Summary
在这里,我们描述了RNA聚合酶II(Pol II)伸长复合物的组装,只需要短的合成DNA和RNA寡核苷酸和纯化Pol II。这些复合物可用于研究与 Pol II 伸长复合体相关的转录记录的基本机制。
Abstract
欧核酸mRNA合成是一个复杂的生化过程,需要通过多亚单位酶RNA聚合酶II将DNA模板转录到前体RNA中,并共同转录前体RNA的封顶和拼接,以形成成熟的mRNA。在mRNA合成过程中,RNA聚合酶II伸长复合物是控制其催化活性的大量转录因子以及产生成熟mRNA的封顶、拼接和3'处理酶的调控目标。由于mRNA合成固有的复杂性,更简单的实验系统能够分离和研究其不同的共转录阶段具有很大的效用。
在本文中,我们描述了一个这样一个简单的实验系统,适用于研究共转录RNA上限。该系统依赖于从纯化聚合酶和人工转录气泡中组装的已定义的RNA聚合酶II伸长复合物。当通过生物浸化DNA固定时,这些RNA聚合酶II伸长复合物提供了一个易于操作的工具,用于解剖共转录RNA封顶和机制,通过该机制,伸长复合物在共转录RNA封顶。我们预计该系统可以适应研究蛋白质或蛋白质复合物的招募和/或组装,在mRNA成熟与RNA聚合酶II伸长复合物耦合的其他阶段中发挥作用。
Introduction
Eukaryotic信使RNA(mRNA)合成是一个精细的生化过程,涉及通过RNA聚合酶II合成未加工的前体RNA和加工前体RNA以产生成熟的mRNA。RNA的封盖、拼接和聚化处理步骤主要以共同转录的形式进行。Pol II 伸长复合体作为脚手架,用于招募和协调许多RNA处理酶的活动。因此,我们对成熟真核子病mRNA生成方式的最终理解将严重依赖实验系统的开发,以便对伸长复合体和调节负责共转录封顶、拼接和多吸收的酶。
毫不奇怪,这种实验系统的开发是困难的。一个主要障碍是Pol II转录本身的显著复杂性,只需通过Pol II体外重建基础转录,至少需要一组五个一般转录启动因子:TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH1.此外,在体外重组任何类型的受监管的Pol II转录需要一套更大的转录因子和共子调节器。因此,一个主要目标是开发更简单的实验系统,以便重组适合研究Pol II转录和RNA处理功能耦合的活性Pol II伸长复合物。
一种用于重组活性Pol II伸长复合物的更简单方法已被证明对拉长Pol II的结构和生化研究,以及最近用于研究共转录RNA处理2,3) 都很有用 ,4,5.在本文中,我们将展示如何有效地利用从纯化的 Pol II 和合成转录气泡制备的 Pol II 伸长复合物来研究新生 Pol II 转录的共转录封顶机制。
封顶是指在新生的Pol II成绩单的5'-三磷酸盐端共价添加5'-角苷"帽"。该上限对于mRNA成熟、传输、翻译和其他过程的后续步骤非常重要6,7。该帽由一种称为封盖酶的酶共同添加到Pol II转录本中。在哺乳动物细胞中,负责冠形酶RNA5'-三磷酸酶和甘宁醇转移酶活性的活性位点包含在单个多肽8中。封顶酶通过与Pol II体上尚未定义的表面相互作用,被招募到Pol II伸长复合体,而Rpb1卡博西终端域(CTD)在其heptapeptideSer5上所覆盖的磷酸化。在伸长复合物中,一旦新生的转录达到至少18个核苷酸的长度,并且从聚合酶RNA退出通道中出现,封顶酶催化添加5'-角苷帽。在封顶反应的第一步,三磷酸酶水解RNA 5'-三磷酸盐,产生5'-双磷酸盐。在第二步中,GTP通过甘胶转移酶水解至GMP,形成GMP封盖酶中间体。最后,甘柳转酶将GMP转移到新生转录本的5'-二磷酸盐端,以产生盖子。
封顶反应的一个显著特征是,共转录封顶(即,与功能Pol II伸长复合物相关的转录的封顶)比自由RNA5,9的封顶更有效。因此,该领域的一个主要问题是,如何通过封盖酶与Pol II伸长复合物的相互作用来实现封盖的这种戏剧性的激活。在此协议中,我们描述了仅使用纯化RNA聚合酶II和人工转录气泡的活性RNA聚合酶II伸长复合物的组装。这些方法允许创建RNA聚合酶II伸长复合物与定义的长度和序列的转录。在最近的一项研究中,我们使用这些定义的RNA聚合酶II伸长复合物作为研究RNA封盖5机制方面的模型。特别是,我们表明:(i)与这些伸长复合物相关的RNA的封顶比自由RNA的封顶效率高100倍以上,(ii)由POL II CTD的TFIIH依赖磷酸化刺激。这里描述的方法原则上可以适应生成基质,用于研究与Pol II伸长复合物相关的其他共转录RNA处理反应。
