Summary
Aqui, nós descrevemos o conjunto de complexos do alongamento do polymerase II (pol II) do RNA que exigem somente o ADN sintético curto e oligonucleotídeos do RNA e o pol purificado II. Esses complexos são úteis para estudar mecanismos subjacentes ao processamento cotranscricional de transcrições associadas ao complexo de alongamento pol II.
Abstract
A síntese eucariótica do mRNA é um processo bioquímico complexo que exige a transcrição de um molde do ADN em um RNA do precursor pela enzima do RNA polymerase II do multi-subunit e o nivelamento e a emenda co-transcriptional do RNA do precursor para dar forma ao mRNA maduro. Durante a síntese de mRNA, o complexo de alongamento da RNA polimerase II é um alvo para regulação por uma grande coleção de fatores de transcrição que controlam sua atividade catalítica, bem como as enzimas de nivelamento, splicing e 3 '-Processing que criam o mRNA maduro. Por causa da complexidade inerente da síntese de mRNA, os sistemas experimentais mais simples que permitem o isolamento e a investigação de seus vários estágios co-transcriptional têm a grande utilidade.
Neste artigo, nós descrevemos um tal sistema experimental simples apropriado para investigar o tampar co-transcriptional do RNA. Este sistema confia nos complexos definidos do alongamento do polymerase II do RNA montados da polimerase purificada e das bolhas artificiais da transcrição. Quando imobilizados via DNA biotinilado, estes complexos de alongamento de RNA polimerase II fornecem uma ferramenta facilmente manipulável para dissecação de RNA de encapsulamento co-transcricional e mecanismos pelos quais o complexo de alongamento recruta e regula a enzima tampando durante capping co-transcriptional do RNA. Antecipamos que este sistema poderia ser adaptado para o estudo do recrutamento e/ou montagem de proteínas ou complexos proteicos com papéis em outros estágios de maturação do mRNA acoplados ao complexo de alongamento da RNA polimerase II.
Introduction
A síntese do RNA do mensageiro eucariótico (mRNA) é um processo bioquímico elaborado que envolva a síntese de um RNA precursor não processado pelo RNA polymerase II e Processando do RNA do precursor para render o mRNA maduro. As etapas de processamento do RNA de nivelamento, de emenda, e de poliadenilação são executadas pela maior parte co-transcripcionalmente. O complexo de alongamento pol II serve como um andaime que recruta e orquestra as atividades de muitas das enzimas de processamento de RNA. Conseqüentemente, nossa compreensão final de como os mRNAs eucarióticas maduros são gerados dependerá pesadamente no desenvolvimento de sistemas experimentais para permitir a dissecção dos mecanismos bioquímicos que subjacentes o recrutamento ao complexo do alongamento e regulação das enzimas responsáveis pelo nivelamento, splicing e poliadenilação cotranscricional.
Não surpreendentemente, o desenvolvimento de tais sistemas experimentais tem sido difícil. Um grande impedimento tem sido a notável complexidade da própria transcrição de pol II, onde simplesmente reconstituir a transcrição basal por pol II in vitro requer um conjunto mínimo de cinco fatores gerais de iniciação de transcrição: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH 1. Além disso, reconstituindo qualquer tipo de pol II regulamentada transcrição in vitro requer um conjunto ainda maior de fatores de transcrição e coregulators. Assim, um objetivo principal foi desenvolver sistemas experimentais mais simples que permitam a reconstituição de complexos de alongamento ativos de pol II adequados para investigações do acoplamento funcional da transcrição de pol II e do processamento de RNA.
Um método mais simples para a reconstituição de complexos de alongamento ativos de pol II provou ser útil para estudos estruturais e bioquímicos de alongamento pol II e, mais recentemente, para investigar o processamento de RNA co-transcricional2,3 ,4,5. Neste artigo, nós mostramos como os complexos do alongamento de pol II preparados das bolhas purificadas de pol II e de transcrição sintética podem ser usados eficazmente para investigar os mecanismos que subjacentes o nivelamento co-transcriptional de transcritos nascente de pol II.
