Summary
אנו מציגים את הפרוטוקולים לבחון התפתחות הלב העכבר באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלם על העכבר עוברי גזור מן חדרית ספציפי MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע בכל שלב של היווצרות חדרית במהלך התפתחות הלב העכבר מבלי מהגידולים שיטות מעבדה הומנית.
Abstract
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את שיטת ניתוח העכבר עוברי והדמיה של צ'יימברס חדרית עובריים בעכבר במהלך התפתחות הלב באמצעות חדרית כתב פלורסנט ספציפי טוק-אין עכברים (עכברים MLC-2v-tdTomato). פיתוח לב כרוך צורה צינור הלב ליניארי, הצינור הלב לולאה, ארבעה septation קאמרית. אלה תהליכים מורכבים מאוד נשמרים כל גולגולת. בלב עובריים בעכבר כבר בשימוש נרחב עבור מחקרים התפתחותיים הלב. עם זאת, עקב גודלם קטן מאוד, לנתח לבבות עובריים בעכבר הוא טכנית מאתגר. בנוסף, ויזואליזציה של הלב קאמרית היווצרות לעיתים קרובות צריך היברידיזציה, ביתא-galactosidase מכתים באמצעות LacZ כתב עכברים או immunostaining הלבבות עובריים המחולקת למקטעים. כאן, אנו נתאר כיצד לנתח לבבות עובריים בעכבר והמחש ישירות קאמרית חדרית היווצרות MLC-2v-tdTomato עכברים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלמה. בשיטה זו, אפשרי לבחון באופן ישיר את הלב צינור היווצרות לולאה ואת היווצרות קאמרית ארבע ללא נוסף ניסיוני מניפולציה של העכבר עוברי. למרות הקו MLC-2v-tdTomato כתב בטוק העכבר נמצא בשימוש פרוטוקול זה כדוגמה, פרוטוקול זה ניתן להחיל קווים העכבר הטרנסגניים אחרים כתב פלורסנט הלב ספציפיים.
Introduction
תא צורה במהלך התפתחות הלב היא תהליך מורכב מעבר מיגדרי העובריים מורפולוגית ברורים מספר1,2. צורת חרמש האוכלוסייה ובתאים לב צורות צינור הלב ליניארי, ואז עובר התארכות של לולאה כדי ליצור צורת הספירלה של הלב המתפתח. לאחר תהליך septation שלה, הופכת את הלב המתפתח בלב תאיים ארבע. הפרעה של כל התהליכים האלה תוצאות התפתחותיות לב מולדים. לכן, חשוב להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס היווצרות קאמרית במהלך התפתחות הלב. למרות אינספור מחקרים קודמים על פיתוח של הלב, ההבנה שלנו של תהליך מורכב זה נותר מוגבל.
היברידיזציה באתר אימונוהיסטוכימיה, ביתא-galactosidase מכתים שימוש בעכברים כתב LacZ היה בשימוש נרחב ללמוד קאמרית היווצרות במהלך התפתחות הלב עכבר על-ידי תיוג הלב ספציפי או חדר גנים ספציפיים מבנית או חלבונים (למשל, Nppa, הפיכה-TFII, Irx4, MLC-2a ו- MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. עם זאת, ניסויים אלה באמצעות העכבר עוברי דורשים זמן רב ומומחיות, כי מספר שלבים ניסיוני שונים צריך להיות המבוצעת באופן רציף11. כאן, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלמה פשוט לדמיין החדרים המתפתח באמצעות עוברי גזור MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים12. היתרון של שיטה זו לעומת שיטות השתמשו בעבר היא להימנע צעדים מורכבים ניסיוני, אשר עשויים לעיתים קרובות ליצור וריאציות ניסיוני. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לתאר כיצד לנתח עוברי העכבר ולבבות המתפתח ולבחון כל שלב ההתפתחות קאמרית לב העכבר ללא ניסויים פתולוגיה מייגע. בשיטה זו ניתן להחיל בקלות כדי להעריך את התפתחות הלב באמצעות קווים העכבר הטרנסגניים שונים אחרים תיוג סמני לב מוקדם (למשל, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: רוזה mT /mG14, Nkx2-5Cre: רוזה mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: mT/mG רוזה14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15ועכברים16 TgMef2c-AHF-GFP).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהסכמת ראש הוועדה ואנדרבילט אוניברסיטת מרכז מוסדי חיה טיפול רפואי לשימוש.
1. עכבר ואוסף העובר לנתיחה
- חבר MLC-2v-tdTomato נקבה שבוע 8-10+ /- עכברים עם MLC-2v-tdTomato זכר שבוע 8-10+ /- עכברים להשיג MLC-2v-tdTomato+ +, MLC-2v-tdTomato+ /- ועוברי- / - MLC-2v-tdTomato.