在该协议的第 1 节中,人工伸长复合物是通过将合成模板链 DNA 寡核苷酸退火到 RNA 寡核苷酸,在其 3'端与模板链 DNA 的大约 9 个核苷酸互补而创建的。然后,Pol II 被加载到 DNA:RNA 复工中。然后,通过添加部分互补、非模板链DNA寡核苷酸,在其3'端贴上生物锡标记(图1和图2A),完成伸长复合物。这些伸长复合物中的POL II扩展RNA寡核苷酸,在添加放射性标记核苷酸的适当组合后,使放射性标记转录转录记录具有定义的长度和序列。此外,使用混合使用轮回去除未结合的核苷酸和进一步添加不同的核苷酸组合,可以"行走"Pol II沿DNA模板的不同位置,并合成确定长度的RNA。然后,RNA在变性尿素-PAGE凝胶中进行纯化并进行电泳。在协议的第2节中,人工伸长复合物用于分析共转录RNA封顶。该示例介绍了 POL II CTD 的 TFIIH 依赖磷酸化对共转录RNA封顶的影响。在本实验中,我们测量共转录封顶的程度,作为封盖酶浓度(每次反应5、15和45纳克)和时间(1、2和4分钟)的函数。
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Protocol
1. 人工伸长复合物和Pol II行走的组装
- 在磁珠上固定含有3'生物锡分子的非模板DNA寡聚物的1nmol。
注:可以提前完成以下步骤,为将来的实验做准备。本协议中使用的所有寡核苷酸序列均位于表1中。RNA寡聚物用5'-三磷酸修饰合成。- 将 200 μL 的磁珠 (10 mg/mL) 加入低蛋白结合 1.5 mL 管中,然后放在磁性机架上 2 分钟。
- 当管位于磁性机架上时,从管中取出液体,而不会干扰磁珠。要清洗珠子,请从机架上取下管,加入 1 mL 的 5 mM Tris-HCl pH 7.5、0.5 mM EDTA、1 M NaCl,将管返回到机架,并在 2 分钟后取出洗涤液。
- 使用同一缓冲液的 200 μL 再重复 2 次。
- 在 400 μL 的 10 mM Tris-HCl pH 7.5、1 mM EDTA、2 M NaCl 缓冲液中重新悬浮磁珠。然后与380μL的H2O和20μL的10μM非模板生物浸化DNA寡聚物混合。将管子放在螺母上,在室温下孵育30分钟。
- 用 200 μL 的 5 mM Tris-HCl pH 7.5、 0.5 mM EDTA、 1 M NaCl,3 次用 200 μL 的 20 mM HEPES-NaOH pH 7.9、20% 甘油、100 mM KCl、1m M M EDTA、0.5 mg/mL 血清酶洗涤 3 次。
- 在 4°C 下离开管,用 BSA 完成阻隔珠子。
- 第二天,将管放入磁架中,取出并丢弃液体,并在200 μL的20m HEPES-NaOH pH 7.9、20%甘油、100 mM KCl、1 mM EDTA、0.5 mg/mL牛血清白蛋白中重新悬浮珠子,并转移到新管中。对于此 DNA 模板,最终浓度约为 5 μM。
注:孵育时间和寡果浓度需要根据经验确定每个生物浸化DNA寡核糖核酸。此模板应提供足够的 200 反应,并在 4°C 下存储时持续至少 6 个月。
- ANneal RNA和DNA模板链寡核苷酸寡聚物以2:1摩尔比(分别为20和10pmol)获得DNA:RNA复性。
- 如表 2所述,设置 10 μL 退火混合物。
注:10 μL的退火混合物足以进行10次反应。如果要进行更多的检测,可以根据需要放大退火混合物。 - 使用以下程序在热循环器中执行退火反应:在 45°C 下执行 5 分钟,然后 12 个循环(每个周期 2 分钟)从 43°C 开始,每个循环降低 2 °C 的温度。4°C 怠速怠速。
注:这是一个灵活的时间点。退火在 +30 分钟内完成,但可在 4°C 下停留更长时间。在实验室中,退火混合物被保留长达4小时,没有观察到反应效率的任何下降。 - 当退火RNA到模板链DNA时,为协议后期步骤准备缓冲液。表2至表8列出了为每个缓冲液准备每个缓冲液所需的成分。将洗涤的乘数增加 [Y(X+1) = 1],所有其他缓冲区的乘数为 [Y(X+1) 1]。X = 准备的反应数;Y = 所需的洗涤步骤数(最少 3)。
注:在实验当天重新准备所有缓冲区。将 PVA 添加到缓冲液后,请勿将管放在冰上。在使用前将Pol II或核苷酸添加到缓冲液中。
- 如表 2所述,设置 10 μL 退火混合物。
- 将纯化RNA聚合酶II加载到DNA:RNA杂交体上。
- 将 1 pmol (1 μL) 的 DNA:RNA 复工与 13 μL 的 Pol II 缓冲液混合(从表 3中)。
- 从步骤1.3.1向混合物中加入±0.02单位的纯化RNA Pol II(1μL),通过轻轻上下移液,用移液头搅拌,而不引入气泡进行混合。在30°C下孵育10分钟。
注:从这里给出的卷用于单个反应;根据需要为实验中的反应数量进行扩展。本例中使用了从大鼠肝脏中纯化的RNA Pol II,如描述10所示;然而,RNA波尔II从其他来源纯化,包括培养的哺乳动物细胞或酵母也可以使用3,4,5,11,12,13。
- 通过添加生物仿当性非模板DNA完成伸长复合物。
