Summary
Biz bütün Dağı epifluorescent mikroskobu ventrikül belirli MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fareler disseke fare embriyosu üzerinde kullanarak fare kalp geliştirme incelemek için protokolleri mevcut. Bu yöntem her aşamasında emek yoğun histochemical yöntemleri olmadan fare kalp geliştirme sırasında ventrikül oluşumu doğrudan görselleştirmek için bize izin verir.
Abstract
Bu iletişim kuralının amacı fare embriyo diseksiyon ve ventrikül belirli floresan muhabir çakma fareler (MLC-2v-tdTomato fareler) kullanarak kalp geliştirme sırasında embriyonik fare ventrikül odalarının görselleştirme için bir yöntem tarif etmektir. Kalp Geliştirme doğrusal kalbini tüp oluşumu, döngü kalbini tüp ve dört odası septation içerir. Bu karmaşık işlemler son derece tüm omurgalıların korunmuş. Fare embriyonik kalp kalp gelişim çalışmaları için yaygın olarak kullanmıştır. Ancak, kendi son derece küçük boyutu nedeniyle, fare embriyonik kalp anatomi teknik olarak zordur. Buna ek olarak, In situ hibridizasyon, beta galaktozidaz LacZ muhabir fareler veya immunostaining kesitli embriyonik kalplerin kullanarak boyama görselleştirme kez kardiyak odası oluşumu ihtiyacı var. Burada, fare embriyonik kalp incelemek ve doğrudan ventrikül odası oluşumu MLC-2v-tdTomato farelerin bütün Dağı epifluorescent mikroskobu kullanarak görselleştirmek nasıl açıklar. Bu yöntemle, doğrudan kalp tüp oluşumu ve döngü ve dört odası oluşumu fare embriyolar daha deneysel manipülasyon olmadan incelemek mümkündür. Ne kadar MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fare çizgi bu protokol için bir örnek olarak kullanılır, bu iletişim kuralı diğer kalp özgü floresan muhabir transgenik fare satırlarına uygulanır.
Introduction
Odası oluşumu kalp geliştirme sırasında birkaç morfolojik ayrı embriyonik aşamaları1,2ile geçiş karmaşık bir süreçtir. Kardiyak progenitör nüfus hücreleri hilal şeklinde bir doğrusal kalbini tüp oluşturur ve uzama ve gelişmekte olan kalp sarmal şekli oluşturmak için döngü sonra uğrar. Onun septation işleminden sonra gelişen kalp dört odacıklı kalp içine aktarılır. Bu işlemlerden herhangi bir kesinti gelişimsel kalp kusurları kaynaklanır. Böylece, odası oluşumu kalp geliştirme sırasında temel moleküler mekanizmaları anlamak önemlidir. Kalp geliştirme konusunda çok sayıda önceki çalışmalarda rağmen anlayışımız bu karmaşık sürecin sınırlı kalır.
İn situ hibridizasyon, immünhistokimya ve beta galaktozidaz LacZ muhabir fare kullanarak boyama yaygın olarak kullanılan kalp belirli veya odası belirli yapısal genler etiketleme odası oluşumu sırasında fare kalp geliştirme çalışma ya da proteinler (örneğin, Nppa, darbe-TFII, Irx4, MLC-2a ve MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Ancak, birkaç farklı deneysel adımlar olmak zorunda çünkü fare embriyo kullanarak bu deneyler önemli zaman ve uzmanlık gerektiren sırayla gerçekleştirilen11. Burada, gelişen ventrikül MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fareler12den disseke embriyo kullanarak görselleştirmek için basit bütün Dağı epifluorescent mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Daha önce kullanılan yöntemlerine göre bu yöntemin avantajı kez deneysel varyasyonları oluşturabilirsiniz karmaşık deneysel adımlar kaçınmaktır. Bu iletişim kuralını temel amacı fare embriyo ve gelişmekte olan kalpleri teşrih ve sıkıcı histochemical deneyler olmadan fare kardiyak odası gelişiminin her aşamasında incelemek için nasıl tarif etmektir. Bu yöntem kalp geliştirme erken kardiyak işaretleri etiketleme çeşitli transgenik fare hatlarını kullanarak değerlendirmek için kolayca uygulanabilir (örneğin, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /MG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15ve TgMef2c-AHF-GFP16 fareler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan yordamları Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım kurulu onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. fare embriyo koleksiyonu ve diseksiyonu
- 8-10 hafta yaşlı kadın MLC-2v-tdTomato+/- ile fareler MLC-2v-tdTomato elde etmek için 8-10 hafta eski erkek MLC-2v-tdTomato+ /- fareler dostum+/ +, MLC-2v-tdTomato+/- ve MLC-2v-tdTomato- / - embriyo.