Tampando refere-se à adição covalente de um 5 '-guanosina "tampão" para o 5 '-trifosfato final de nascente pol II transcrições. A PAC é importante para etapas subsequentes da maturação do mRNA, transporte, tradução e outros processos6,7. O tampão é adicionado co-transcripcionalmente aos transcritos de pol II por uma enzima referida como a enzima tampando. Em células de mamíferos, locais ativos responsáveis pelas atividades de RNA 5 '-trifosfatase e guanil transferase da enzima tampando estão contidos em um único polipeptídeo8. A enzima tampando é recrutada para o complexo de alongamento de pol II através de interações com superfícies ainda definidas no corpo de pol II e o domínio Rpb1 carboxy-terminal (CTD) fosforilado em Ser5 de suas repetições de heptapeptídeo5. No complexo do alongamento, a enzima tampando catalisa a adição de um tampão de 5 '-guanosine uma vez que o transcrito nascente alcança um comprimento de pelo menos 18 nucleotídeos e emergiu do canal da saída do RNA do polymerase. Na primeira etapa da reação tampando, o triphosphatase hidrolisa o RNA 5 '-triphosphate para render um 5 '-diphosphate. Na segunda etapa, o GTP é hidrolisado para GMP pelo guanil transferase, formando um intermediário de enzima GMP-tampando. Finalmente, o transferase do guanil transfere o PBF à extremidade 5 '-diphosphate do transcrito nascente para produzir a tampa.
Uma característica notável da reação tampando é que o nivelamento co-transcriptional (isto é, tampando dos transcritos associados com os complexos funcionais do alongamento de pol II) é muito mais eficiente do que tampando do RNA livre5,9. Assim, uma grande questão no campo tem sido como esta ativação dramática de nivelamento é alcançada através de interações da enzima tampando com o complexo de alongamento pol II. Neste protocolo nós descrevemos o conjunto de complexos ativos do alongamento do polymerase II do RNA que usam somente o polymerase purificado II do RNA e bolhas artificiais da transcrição. Estes métodos permitem a criação de complexos de alongamento de RNA polimerase II com transcrições de comprimento e seqüência definidos. Em um estudo recente, utilizamos estes complexos de alongamento de RNA polimerase II definidos como um modelo para investigar aspectos dos mecanismos do RNA tampando5. Em particular, nós mostramos que (i) o nivelamento do RNA associado com estes complexos do alongamento era mais do que 100-fold mais eficiente do que tampando do RNA livre e (II) foi estimulado pela fosforilação TFIIH-dependente do pol II CTD. A abordagem aqui descrita poderia, em princípio, ser adaptada para gerar substratos para o estudo de outras reações de processamento de RNA cotranscricional ligadas ao complexo de alongamento pol II.
Na seção 1 deste protocolo, os complexos artificiais do alongamento são criados recozimento um oligonucleotide sintético da vertente do ADN do molde a um oligonucleotide do RNA que seja complementar em seus 3 '-extremidade a aproximadamente 9 nucleotídeos do ADN da costa do molde. Pol II é então carregado no DNA: RNA duplex. O complexo do alongamento é terminado então pela adição de um oligonucleotide parcialmente complementar, do ADN da vertente do não-molde que seja etiquetado com a biotina em seus 3 '-extremidade (Figura 1 e Figura 2a). O oligonucleotide do RNA é estendido por pol II nestes complexos do alongamento para fazer transcritos radiolabeled do comprimento e da seqüência definidos em cima da adição de combinações apropriadas de nucleotides radiolabeled. Além disso, usando uma combinação de lavagens para remover nucleotídeos não incorporados e adição adicional de diferentes combinações de nucleotídeos, pode-se "andar" pol II para diferentes posições ao longo do modelo de DNA e sintetizar RNA de comprimentos definidos. O RNA é então purificado e submetido à eletroforese em géis de desnaturação da ureia. Na seção 2 do protocolo, complexos de alongamento artificial são usados para analisar a tampagem de RNA cotranscricional. O exemplo apresentado mede o efeito da fosforilação TFIIH-dependente do pol II CTD sobre a tampagem de RNA cotranscricional. Neste experimento, medimos a extensão do nivelamento cotranscricional em função da concentração da enzima tampando (5, 15 e 45 ng por reação) e tempo (1, 2 e 4 min).
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Protocol
1. montagem de complexos de alongamento artificial e pol II andando
- Imobilize 1 nmol do oligo do ADN do não-molde que contem uma molécula de 3 ' biotina em grânulos magnéticos.