- 将5pmol(1μL)的固定非模板DNA寡聚物加入14μL的非模板DNA缓冲液(从表4中),从步骤1.3.2添加到管中,并在37°C下孵育10分钟。
- 将样品放入磁性机架中 2 分钟,用 30 μL 的洗涤缓冲液(从表7)清洗 1x,以去除未合并的 Pol II 和寡聚物。
- 生成含有放射性标记RNA 23mers的伸长复合物。
- 在 30°C 下执行所有进一步的孵育。将 1 μL 的 15 μM ATP 和 10 μCi (1 μL) 的 [+ -32P] UTP (3,000 Ci/mmol) 添加到 23 μL 的脉冲缓冲液中,并用它来重新悬浮洗过的磁珠。
警告:放射性物质是危险的。确保穿戴适当的防护设备,并遵守所有实验室关于安全使用和处置放射性物质的准则。
注:当不需要放射性标记RNA时,如西方标记实验,用15μM UTP替换放射性标记UTP。 - 孵化反应10分钟,使放射性标记23人合成。
- 将含有100μM ATP和100μM UTP混合物的1.5μL溶液加入3.5μL的追逐缓冲液中,加入含有预装配的伸长复合物的管,孵育5分钟,将所有新生的转录液放入23人。
- 将样品放入磁性机架2分钟,取出上清液,用30μL的洗涤缓冲液清洗一次,以去除未结合的核苷酸,并在30μL的洗涤缓冲液中重新悬浮。
- 加入94 μL停止混合蛋白酶K和糖原(表9)以终止反应,或继续第1.6节产生具有较长转录本的伸长复合物或第2节执行封顶测定。
- 在 30°C 下执行所有进一步的孵育。将 1 μL 的 15 μM ATP 和 10 μCi (1 μL) 的 [+ -32P] UTP (3,000 Ci/mmol) 添加到 23 μL 的脉冲缓冲液中,并用它来重新悬浮洗过的磁珠。
- (可选)走波尔II,使23,25,和29核苷酸转录本
- 按照步骤 1.2.1 到 1.5.4 中描述的步骤,准备含有放射性标记 23mers 的伸长复合物。向上扩展 4 倍以生成 120 μL 的洗涤伸长复合物,这足以产生 4 种反应。
- 标签 3 新管 "23mer"、"25mer"和"29mer"。将30μL的洗涤伸长复合物转移到"23mer"管中,并加入94μL的停止混合物与蛋白酶K和糖原。
- 将含有剩余90 μL的洗涤伸长复合物的管子放入磁性机架中2分钟,取出上清液,并在90 μL BTB中重新悬浮珠子,每个1.5 mM ATP和1.5 mM CTP各1.2 μL。在30°C下孵育10分钟。
- 按照步骤1.5.4所述,用90μL的洗涤缓冲液洗涤一次,并在90μL的洗涤缓冲液中重新悬浮,将30μL的伸长复合物转移到"25mer"管中,并加入94μL的停止混合物与蛋白酶K和糖原。
- 将含有剩余60 μL的伸长复合物的管子放入磁性机架中2分钟,取出上清液,并在60μL BTB中重新悬浮珠子,每个子体为0.8 μL,ATP和1.5 mM CTP各1.5 mM CTP。
- 在30°C下孵育10分钟,按照第1.5.5节的60μL洗涤缓冲液洗涤一次,并在60μL的洗涤缓冲液中重新悬浮。
- 将30μL从2x样品转移到"29mer"管中,加入94μL的停止混合物与蛋白酶K和糖原,或继续到第2部分进行封顶测定。
- 继续进行RNA纯化和分析(第3节)。
2. 使用人工伸长复合物进行测定共分封盖
- 通过放大步骤 1.2.1 到 1.5.5 13 倍所述的过程,生成包含 23 种器的洗涤伸长复合物。这足以进行 12 次反应 + 1 次额外反应。
-
Pol II CTD 磷酸化
- 将含有洗涤伸长复合物的管子放入磁性机架中2分钟,取出上清液,并在BTB的377μL中重新悬浮珠子,并辅以13μL的1.5 mM ATP。
- 准备两个新管,分别标有+H和-H。在标有 +H 的管中加入 3 μL 的 ±300 纳克/μL TFIIH,并在管中加入标记 -H 的 9 μL 20 mM HEPES-NaOH pH 7.9,20% 甘油,100 mM KCl,1 mM EDTA,0.5 mg/mL 牛血清白蛋白。
注:我们通常使用从大鼠肝脏中纯化的TFIIH,但我们使用#0.6 μg/反应的商用重组Cdk7/Cyclin H/MAT1(CAK,这是TFIIH的激酶模块)获得了类似的结果。有关详细信息,请参阅材料表。 - 将步骤 2.2.1 中洗涤的伸长复合物的 87 μL 添加到标有 +H 的管中,将 270 μL 的洗涤伸长复合物添加到标有 -H 的管中,在 30°C 下孵育 10 分钟。
- 将样品放入磁性机架 2 分钟。要去除多余的核苷酸和未结合的蛋白质,请分别用90μL或270μL的洗涤缓冲液在+H和-H反应中洗涤伸长复合物。
-
RNA 封顶
- 在 87 μL 的封顶混合物中,在标有 +H 的管中重新悬浮伸长复合物(BTB 辅以 50 μM GTP (表 10)。在 261 μL 的封顶混合物中,在标有 -H 的管中重新悬浮伸长复合物。