- Vajinal fişler için baraj her sabah kontrol. Vajinal tak algılama gününde öğle E0.5 kabul edilir.
Not:-meli var olmak kılınmak vajinal bir fiş algılamak için vajinal muayene (içinde 8-24 h sonra cinsel aktivite), sabah beri vajinal bir fiş gün boyunca kayıp olabilir. - Farklı günlerde mesaj coitum (örneğin, E8.5, E10.5 ve E12.5) adlı hamile barajlar ötenazi CO2 inhalasyon kullanarak takip tarafından servikal çıkığı.
- Fareler sırtüstü yatıyordu ve fareler fare saç kontaminasyon diseksiyon sırasında karın üzerinde % 70 etanol sprey.
- Karın boşluğu tarafından cilt ve karın duvarı keskin Cerrahi makas ve bir forcep kullanarak kesi açın.
- Bilateral uterin boynuzları karın boşluğu dorsal bölümünde bulursunuz.
- Tüm rahim dikkatle keskin Cerrahi makas ve bir forcep kullanarak her iki tarafta oviducts keserek ayırın.
- Tüm disseke rahim 10 cm ile buz gibi PBS Petri kabına yerleştirin ve dikkatle her amniyotik kese keskin Cerrahi makas ve bir forcep kullanarak rahim boynuz boyunca ayrı.
- Her embriyo transferi pipet kullanarak buz gibi PBS ile dolu 6 iyi plaka bireysel kuyu içine aktarın.
- Diseksiyon mikroskop altında bir amniyotik kese kadar açın ve her embriyo keserek göbek kordonu keskin Cerrahi makas ve bir forcep bireysel bir şey buz gibi PBS ile 6 iyi plaka'yı kullanarak ortaya çıkarmak.
- Ekstra embriyonik dokuların mümkün olduğu kadar keskin Cerrahi makas ve bir forcep kullanarak embriyo zarar vermeden trim.
Not: Tüm bağlama epifluorescent görüntüleme tüm fare embriyo genellikle aşağıda açıklandığı gibi gelişmekte olan kalp anatomi önce yapılır. - Epifluorescent görüntüleme sonuçları ile ilişkilendirmek Genotipleme için keskin Cerrahi makas ve bir forcep ve bir 1,5 mL tüp transferi ile 100 µL arabelleği A (25 mM NaOH ve 0.2 mM EDTA) kullanarak embriyo kafasını kesti.
- İyi forseps kullanarak embriyo sandığı aç ve disseke embriyonik kalp 12 iyi plaka bir kuyunun içine transfer pipet kullanarak PBS ile transfer kalp akciğerler ve damarlara keskin Cerrahi makas ve forseps kullanarak çıkarın. Tüm diseksiyon yordamları bir fiber optik mikroskop ışığı diseksiyon mikroskop altında doldurulur.
Not: E8.0 veya E8.5, fare embriyonik kalpleri dışarı onların son derece küçük boyutu ve kırılgan yapısı nedeniyle incelemek teknik olarak zor. Erken embriyonik kalpler (yani E8.0 ve E8.5) bütün Dağı embriyo diseksiyon olmadan içinde incelenebilir.
2. bütün Dağı epifluorescence görüntüleme
- 12 iyi plaka fare embriyonik kalp bir epifluorescent diseksiyon mikroskop altında yerleştirin.
- Öyle ki gelişen ventrikül sınav yakın bulunan diseksiyon mikroskop iyi forseps kullanarak bir epifluorescent altında embriyonik kalp getirin.
- 0,63 x objektif kullanarak görüntü odak ayarlamak (3,15 x ve 18,9 aralığı zoom x) parlak alan modunda.
- Parlak alan pozlama alın ve birden fazla çekim. Görüntüleri genellikle tarafından bir saniye pozlama elde edilmiştir. Ancak, pozlama süreleri aydınlatma ve kamera specificationss bağlı olarak değişir ve her kurulum için optimize edilmiş olması gerekir.
- Bir fiber optik mikroskop ışığı açın ve tdTomato ifade görselleştirmek kırmızı Floresans (Ex545 nm/Em 605 nm) için filtre ayarlayın.
- Gerekirse görüntü odaklanarak yeniden ayarlayın.