Observação: as etapas a seguir podem ser feitas com antecedência para se preparar para experimentos futuros. Todas as sequências de oligo utilizadas neste protocolo são fornecidas na tabela 1. Os oligos de RNA são sintetizados com modificações de 5 '-trifosfato.- Adicione 200 μL de grânulos magnéticos (10 mg/mL) a um tubo de ligação de baixa proteína 1,5 mL e, em seguida, coloque em um rack magnético por 2 min.
- Enquanto o tubo está no rack magnético, retire o líquido do tubo sem perturbar as contas. Para lavar os grânulos, retire o tubo do rack, adicione 1 mL de 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, retorne o tubo para o rack, e retire a solução de lavagem após 2 min.
- Repita as lavas mais 2 vezes usando 200 μL do mesmo buffer.
- Ressuspender contas magnéticas em 400 μL de 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, tampão. Em seguida, misture com 380 μL de H2O e 20 μL de oligo de DNA biotinilado não modelo de 10 μm. Coloque o tubo sobre um pulverizador e incubar por 30 min à temperatura ambiente.
- Lavagem imobilizada não-template DNA oligo 3 vezes com 200 μL de 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl e, em seguida, 3 vezes com 200 μL de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL de albumina sérica bovina.
- Deixe o tubo durante a noite a 4 ° c para terminar o bloqueio de contas com BSA.
- No dia seguinte, colocar o tubo na cremalheira magnética, remover e descartar o líquido, e ressuspender contas em 200 μL de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL de albumina sérica bovina e transferência para um novo tubo. Para este modelo de DNA, a concentração final é de aproximadamente 5 μM.
Nota: O tempo de incubação e a concentração de oligo precisam ser empiricamente determinados para cada oligo de DNA biotinilado. Este modelo deve fornecer o suficiente para 200 reações, e durar pelo menos 6 meses quando armazenado a 4 ° c.
- O RNA de Anneal e o molde do ADN oligos do oligonucleotide da vertente em uma relação do molar 2:1 (20 e 10 pmol, respectivamente) para obter o ADN: duplex do RNA.
- Configurar uma mistura de recozimento de 10 μL conforme descrito na tabela 2.
Nota: 10 μL de mistura de recozimento são suficientes para 10 reacções. A mistura do recozimento pode ser escalada acima como necessário se mais ensaios devem ser executados. - Realize as reações de recozimento em um termociclador usando o seguinte programa: 5 min a 45 ° c, seguidos por 12 ciclos de 2 min cada, começando a 43 ° c e diminuindo a temperatura 2 ° c por ciclo. Ocioso a 4 ° c.
Nota: Este é um ponto de tempo flexível. O recozimento é terminado dentro de ~ 30 minutos mas pode ser deixado em 4 ° c por um período mais longo. No laboratório, as misturas do recozimento foram deixadas sentando-se para até 4 h sem observar nenhuma diminuição na eficiência da reação. - Quando o RNA do recozimento ao ADN da vertente do molde, prepare bufferes para umas etapas mais atrasadas do protocolo. Os ingredientes necessários para preparar cada tampão para uma única reação com cada tampão são alistados nas tabelas 2 a 8. Escale as receitas por um fator de [Y (X + 1) + 1] para Wash e (X + 1) para todos os outros buffers. X = número de reacções a preparar; Y = número de passos de lavagem necessários (mínimo 3).
Nota: Prepare todos os buffers frescos no dia do experimento. Não coloque os tubos no gelo após o PVA ter sido adicionado aos buffers. Adicionar pol II ou nucleotídeos para buffers direito antes de usar.
- Configurar uma mistura de recozimento de 10 μL conforme descrito na tabela 2.
- Carga purificada RNA polimerase II para o DNA: híbrido de RNA.
- Misturar 1 pmol (1 μL) de DNA: RNA duplex com 13 μL de tampão pol II (a partir da tabela 3).
- Adicionar ~ 0, 2 unidades de RNA purificado pol II (1 μL) à mistura a partir do passo 1.3.1 e misture suavemente com pipetagem para cima e para baixo e mexendo com ponta de Pipet, sem introduzir bolhas. Incubar por 10 min a 30 ° c.
Nota: Os volumes dados a partir de aqui são para uma única reação; aumentar conforme necessário para o número de reações no experimento. RNA Pol II purificado do fígado de rato como descrito10 é usado neste exemplo; no entanto, o RNA Pol II purificado de outras fontes, incluindo as células de mamíferos cultivadas ou levedura também pode ser usado3,4,5,11,12,13.