- 准备 4 个新管,标有 5 纳格 CE+H、5 纳 C、15 纳 C、45 纳 CE。将封顶酶 (CE) 稀释到 20 mM HEPES-NaOH pH 7.9、20% 甘油、100 mM KCl、1 mM EDTA、0.5 mg/mL 牛血清白蛋白中,制备含有 5 纳克 CE/μL、15 纳克 CE/μL 或 45 纳克 CE/μL 的溶液,并将 3 μL 的相应溶液分给 4 管中。
- 准备 12 个新管,每个管中加入 94 μL 停止缓冲液 (2.1.1)。
- 通过加入使用TFIIH处理的87 μL的伸长复合物,或不标记含有封盖酶的管,开始每个封盖反应。在30°C的热块中孵育。
- 在1、2或4分钟后,将每个反应混合物的30μL转移到含有94μL停止缓冲液的管中,停止反应。如第 3 节所述,净化和分析反应产物。
3. RNA纯化与分析
- 净化RNA
- 在室温下在停止缓冲液中孵育反应产物20分钟。
注:暂停点。此缓冲液中的样品已维持长达 4 小时,没有 RNA 丢失或降解。 - 提取一次与124 μL的苯酚:氯仿:二甲苯醇(25:24:1),一次与氯仿:二甲苯醇(24:1)。
警告:苯酚毒性极强,被皮肤迅速吸收。穿戴适当的防护装备。
注:为了在提取过程中最大限度地恢复RNA,请使用含有高密度凝胶的商用管子,在水相和有机相之间形成稳定的屏障。请参阅讨论和材料表。 - 将水相(顶层)转移到含有12.4 μL的3M醋酸钠pH 5.2的新管中。
- 在室温下在停止缓冲液中孵育反应产物20分钟。
- 乙醇沉淀
- 加入350 μL的100%乙醇,通过倒置彻底混合。
- 在干冰上孵育至少10分钟。
注:暂停点。为方便起见,可以在这里停留,并在第二天完成程序;但是,可以直接转到步骤 3.3 并在同一天运行凝胶。RNA可在-80°C下保持几天,然后再进一步加工,但不要离开更长时间。
- 为凝胶电泳制备RNA样品
- 让样品解冻,通过反转2-3次混合,在台式离心机中以21,000 x g,4°C离心15分钟。 同时,设置变性凝胶混合物(第3.4.1节)。
- 小心地从样品中取出乙醇,不要干扰颗粒。
- 加入500 μL的70%乙醇,倒管几次洗颗粒,然后在室温或4°C下以21,000 x g再次离心5分钟。
- 在桌面离心机中清除尽可能多的乙醇,并快速旋转(5-10 s)的管子。然后,用凝胶加载尖端,取出最后剩余的乙醇体积。
- 空气干燥颗粒在室温下3分钟。
- 将4μL的H2O添加到每个颗粒的顶部,溶解RNA。在室温下孵育5分钟。
- 将4μL的2xRNA染料(见材料表)加入混合物中,然后涡旋每个管几秒钟,以完全重新悬浮RNA。
注:建议使用含有形式酰胺代替尿素的RNA染料,因为后者在低温下沉淀。 - 快速旋转管子,然后在70°C下在热块中孵育10分钟。
-
将管子存放在干冰上,直到准备好装上凝胶。
注:在干冰上保持RNA,在凝胶聚合时,可以灵活地进行其他实验。样品在解冻后无需重新加热。然而,如果凝胶准备好运行,RNA可以在加热后直接加载。
- 制备尿素-PAGE凝胶
- 对于 40 mL 凝胶混合物,在 50 mL 锥形管中组合:16.7 克尿素、15 mL 40% 双丙烯酰胺溶液(19:1 比例)、4 mL 10x TBE(1 M Tris-HCl、1 M 钠硼酸盐、20 mM EDTA)和 8 mL H2O。此体积足以用于 1.0 毫米垫圈的标准尺寸凝胶(18 厘米高 x 16 厘米宽度)。
警告:丙烯酰胺具有极强的毒性。虽然在溶液中没有吸入风险,但在处理时务必佩戴实验室外套、手套和安全眼镜。
注:这种混合物用于铸造变性15%的聚丙烯酰胺凝胶,它很容易解析15-50 nt之间的RNA。 根据需要改变二元/丙烯酰胺的浓度,以解析不同长度的不同RNA转录。 - 将含有凝胶混合物的封闭管放在螺母上,直到尿素完全溶解。
- 使用玻璃板、1 mm 垫片和 15 孔梳子设置凝胶铸造站。
- 工作迅速,加入40μL的TEMED和400μL的10%过硫酸铵溶液到凝胶溶液中,并混合良好。使用 25 mL 移液器,在板之间浇注凝胶溶液,插入梳子,并允许凝胶聚合至少 2 小时。
注:如果在使用前将凝胶倒入 2 小时以上,则一旦凝胶聚合,用湿纸巾盖住它(将梳子留在原位),然后用塑料包装,防止其干燥。
- 对于 40 mL 凝胶混合物,在 50 mL 锥形管中组合:16.7 克尿素、15 mL 40% 双丙烯酰胺溶液(19:1 比例)、4 mL 10x TBE(1 M Tris-HCl、1 M 钠硼酸盐、20 mM EDTA)和 8 mL H2O。此体积足以用于 1.0 毫米垫圈的标准尺寸凝胶(18 厘米高 x 16 厘米宽度)。
- 变性凝胶RNA电泳
- 聚合后,将凝胶转移到运行罐中,并在1x TBE中以20mA预运行15-30分钟。