- Parlaklık ve karşıtlığı ayarlama, kırmızı floresan pozlama alın ve birden fazla çekim.
Not: Aşağıdaki görüntü ayarı genellikle kullanıldı: 1 s pozlama süresi, 2 x kazanç, 1.0 doygunluk ve 1.0 gamma düzeltmesi. En iyi ayarı her deneme için optimize edilmiş olması gerekir. En iyi ayarı belirlendikten sonra aynı ayarların tüm deney için kullanılan gerekli.
3. Genotipleme
- 100 ° C'de 1 h için adım 1.12 örnekleri kaynatın
- 2 dk için az 11,360 x g, arabelleği B 20 µL ile yeni bir 1,5 mL tüp içine süpernatant ile transfer 20 µL (40 mM Tris HCl, pH 5.5) santrifüj kapasitesi ve bunları karıştırın.
- Karışık süpernatant adım 3.2 DNA şablon olarak, 4,5 µL al, her birinin belirli ileri 0.5 µL ile birleştirmek ve ters astar (10 µM), önceden karışık polimeraz ve tepki arabelleği (2 x) 10 µL (bkz. Tablo reçetesi) ve su için toplam bir v ekleyin olume 20 µL. Astar dizileri vardır aşağıdaki gibi.
F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3' - Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) aşağıdaki PCR ile (Tablo 1 ve Tablo 2) çalıştırın.
- PCR çalıştırmak örnekleri ve % 1'özel jel 140 V 1 x TAE (Tris-asetat-EDTA) arabelleği (40 mM Tris-asetat ve 1 mM EDTA) 25 dakika süreyle, DNA merdiveni 100 bp DNA merdivenle PCR bantları boyutunu tahmin etmek için kullanın.
- DNA jel DNA bantları tanımlamak ve UV ışık açmak için bir UV transilluminator yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kalp Geliştirme sırasında MLC-2v ventrikül odası belirtimi17için en erken marker olarak kabul edilir. Şekil 1' de gösterildiği gibi biz disseke fare tüm embriyo ve çakma MLC-2v-tdTomato muhabir fareler gelen embriyonik kalp ve kalp geliştirme sırasında MLC-2v-tdTomato muhabir ifade inceledi. MLC-2v-tdTomato muhabir çakma farelerde, epifluorescence bütün Dağı görüntüleme ile gelişen kalp bünye tdTomato ifade görüntülenir olarak erken E8.012 (Şekil 2). TdTomato doğrusal kalbini tüp E8.0, nispeten zayıf ifade E8.5 daha güçlü olur. O was değil göstermek giriş akımı yolu, çıkış yolu veya gelecekteki Kulakçık iken E10.5 MLC-2v-tdTomato muhabir ifade tüm fare embriyo disseke ilmekledi kalbin ventrikül bölümünde gösterilmiştir. E12.5-E13.5 tdTomato muhabir sadece dört odacıklı kalp ventrikül içinde ifade edilir bütün Dağı epifluorescent görüntüleme MLC-2v-tdTomato çakma muhabir fare embriyo disseke kalp gösterdi. Benzer ventrikül belirli ifade deseninin MLC-2v-tdTomato muhabiri disseke fare embriyo E16.5 de gösterildi. Bu yöntemi kullanarak, biz kolayca fare kalp geliştirme sırasında ventrikül odası oluşumu aşağı izleyebilirsiniz.
Sonra bütün Dağı epifluorescent görüntüleme fare embriyo veya disseke gelişmekte olan Kalpler, geriye dönük olarak fare embriyo başkanı kullanarak embriyo genotip doğruladı. 3A rakamgösterildiği gibi astar iki kümesi kullanılarak, PCR Genotipleme yapılır. Vahşi türü alleli taşıyan embriyolar F1 ve R1 astar kümesi kullanarak bir 383 bp PCR ürünü gösterdi. F2 ve R2 astar kullanarak 497 bp PCR ürünü gösterdi tdTomato çakma alleli taşıyan embriyolar (şekil 3B) ayarlayın. Heterozigoz embriyo tanımlanan her iki 383 göstererek kan basıncı ve 487 bp grup vahşi türü veya homozigoz genotip tek 383 göstererek tespit bp veya 497 bp grup, sırasıyla.