- Complete o complexo de alongamento por adição de DNA não-modelo biotinilado.
- Adicionar 5 pmol (1 μL) de oligo de DNA não-template imobilizado a 14 μL de tampão de DNA não modelo (da tabela 4), adicionar ao tubo da etapa 1.3.2 e incubar por 10 min a 37 ° c.
- Coloque a amostra em rack magnético por 2 min. Lave 1x com 30 μL de tampão de lavagem (da tabela 7) para remover pol II e oligos não incorporados.
- Gerar complexos de alongamento contendo RNA 23mers radiolabeled.
- Realize todas as incubações adicionais a 30 ° c. Adicione 1 μL de ATP de 15 μM e 10 μCi (1 μL) de [α-32P] UTP (3.000 CI/mmol) a 23 μL de tampão de pulso e use-o para suspender os grânulos magnéticos lavados.
Atenção: O material radioactivo é perigoso. Certifique-se de usar o equipamento de proteção apropriado e siga todas as diretrizes de laboratório para uso seguro e descarte de material radioativo.
Nota: Substitua UTP radiolabeled com 15 μM UTP quando o RNA radiolabeled não é necessário, como para experimentos ocidentais do borrão. - Incubar a reação por 10 min para permitir a síntese de 23mers radiolabeled.
- Adicionar 1,5 μL de solução contendo 100 μM de ATP e 100 μM de Mix UTP a 3,5 μL de tampão de perseguição, adicionar ao tubo contendo complexos de alongamento pré-montados e incubar por 5 min para perseguir todas as transcrições nascentes em 23mers.
- Coloque a amostra em rack magnético por 2 min, retire o sobrenadante, lave uma vez com 30 μL de tampão de lavagem para remover nucleotídeos não incorporados e ressuspender em 30 μL de tampão de lavagem.
- Adicione 94 μL de mistura de parada com proteinase K e glicogênio (tabela 9) para encerrar reações ou proceder à seção 1,6 para gerar complexos de alongamento com transcrições mais longas ou seção 2 para realizar ensaios de nivelamento.
- Realize todas as incubações adicionais a 30 ° c. Adicione 1 μL de ATP de 15 μM e 10 μCi (1 μL) de [α-32P] UTP (3.000 CI/mmol) a 23 μL de tampão de pulso e use-o para suspender os grânulos magnéticos lavados.
- Opcional Caminhe pol II para fazer transcrições de nucleotídeo 23, 25 e 29
- Siga o procedimento descrito nas etapas 1.2.1 a 1.5.4 para preparar complexos de alongamento contendo 23mers radiolabeled. Escale acima de 4 vezes para gerar 120 μL de complexos de alongamento lavado, que é bastante complexos para 4 reações.
- Etiqueta 3 novos tubos "23mer", "25mer" e "29mer". Transfira 30 μL de complexos de alongamento lavado para o tubo "23mer" e adicione 94 μL de mistura de paragem com proteinase K e glicogênio.
- Coloque o tubo contendo os restantes 90 μL de complexos de alongamento lavado no rack magnético por 2 min, retire o sobrenadante e reressuscitação de grânulos em 90 μL de BTB suplementado com 1,2 μL cada um dos 1,5 mM ATP e 1,5 mM CTP. Incubar por 10 min a 30 ° c.
- Depois de lavar uma vez com 90 μL de tampão de lavagem e ressuscitação em 90 μL de tampão de lavagem conforme descrito no passo 1.5.4, transfira 30 μL de complexos de alongamento para o tubo "25mer" e adicione 94 μL de mistura de paragem com proteinase K e glicogênio.
- Coloque o tubo contendo os restantes 60 μL de complexos de alongamento na cremalheira magnética durante 2 min, retire o sobrenadante e reressuscitação de grânulos em 60 μL de BTB suplementado com 0,8 μL cada um dos 1,5 mM ATP e 1,5 mM CTP.
- Incubar durante 10 min a 30 ° c, lave uma vez com 60 μL de tampão de lavagem como na secção 1.5.5, e ressuscitem em 60 μL de tampão de lavagem.