- 同时,解冻样品(如果冻结),涡旋,并在2000 x g,4°C下旋转4分钟。
- 准备就绪后,关闭电源,并使用注射器用 1x TBE 仔细冲洗每个井。
- 使用凝胶加载尖端将样品加载到凝胶上。
- 在恒定的 20-30 mA 下运行凝胶约 2 小时,或直到较低的染料(二甲二醇 FF)到达凝胶底部。
- 取出凝胶,将其放在一块吸水纸上,然后用塑料包装。
- 将带有放射性标记的凝胶暴露在荧光屏上。
- 使用荧光仪扫描荧光屏并分析图像。
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Representative Results
图2和图3显示了用于通过从不同来源延伸或Pol II来生成含有不同长度转录文的人工伸长复合物的代表性结果反应。图4描述了如何使用这些伸长复合物来测定共转录CTD磷酸化依赖性RNA封顶。
图2A是人工伸长复合物中DNA和RNA分子的图。图2B显示了在反应中产生的不同长度的转录记录,完全按照协议1中所述,其中起始人工伸长复合物使用20 nt的合成RNA寡聚物制备(图2A中的深蓝色;RNA_20mer,表1。由于我们知道起始RNA长度和DNA模板序列,我们可以确定核苷酸的子集-ATP,CTP,GTP,或UTP-必要的,走Pol II沿模板的一个定义位置。新合成的核苷酸数量添加到RNA寡核苷酸底漆的起始尺寸中,以确定最终预期长度(RNA寡核大小= 添加的核苷酸数量)。在ATP和UTP的存在下,Pol II可以在20ntRNA寡聚物中加入3 nt,以产生含有23mer RNA的伸长复合物。如果一个人冲走未合并的ATP和UTP,然后添加ATP和CTP,20 nt的寡头被延长2nt,使25mer,如果一个然后再次冲走未合并的核苷酸,并添加ATP和GTP,成绩单被扩展额外的4nt,使一个29mer.ce 新生成的转录本对应于预期的RNA大小,由于几乎所有放射性标记的23人都可以定量地被追逐到更长的产品中,人们知道使用这种方法(i)RNA寡核苷酸被正确定位在Pol II出口组装过程中的通道和 (ii) 放射性标记 RNA 与活性 Pol II 伸长复合物相关。
图2C显示了该协议的一个变化,其中起始伸长复合物使用相同的DNA模板和非模板链寡聚子以及RNA寡聚物(RNA_29mer,表1)制备的,该基质在其5'结束,但否则在顺序上与20ntRNA寡核糖核酸相同。由于在这种情况下起始RNA长度为29 nt,因此可以使用上述相同的Pol II步道生成含有32mer、34mer和38mer转录本的伸长复合物。
根据分析的范围,此方法允许在 Pol II 源中具有灵活性。在图 3中,我们使用来自不同来源的 Pol II 比较了反应。在前4个通道中显示的反应中,人工伸长复合物与内源性野生Pol II组装,从大鼠肝脏或裂变酵母中纯化,并按照上述方式行走,产生23人或25人。这些反应中使用的大鼠和裂变酵母Pol IIs使用多个色谱步骤被纯化为接近同质性。
该方法还可用于生成含有野生型或突变Pol II的人工伸长复合物,使用简单的一步纯化方法制备。图中的最后两个通道显示使用一种突变形式的人类Pol II进行的检测,该突变形式在其Rpb1子单位中缺乏CTD,Pol II催化活性不需要CTD,但有助于将转录与RNA封顶结合。这些测定中使用的无CTD Pol II通过抗FLAG免疫纯化从表达Flag表位标记版本的Rpb1的人类细胞系中纯化。必须指出,活性Pol II的浓度因准备和准备而异。因此,必须进行初始实验,其中反应中使用的Pol II量变化,以确定获得所需活性所需的量。
图 4显示了一个具代表性的测定示例,用于比较与含有 Pol II 的人工伸长复合物具有磷酸化或非磷酸化 CTD 相关的放射性标记转录转录的上限。对于这些测定法,按照协议2所述,制备了含有23个核苷酸转录剂的伸长复合物,其末端为5'-三磷酸)。
用封顶酶孵育伸长复合物会导致约1 nt的移动变化,表明增加了5'帽14,15。为了量化封顶反应,一个人确定封顶效率,以上限的RNA百分比表示。封顶效率是上限RNA与总RNA的比率,除以可获得的最大上限。在我们的测定中,我们发现从商业来源获得的RNA寡聚物的最大可获取上限为+85%,很可能是由于合成RNA的三磷酸化不完全。
在前3个通道中显示的反应中,用一般转录因子TFIIH和共同因子ATP孵育伸长复合物,在封顶前对Pol II CTD进行磷化。在这些反应中,在加入5 ng的封盖酶后,观察到接近最大封盖的±1分钟。当使用未用TFIIH孵育的伸长复合物进行测定时,需要近10倍的封顶酶来观察类似的封盖水平。图4的最后两个通道显示了在TFIIH存在的情况下,使用或不带封顶酶孵育伸长复合物的反应产物。重要的是,图中所示的共转录封顶人工伸长复合物的TFIIH依赖性与在更复杂的酶系统中启动转录的伸长复合物中观察到的非常类似5.