- בדוק הסכרים עבור מהנרתיק פקקים בכל בוקר. בצהרי היום של זיהוי הכנס מהנרתיק נחשבת E0.5.
הערה: בדיקה נרתיקית לגילוי פקק הנרתיק יש לבצע בבוקר (במרחק של 8-24 שעות לאחר פעילות מינית), מאז פקק הנרתיק עלול ללכת לאיבוד לאורך כל היום. - המתת חסד הסכרים בהריון-coitum פוסט ימים שונים (למשל, E8.5, E10.5 ו- E12.5) באמצעות אינהלציה2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- שכב פרקדן העכברים, תרסיס אתנול 70% על הבטן של עכברים כדי למנוע זיהום שיער העכבר במהלך ניתוח.
- פתח חלל הבטן על ידי חתך הן של העור והן את דופן הבטן בעזרת מספריים כירורגיים חדה של forcep.
- אתר דו צדדיים קרניים הרחם בחלקו הגבי של חלל הבטן.
- הפרד בין הרחם כולו על ידי חיתוך בזהירות מעל oviducts משני הצדדים באמצעות מספריים כירורגיים חדה של forcep.
- למקם את הרחם ביתור כולה 10 ס מ צלחת פטרי עם PBS קר כקרח, הפרד בזהירות כל שק שפיר לאורך הקרן הרחם באמצעות מספריים כירורגיים חדה של forcep.
- העברת כל העובר לתוך בארות בודדים של 6 צלחת טוב מלא עם PBS קר כקרח באמצעות פיפטה של העברה.
- תחת מיקרוסקופ ויבתר, לפתוח את שק מי השפיר ולחשוף כל העובר חותכים חבל הטבור באמצעות מספריים כירורגיים חדה forcep היטב בודדים של צלחת טוב 6 עם PBS קר כקרח.
- לקצץ החוצה ככל האפשר במיוחד עובריים רקמות ללא פגיעה העובר באמצעות מספריים כירורגיים חדה של forcep.
הערה: כל הר פלורסנטי הדמיה של העכבר כל העובר מתבצע בדרך כלל לפני לנתח את הלב המתפתח כמתואר להלן. - חתכו את הראש העובר באמצעות מספריים כירורגיים חדה ו forcep העברת צינור 1.5 מ עם 100 µL מאגר A (25 מ מ EDTA NaOH ו- 0.2 מ מ) genotyping לתאם עם התוצאות של פלורסנטי הדמיה.
- פתח את התיבה של העובר באמצעות מלקחיים בסדר, להסיר את הלב מן הריאות ועל להערכת באמצעות מספריים כירורגיים חדה ומלקחיים, ולהעביר הלב העוברי ביתור לבאר של צלחת טוב 12 עם PBS באמצעות פיפטה של העברה. כל ההליכים לנתיחה יושלמו תחת מיקרוסקופ ויבתר עם המאייר מיקרוסקופים אופטיים סיבים.
הערה: זה היה מבחינה טכנית קשה לנתח את הלבבות עובריים בעכבר E8.0 או E8.5, בגלל גודל קטן מאוד ומבנה השברירית שלהם. לבבות עובריים מוקדם (דהיינו E8.0 ו- E8.5) יכולים להיבדק בתוך העובר הר שלם ללא ניתוח.
2. כולה-הר epifluorescence הדמיה
- מקם את הצלחת טוב 12 עם לבבות עובריים בעכבר תחת פלורסנטי לנתח מיקרוסקופ.
- תחת פלורסנטי לנתח מיקרוסקופ באמצעות מלקחיים בסדר, מקם את הלב העוברי כך מתפתחות החדרים ממוקמים סמוך הבודק.
- התאם התמקדות בתמונה שימוש מטרה 0.63 x (זום בטווח בין 3.15 x 18.9 x) במצב שדה בהיר.
- קח שדה בהיר חשיפות, לכידת תמונות מרובות. התמונות התקבלו בדרך כלל על ידי חשיפה שנייה אחת. אולם, פעמים חשיפה עשוי להשתנות בהתאם תאורה מצלמה specificationss, צריך להיות מותאם במיוחד עבור כל התקנה.
- לבטל את המאייר מיקרוסקופים אופטיים סיבים, והגדר את המסנן עבור פלואורסצנטי אדום (Ex545 ננומטר/Em 605 ננומטר) להמחיש את הביטוי tdTomato.
- מחדש להתאים את ההתמקדות של התמונה במידת הצורך.
- כוונון הבהירות והחדות, קח חשיפות ניאון אדום, לכידת תמונות מרובות.