Şekil 1. Anahat kademeli deneysel yordam için bütün Dağı epifluorescent düşsel embriyonik MLC-2v-tdTomato muhabir fare kalplerin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Bütün embriyo ve gelişmekte olan kalpleri temsilcisi epifluorescent görüntülerini disseke MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fareler. Bütün Dağı embriyo ve disseke kalpler Epifluorescent görüntüleme farklı embriyonik aşamalarında tdTomato kalpler gelişen ventrikül içinde belirli ifade gösterir. (A)tüm embriyo E8.0, E8.5, (B) bütün embriyo, E9.0, (C) bütün embriyo, E10.5, (D) tüm embriyo, E13.5, (E) bütün embriyo, (F) bütün embriyo, E16.5, (G) E9.0, (H, embriyonik kalp ) E10.5, (ı) Embryonic kalp E13.5, ve E16.5 (J) embriyonik kalp embriyonik kalp. Bir, atrium; V, ventrikül; LFT, giriş akımı yolu; Sık sık, çıkış yolu. Ölçek (A\u2012Fbar) = 1 mm; Ölçek (G-Jbar) 500 µm =. Bu rakam başvurusundan #12 izni ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Çakma MLC-2v-tdTomato muhabir embriyo Genotipleme. (A)Genotipleme astar tasarım Illustration. (B) temsilcisi Genotipleme sonuçları F1 ve R1 astar (solda) ve (sağda) F2 ve R2 primerler kullanılarak. +/ +: + /-homozigoz: heterozigoz,- / -: vahşi türü. ExOn: protein sentezi için gerekli bilgileri içeren bir genin bir kesimi; IRES: İç ribozom giriş sitesi; FRT: flippase recombinase -rekombinasyon hedef. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Adım | Geçici ° C | Zaman | Not |
| 1 | 94 | 3 dk. | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 60 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | 38 döngüleri için 2-4 arasındaki adımları yineleyin | ||
| 6 | 72 | 5 dk | |
| 7 | 10 | Basılı tutun |
Tablo 1: F1 ve R1 primerler kullanılarak PCR programı
| Adım | Geçici ° C | Zaman | Not |
| 1 | 94 | 3 dk. | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 61.7 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | 38 döngüleri için 2-4 arasındaki adımları yineleyin | ||
| 6 | 72 | 5 dk | |
| 7 | 10 | Basılı tutun |
Tablo 2: F2 ve R2 primerler kullanılarak PCR programı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan ventrikül veya kalp özgü yapısal genler veya proteinler etiketlemek için emek yoğun deneyler uygulamadan ventrikül odası geliştirme, incelemek nispeten basit yöntemdir. Bu nedenle, bu yöntemi sık sık immunostained kalp bölümlerde bulunan teknik variabilities en aza indirir.
Farelerin embriyonik yaş ve diseksiyon embriyonik kalplerin kesin tahmin dahil olmak üzere bu yöntemi başarıyla gerçekleştirmek için iki önemli adım vardır. Pratik olarak vajinal tanımlayan tarafından farelerin embriyonik yaş dişi farelerde takılan tahmin ediyoruz. Ancak, vajinal bir fiş varlığı gebelik gelmeyebilir. Sadece cinsel ilişki yaklaşık 8-24 h süresi içinde oluştuğunu gösterir. Vajinal fişler bulmuş olsanız, genellikle fareler gerçekten hamile misin yoksa değil 10-11 gün öncesine kadar dişi farelerin karın incelenerek coitum sonrası belirlemek zordur. Birden fazla çift erkek ve dişi farelerin ıslahı fare beklenen yaş embriyo elde etmek için bir güvenli üreme stratejidir. Fare kalpler yapılarını önemli hasar olmadan gelişen izole kardiyak odası geliştirme sırasında şekil 1' de gösterildiği gibi fare embriyogenez doğru bir şekilde incelemek için önemlidir. Dikkatli diseksiyon mikroskop anatomi ve gelişimsel kardiyak anatomi diseksiyon önce embriyonik her aşamada anlama altında başarıyla bu protokole gerçekleştirmek için gerekli.
MLC-2v-tdTomato muhabir ifade ilk E8.0 gözlenen beri önceki embriyonik kalp tüp ya da kalp Hilal sahne12incelemek mümkün değildir. Önceki kalp işaretleri etiketleme çeşitli muhabir fare satırları (örneğin Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15 Isl1Cre: Rosa mT/mG14ve Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, TgMef2c-AHF-GFP16 fareler) önceki gelişimin bu makalede açıklanan yöntemi kullanarak odası incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser NIH R03 HL140264 tarafından desteklenmiştir (Y.-J. N) ve Gilead Sciences araştırma bilim adamı programı (Y.-J. N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M.
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