图1:人工伸长复合物的组装。(A) 20 nt 的RNA寡聚(深蓝)通过 9 nt . (B) RNA 聚合酶 II (Pol II) 的补充序列退火到 DNA 模板链 (绿色) 中,与退火 DNA:RNA 杂交混合,将 RNA 3'端定位在 Pol II 催化位点。(C) 在反应混合物中加入超过3'生物素化非模板链DNA寡聚物(浅蓝色)的摩尔,以封闭和进一步稳定伸长复合物。(D) 固定伸长复合物被洗涤以去除多余的寡核苷酸,并孵化适当的核苷酸组合,使Pol II能够将RNA寡聚物延长到所需的长度。RNA新合成的部分显示为黄色。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:Pol II使用不同长度的RNA寡聚物行走。(A) 人工伸长复合物图,显示行走过程中添加的核苷酸。非模板链和模板链DNA分别以浅蓝色和绿色显示。20 nt RNA 寡核糖核酸以深蓝色显示。还显示了在连续行走过程中添加的核苷酸,以产生23merRNA(橙色)、25mer RNA(棕色)和29merRNA(洋红色)。(B) 脱光凝胶电泳,显示使用20 nt RNA引体行走Pol II后获得的确定长度的RNA,如协议1所述。在协议的每个连续行走步骤中添加的核苷酸是颜色编码橙色(23mer)、棕色(25mer)和洋红色(29mer)。 (C) Pol II 以 29 nt RNA 引基开始行走,但完全与 B.(B 和 C) 中所示的一样,显示了同一凝胶的部分,但为了说明目的而分离。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:由含有野生型或突变Pol II的人工伸长复合物合成的转录。人工伸长复合物使用20 nt RNA引物和高度纯化的内源Pol II从大鼠肝脏或裂变酵母或FLAG免疫净化Pol II缺乏Rpb1从HeLa细胞(F:Rpb1-+CTD)。每个复合物中的RNA进一步扩展到23 nt或25 nt。有关详细信息,请参阅文本。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:共转录RNA封顶磷酸化依赖性活化。含有大鼠肝Pol II和放射性标记的23merRNA的人工伸长复合物用ATP和一般转录因子TFIIH或缓冲液孵育10分钟,使Pol II CTD磷酸化。洗涤后,用哺乳动物封顶酶的5 ng、15 ng或45 ng孵育出伸长复合物,用于1、2或4分钟。 在变性凝胶(顶部,前12个通道)中解决盖盖和未封顶的23个活体,并量化和绘制%上限RNA(下图)。该图的这一部分最初发表在参考文献5中,该参考文献在CC-BY许可证下作为开放访问文章发布。最后两个通道,来自一个单独的实验,说明在TFIIH存在的情况下,使用或不带封顶酶孵育伸长复合物的反应产物。请点击此处查看此图的较大版本。
| 序列 | 评论 | |
| RNA_20mer | ACUCUCCUCU古古阿 | 5' 三磷酸酯改性;PAGE 和 RP-HPLC 纯化 |
| RNA_29mer | ACUCUAUGCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUUCUUCUUCUA | 5' 三磷酸酯改性;PAGE 和 RP-HPLC 纯化 |
| 模板链DNA | CTACAGAGCTATATATATATA 塔格卡特格 |
双 PAGE 和 HPLC 纯化 |
| 非模板链DNA | 阿塔加阿加特加特加格塔格塔格塔格格 | 5' TEG-生物酸酯;HPLC 纯化 |
表1:DNA和RNA寡核苷酸
| 最终浓度 | 体积 | |
| 特里斯 HCl pH 7.5 | 12 mM* | |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1 μL |
| 300 mM KCl | 50 mM | 1.67 μL |
| 10 μM 模板链 DNA 寡核糖核酸(100 mM Tris-HCl pHH 7.5) | 1 μM | 1 μL |
| 10 μM RNA 寡聚物 在 10 mM Tris-HCl pH 7.5 中 |
2 μM | 2 μL |
| 水 | 4.33 μL | |
| 10 μL | ||
| *所有Tris-HCl均来自DNA和RNA寡核解决方案 | ||
表2:退火DNA和RNA寡核糖核酸的鸡尾酒
| Pol II 缓冲区 | 最终浓度 | 体积/反应 |
| 水 | 4.52 μL | |
| 50 mM MgCl2 | +4.67 mM | 1.40 μL |
| 250 mM 三轮车,pH 7.5 | 23 mM | 1.40 μL |
| 300 mM KCl | ±27 mM | 1.33 μL |
| 50% 甘油 | 3% | 0.9 μL |
| 20毫克/毫升 BSA | 0.5毫克/毫升 | 0.38 μL |
| 100 mM DTT | 0.5 mM | 0.08 μL |
| 10% PVA | 2% | 3 μL |
| 13 μl | ||
| 在使用缓冲区添加之前: | ||
| 退火模板链DNA:RNA(从表1) | 1 μL | |
| RNA聚合酶II | 1 μL | |
| *组合中的最终 KCl 浓度为 ±50 mM,额外的 KCl 来自 Pol II | ||
| *最终MgCl2和Tris HCl浓度分别为5 mM和25 mM, | ||
| 附加的MgCl2和Tris HCl来自退火的DNA:RNA产品。 | ||
表 3:Pol II 组合
| 非模板DNA缓冲液 | 最终浓度 | 体积/反应 |
| 水 | 4.48 μL | |
| 300 mM KCl | +43.33 mM | 2.17 μL |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1.50 μL |