הערה: הגדרת התמונה הבאה נעשה בדרך כלל שימוש: זמן חשיפה של 1, 2 x רווח, רוויה 1.0 ותיקון גמא 1.0. ההגדרה של האופטימלית צריכה להיות אופטימיזציה עבור ניסוי. אחרי ההגדרה המיטבית באותה ההגדרה צריך לשמש עבור ניסוי כולו.
3. genotyping
- מרתיחים את הדגימות מהשלב 1.12 עבור h 1-100 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 11,360 x g, העברת 20 µL של תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 mL החדש עם 20 µL מאגר B (40 מ מ טריס HCl, pH 5.5) ומערבבים אותם.
- לקחת µL 4.5 של תגובת שיקוע מעורבים משלב 3.2 בתור תבנית ה-DNA, ולשלב אותו עם 0.5 µL של כל אחד פארווערטס ספציפיים, תחל הפוכה (10 מיקרומטר), µL 10 מאגר פולימראז ותגובה טרום מעורב (2x) (ראה טבלה של חומרים), ולאחר מכן להוסיף מים "וי" הכולל olume של 20 רצפי פריימר µL. הם כמו למטה.
F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3' - להפעיל את תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) עם התוכנית הבאה של ה-PCR (טבלה 1 ו לטבלה 2).
- להפעיל את ה-PCR סולם הדנ א על ג'ל agarose 1%-140 V 1 x TAE (טריס-אצטט-EDTA) מאגר (40 מ מ טריס-אצטט ו- 1 מ מ EDTA) עבור 25 דק ודוגמאות להשתמש סולם הדנ א bp 100 כדי להעריך את הגודל של הלהקות PCR.
- במקום הג'ל הדנ א על transilluminator UV כדי לזהות הלהקות DNA להדליק אור UV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במהלך התפתחות הלב, MLC-2v נחשב להיות הסמן המוקדם ביותר של הקאמרית חדרית מפרט17. כמתואר באיור1, אנחנו גזור את העוברים כל של העכבר ולבבות עובריים מן הכתב MLC-2v-tdTomato טוק-אין עכברים ובחן MLC-2v-tdTomato ביטוי כתב במהלך התפתחות הלב. בעכברים MLC-2v-tdTomato כתב בטוק, ביטוי tdTomato המכונן בלב המתפתח הוא מדמיין באמצעות הדמיה כל הר epifluorescence מוקדם ככל האפשר E8.012 (איור 2). ביטוי חלשה יחסית של tdTomato בצינור הלב ליניארית ב E8.0 מתחזקת ב- E8.5. ב E10.5, MLC-2v-tdTomato כתב ביטוי הודגם בחלק חדרית בלב שיכורה גזור מן העובר כל עכבר, בזמן זה לא הוצג מערכת תזרים, מערכת יצוא או את אטריה בעתיד. -E12.5-E13.5, כל הר פלורסנטי הדמיה של לב ביתור MLC-2v-tdTomato טוק-אין כתב עכבר עובר הראה כי הכתב tdTomato מתבטאת אך ורק החדרים של הלב תאיים ארבע. דומה ביטוי ספציפי חדרית דפוס MLC-2v-tdTomato כתב הוקרן העובר העכבר גזור-E16.5. באמצעות שיטה זו, אפשר בקלות לאתר לשכת חדרית היווצרות במהלך התפתחות הלב העכבר.
לאחר כל הר פלורסנטי הדמיה של העכבר עוברי או לבבות המתפתח גזור, אנחנו retrospectively אישר את גנוטיפ של העובר באמצעות ראשו של העכבר עוברי. באמצעות שתי קבוצות של תחל כמופיע ב איור 3A, ביצענו PCR genotyping. העוברים נושאת אלל פראי סוג הראה מוצר ה-PCR bp 383 שימוש בערכת פריימר F1 ו- R1. העוברים נושאת tdTomato טוק-in אלל הראה 497 bp PCR המוצר באמצעות פריימר F2 ו- R2 את הגדר (איור 3B). עוברי משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים הוגדרו על ידי הפגנת שני 383 את bp ו- bp 487 להקות, ואילו הסוג הפרוע או גנוטיפ homozygous נקבע על ידי הפגנת 383 יחיד של לחץ דם או לחץ דם 497 להקה, בהתאמה.
