特异性结构基因或蛋白质。因此, 这种方法最大限度地减少了通常在免疫抑制的心脏部分发现的技术变异性。
成功实施这种方法有两个关键步骤, 包括精确估计小鼠的胚胎年龄和胚胎心脏的解剖。我们实际上是通过识别雌性小鼠的阴道插头来估计小鼠的胚胎年龄。然而, 阴道堵塞的存在不一定表示怀孕。它只表明发生在大约 8 至 24 小时内。即使发现阴道塞, 往往很难确定老鼠是否真的怀孕, 直到10-11 后, 通过检查女性小鼠的腹部。培育多对雄性和雌性小鼠是获得小鼠胚胎预期年龄的一种安全育种策略。如图 1所示, 隔离发展中的小鼠心脏, 而不会对其结构造成重大损害, 这对于准确检查小鼠胚胎发育过程中的心脏室发育至关重要。在解剖显微镜下仔细解剖, 了解每个胚胎阶段的心脏发育解剖, 在解剖之前, 是成功执行这一方案所必需的。
由于 Mlc-2v-t动他的报告表达是在 E8.0 中首次观察到的, 因此不可能检查早期的胚胎心脏管或心脏新月阶段12。标记早期心脏标记物的各种记者鼠标线 (例如 Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, isle:roas26eyfp13, hcn4h2bgfp 14, hcn4cre: rosa mt/2 14, Nx2-5cor:rosa mtg14, hcn4-egfp15 , Isl1cor:rosa mtmg14和 Nkx2.5 cre:rosa26ttomato15, tgmef2c-ahf-gfp 16 小鼠) 可使用本文所述的方法检查腔体发育的早期阶段。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 NIH R03 HL140264 (Y.J) 的支持。N) 和吉列德科学研究学者项目 (y.-j。N)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
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