| 250 mM 三轮车,pH 7.5 | 25 mM | 1.50 μL |
| 50% 甘油 | 3% | 0.9 μL |
| 20毫克/毫克 BSA | 0.5毫克/毫升 | 0.38 μL |
| 100 mM DTT | 0.5 mM | 0.08 μL |
| 10% PVA | 2% | 3 μL |
| 14 μL | ||
| 在使用缓冲区添加之前: | ||
| 5 μM 生物酸化非模板 DNA 寡聚物 | 1 μL | |
| *混合物中的最终KCl浓度为50 mM,额外的KCl来自非模板DNA寡核缓冲液。 | ||
表4:非模板DNA混合物
| 脉冲标记缓冲器 | 最终浓度 | 体积/反应 |
| 水 | 9.98 μL | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 5 μL |
| 50% 甘油 | 3% | 1.5 μL |
| 20毫克/毫克 BSA | 0.5毫克/毫升 | 0.63 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0.4 μL |
| 1 M Tris HCl,pH 7.9 | ±12 mM | 0.3 μL |
| 100 mM DTT | 0.5 mM | 0.13 μL |
| 1 M HEPES-NaOH,pH 7.9 | 3 mM | 0.08 μL |
| 10% PVA | 2% | 5 μL |
| 23 μL | ||
| 在使用缓冲区添加之前: | ||
| 15 μM ATP | 0.6 μM | 1 μL |
| 3.3 μM ±-32P_UTP | 0.13 μM | 1 μL |
| *最终Tris HCl浓度为20mM,额外的Tris HCl来自核苷酸缓冲液。 | ||
表 5:脉冲标记 NTP 组合
| 大通缓冲区 | 最终浓度 | 体积/反应 |
| Tris HCl, pH 7.5 | ±30 mM | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 1 μL |
| 水 | 0.6 μL | |
| 50% 甘油 | 3% | 0.3 μL |
| 10 mM DTT | 0.5 mM | 0.25 μL |
| 100 mM HEPES-NaOH,pH 7.9 | 3 mM | 0.15 μL |
| 20毫克/毫克 BSA | 0.5毫克/毫升 | 0.13 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0.08 μL |
| 10% PVA | 2% | 1 μL |
| 3.5 μL | ||
| 在使用缓冲区添加之前: | ||
| 100 μM UTP,100 μM ATP 稀释在 100 mM Tris-HCl 中,pH 7.5 | 5 μM | 1.5 μL |
| *所有Tris HCl都来自核苷酸缓冲液 |
表 6:大通 NTP 组合
| 最终浓度 | 体积/反应 | |
| 水 | 24.21 μL | |
| 1 M KCl | 60 mM | 1.8 μL |
| 50% 甘油 | 3% | 1.8 μL |
| 20毫克/毫升 BSA | 0.5毫克/升 | 0.75 μL |
| 1 M Tris HCl,pH 7.9 | 20 mM | 0.6 μL |
| 10% PVA | 0.2% | 0.6 μL |
| 100 mM DTT | 0.5 mM | 0.15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH,pH 7.9 | 3 mM | 0.09 μL |
| 30 μl |
表 7:清洗缓冲液
| 最终浓度 | 体积/反应 | |
| 水 | 14.13 μL | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 6 μL |
| 50% 甘油 | 3% | 1.8 μL |
| 20毫克/毫升 BSA | 0.5毫克/毫升 | 0.75 μL |
| 1 M Tris HCl,pH 7.9 | 20 mM | 0.6 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0.48 μL |
| 100 mM DTT | 0.5 mM | 0.15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH,pH 7.9 | 3 mM | 0.09 μL |
| 10% PVA | 2% | 6 μL |
| 30 μL |
表 8:基本转录缓冲器 (BTB)
| 停止缓冲区 | 最终浓度 | 体积/反应 |
| 水 | 55.74 μL | |
| 1 M Tris HCl,pH 7.5 | 10 mM | 0.6 μL |
| 5 M 纳Cl | 300 mM 纳Cl | 3.6 μL |
| 500 mM EDTA | 0.5 mM EDTA | 0.06 μL |
| 10% SDS | 0.2% SDS | 1.2 μL |
| 60 μL | ||
| 在使用缓冲区添加之前: | ||
| 15毫克/mL糖原 | 2 μL | |
| 20毫克/mL蛋白酶K | 2 μL | |
| 水 | 30 μL | |
表 9:停止混合
| 最终浓度 | 体积/反应 | |
| 水 | 11.9 μL | |
| 300 mM KCl | ±53.33 mM | 5.33 μL |
| 50% 甘油 | 3% | 1.8 μL |
| 1.5 μM GTP 稀释在 100 mM Tris HCl 中,pH 7.5 | 50 μM | 1 μL |