איור 1. קווי המתאר של התהליך הניסיוני stepwise לדימות פלורסנטי הר שלם של לבבות עובריים בעכבר כתב MLC-2v-tdTomato. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. נציג פלורסנטי תמונות של כל העוברים ולבבות המתפתח גזור מן הכתב MLC-2v-tdTomato טוק-אין עכברים. פלורסנטי הדמיה של הר כל העוברים ולבבות ביתור בשלבים עובריים שונים מדגים ביטוי מסוים של tdTomato של החדרים של פיתוח לבבות. (א) העובר כל-E8.0, העובר שלם (B)-E8.5, (ג) העובר כל-E9.0, (ד) העובר כל-E10.5, העובר שלם (E)-E13.5, (נ) העובר כל-E16.5, (G) הלב העוברי-E9.0, (H ) הלב העוברי E10.5, (אני) Embryonic הלב-E13.5, ואת הלב העוברי (J)-E16.5. אטריום; V, החדר; : אי, תזרים בדרכי; למוד, יצוא בדרכי. קנה המידה של בר (A\u2012F) = 1 מ מ; קנה המידה של בר (G-J) = 500 מיקרומטר. דמות זו שונתה מהפניית #12 בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. Genotyping של הכתב MLC-2v-tdTomato טוק-אין עוברי. (א) איור של genotyping פריימר עיצוב. Genotyping נציג (B) תוצאות באמצעות תחל F1 ו- R1 (משמאל) ו- F2 ו- R2 תחל (מימין). + +: homozygous, + /-: משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים,- / -: פראי סוג. אקסון: קטע של גן המכיל את המידע הדרוש עבור סינתזה של חלבון; IRES: הריבוזום פנימי כניסה לאתר; והשפלתם: flippase recombinase -רקומבינציה יעד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שלב | Temp ° C | זמן | הערה |
| 1 | 94 | 3 דקות | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 60 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | חזור על שלבים 2-4 מחזורים 38 | ||
| 6 | 72 | 5 דקות | |
| 7 | 10 | . תחזיק |
טבלה 1: PCR התוכנית באמצעות תחל F1 ו- R1
| שלב | Temp ° C | זמן | הערה |
| 1 | 94 | 3 דקות | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 61.7 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | חזור על שלבים 2-4 מחזורים 38 | ||
| 6 | 72 | 5 דקות | |
| 7 | 10 | . תחזיק |
טבלה 2: ה-PCR התוכנית באמצעות תחל F2 ו- R2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן הוא פשוט יחסית לבחון פיתוח קאמרית חדרית, מבלי לבצע ניסויים מהגידולים לתייג גנים מבני חדרית או מסוימים דום לב או חלבונים. לכן, בשיטה זו ממזערת את variabilities טכני נמצאו לעיתים קרובות בסעיפים הלב immunostained.
ישנם שני שלבים קריטיים לביצוע בהצלחה בשיטה זו כולל הערכה מדויקת של עידן עובריים של עכברים, דיסקציה של לבבות עובריים. אנחנו למעשה להעריך גיל העכברים על-ידי זיהוי הנרתיק עובריים מחבר בעכברים הנשי. עם זאת, הנוכחות של פקק הנרתיק אינו מצביע בהכרח הריון. הוא רק מציין כי יחסי אירעה בתוך תקופה משוער 8 עד 24 שעות. גם אם נמצאו מהנרתיק פקקים, זה לעיתים קרובות קשה לקבוע אם עכברים הם אכן בהריון או לא עד 10-11 ימים פוסט coitum על-ידי בדיקת הבטן של העכברים הנשי. מספר זוגות של זכר ונקבה עכברים רבייה היא אסטרטגיה הרבייה בטוח כדי לקבל עידן הצפוי של העכבר עוברי. בידוד בפיתוח העכבר לבבות ללא פיצויים משמעותיים למבנים שלהם הוא קריטי לבחון באופן מדויק קאמרית לב הפיתוח במהלך העכבר מופרה כמופיע באיור1. ניתוח זהיר תחת לנתח מיקרוסקופ והבנה של אנטומיה התפתחותית הלב בכל שלב עובריים לפני ניתוח נחוצים לביצוע בהצלחה פרוטוקול זה.
מאז MLC-2v-tdTomato כתב ביטוי נצפית לראשונה ב E8.0, אין אפשרות לבחון קודמות הלב העוברי צינור או דום לב חרמש שלב12. הקווים השונים כתב עכבר תיוג סמני לב קודמת (לדוגמה: Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: mT/mG רוזה14, Nkx2-5Cre: רוזה mT/mG14, Hcn4-eGFP15 Isl1Cre: רוזה mT/mG14, ו- Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, TgMef2c-AHF-GFP16 עכברים) יכול לשמש כדי לבחון בשלבים מוקדמים של התפתחות קאמרית באמצעות השיטה המתוארת במאמר זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R03 HL140264 (י'-ג'יי N) ותוכנית גלעד מדעי מחקר מלומד (י'-ג'יי N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M.
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