| 100 单位/mL 无机丙方磷酶,酵母 | 0.1 单位/反应 | 1 μL |
| 20毫克/毫升 BSA | 0.5毫克/毫升 | 0.75 μL |
| 1 M Tris HCl,pH 7.9 | 16.67 mM | 0.5 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0.48 μL |
| 100 mM DTT | 0.5 mM | 0.15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH,pH 7.9 | 3 mM | 0.09 μL |
| 10% PVA | 2% | 6 μL |
| 29 μL | ||
| 在使用缓冲区添加之前: | ||
| 封盖酶 | 1 μL | |
| *混合物中的最终KCl浓度为+60 mM,额外的KCl来自封顶酶和热磷酶 | ||
| *最终Tris HCl浓度为20 mM,额外的Tris HCl来自核苷酸缓冲液 | ||
表 10: 封盖组合
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Discussion
通过使用高度纯化的酶系统,可以大大促进研究,以解剖与Pol II伸长复合物耦合的事件,如RNA处理和转录伸长本身的调节。建立这种酶系统可能具有挑战性。Pol II 的启动子依赖转录至少需要五个一般转录因子。准备和储存这些因素可能需要数月时间;因此,在这个过程中的速率限制步骤往往只是准备在试管中重组基础转录所需的转录因子。
在本文中,我们描述了对以前开发的方法的适应,以产生人工转录伸长复合物2,3仅使用纯化Pol II和合成DNA和RNA寡核苷酸。所得的伸长复合物具有转录活性,适用于研究Pol II转录和RNA封顶5的耦合。需要注意的是,转录和RNA封顶发生在体内染色质和许多其他蛋白质的上下文中,这种定义的酶系统不存在;因此,这个系统预计将重述在体内发生的许多(但不是全部)反应的特征。我们描述的协议建立在以前的方法之上,通过生物素化DNA与磁珠结合固定人工伸长复合物,使研究人员能够轻松改变反应条件和/或去除未结合的核苷酸在不同检测阶段。重要的是,由于用于固定伸长复合物的标签位于DNA非模板链的一端,而不是在Pol II本身或模板链上,因此只有那些与完全伸长复合物相关的Pol II将保留在珠子上。
由于新生的转录本必须具有5'-三磷酸盐末端才能通过封盖酶进行修饰,因此用于封顶实验的合成RNA寡核苷酸是用5'-三磷酸基尼购买的。然而,未修饰的RNA寡聚物可用于其他应用,包括研究其他共转录RNA处理事件或调节Pol II伸长的转录因子的活动。无论下游应用如何,我们建议用高度纯化的DNA和RNA寡聚物组装伸长复合物。特别是,生物素化DNA寡聚物应用HPLC进行纯化,其他DNA和RNA寡聚物应通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和/或HPLC进行纯化。然而,酶活动的纯度必须逐案确定,并取决于每个实验的范围。
在组装的最后一步中加入非模板生物酸化DNA寡聚物,原则上应足以获得三元复合物。然而,我们总是包括至少一个"行走"步骤,以确认Pol II包含正确的核苷酸数量:如果实验的目标是生成用于化算共转录封顶或其他RNA处理步骤的基质,或者遵循Pol II伸长,我们总是在最初的"行走"中包括32个P标记的核苷酸,以便记录可以可视化,并使用未标记的"冷"核苷酸进行后续行走步骤,以便不同长度的抄本的特定活性保持不变。尽管该协议中描述的方法使用32个 P 标记核苷酸来可视化新生的转录本,但当无法使用放射性物质时,可以使用基于荧光的测定来测量 RNA 标记。然而,需要注意的是,这种测定的灵敏度通常比使用放射性标签的检测灵敏度低得多,而且它们通常需要大量的酶。
可重复实验的一个关键步骤是苯酚:氯仿:等亚基提取和乙醇沉淀过程中的RNA回收良好。我们发现,使用含有高密度凝胶的微离心管(见材料表)进行苯酚:氯仿:等酰提取可提高核酸的可重复性和产量。此外,在乙醇沉淀期间使用彩色糖原(见材料表)作为载体,使得人们更容易看到小核酸颗粒,从而不太可能在去除过程中因吸气而无意中失去颗粒。乙醇上清液。
使用类似于我们描述的方案产生的人工伸长复合物也可用于测量 Pol II 伸长复合物与调节转录本之间的蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸相互作用与伸长相关的伸长或RNA处理事件。在这种情况下,通过西方印迹或质谱法检测洗涤后仍与人工伸长复合物结合的蛋白质;放射性标记RNA是没有必要的,我们只用"冷"核苷酸做所有的转录步骤。
最后,该方法可用于转录复合物的结构分析。事实上,相关方法已用于冷冻-EM研究与酵母和哺乳动物酶重组封顶酶-Pol II相互作用13,以及Pol II与其他蛋白质或蛋白质复合物在伸长过程中相互作用12,暂停16,17,最近,绑定到核小体18。使用此方法生成的转录复合物的结构分析的一个可能的复杂性是需要从复合物中去除生物锡/磁珠;然而,这可以通过在DNA寡聚物中包括由限制性酶识别的特定位点,或使用在紫外线处理后被切断的生物锡链接剂来解决。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢S.Shuman提供哺乳动物封顶酶cDNA。这项工作部分得到了大堪萨斯城社区基金会海伦·纳尔逊医学研究基金的资助。 本手稿的原始数据可以从 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 的 Stowers 原始数据存储库访问。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
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