- Transfira 30 μL de uma amostra de 2x para o tubo "29mer" e adicione 94 μL de mistura de paragem com proteinase K e glicogênio ou prossiga para a secção 2 para realizar ensaios de nivelamento.
- Proceder à purificação e análise do RNA (secção 3).
2. usando complexos de alongamento artificial para ensaio Cotranscriptional tampando
- Gere complexos de alongamento lavados contendo 23mers, dimensionando o procedimento descrito nas etapas 1.2.1 a 1.5.5 13 vezes. Isto é suficiente para 12 reações + 1 extra.
-
Fosforilação de pol II CTD
- Coloque o tubo contendo complexos de alongamento lavado no rack magnético por 2 min, retire o sobrenadante, e ressuspender grânulos em 377 μL de BTB suplementado com 13 μL de 1,5 mM ATP.
- Prepare dois novos tubos, rotulados + H e-H, respectivamente. Para o tubo rotulado + H adicionar 3 μL de ~ 300 ng/μL TFIIH, e para o tubo rotulado-H adicionar 9 μL de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL de albumina sérica bovina.
Nota: Nós usamos tipicamente TFIIH purified do fígado do rato, mas nós obtivemos resultados similares usando ~ 0,6 μg/reação de recombinação comercialmente-disponível Cdk7/cyclin H/MAT1 (CAK, que é o módulo da quinase de TFIIH). Consulte a tabela de materiais para obter informações. - Adicionar 87 μL dos complexos de alongamento lavado do passo 2.2.1 ao tubo rotulado + H e 270 μL de complexos de alongamento lavado para o tubo rotulado-H. Incubar 10 min a 30 ° c.
- Coloque a amostra em rack magnético por 2 min. Para remover o excesso de nucleotídeos e proteínas não acopladas, lave complexos de alongamento em reações de + H e H com 90 μL ou 270 μL de tampão de lavagem, respectivamente.
-
Tampar de RNA
- Reressuscitar complexos de alongamento no tubo rotulado + H em 87 μL de mistura de tampamento (BTB suplementado com 50 μM GTP (tabela 10). Ressuscitar complexos de alongamento no tubo rotulado-H em 261 μL de mistura de tampamento.
- Prepare 4 novos tubos rotulados 5 ng CE + H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Diluir a enzima tampando (CE) em 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL de albumina sérica bovina para preparar soluções contendo 5 ng CE/μl, 15 ng CE/μL, ou 45 ng CE/μL e dispensar 3 μL da solução apropriada em cada um dos 4 tubos.
- Prepare 12 novos tubos com 94 μL de tampão de parada (2.1.1) adicionados a cada um.
- Comece cada reação tampando adicionando 87 μL do complexo do alongamento tratado com o TFIIH ou não aos tubos etiquetados que contêm a enzima tampando. Incubar a 30 ° c num bloco de calor.
- Após 1, 2 ou 4 min, pare as reações Transferindo 30 μL de cada mistura de reacção para tubos contendo 94 μL de tampão de paragem. Purificar e analisar produtos de reação conforme descrito na seção 3.
3. purificação e análise de RNA
- Purify o RNA
- Incubar produtos de reacção em tampão de paragem durante 20 min à temperatura ambiente.
Nota: Ponto de pausa. As amostras neste tampão foram mantidas para até 4 h sem perda ou degradação do RNA. - Extraia uma vez com 124 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) e uma vez com clorofórmio: álcool isoamílico (24:1).
Atenção: O fenol é extremamente tóxico e é rapidamente absorvido pela pele. Use o equipamento de proteção apropriado.
Nota: Para maximizar a recuperação do RNA durante a extração, use os tubos comercialmente disponíveis que contêm um gel high-density, que forma uma barreira estável entre fases aquosas e orgânicas. Consulte discussão e tabela de materiais. - Transfira a fase aquosa (camada superior) para novos tubos contendo 12,4 μL de acetato de sódio a 3 M pH 5,2.
- Incubar produtos de reacção em tampão de paragem durante 20 min à temperatura ambiente.
- Precipitação do etanol
- Adicionar 350 μL de 100% de etanol e misturar completamente por inversão.
- Incubar por pelo menos 10 min em gelo seco.
Nota: Ponto de pausa. Por conveniência, pode-se parar aqui e concluir o procedimento no dia seguinte; no entanto, é possível prosseguir diretamente para a etapa 3,3 e executar o gel no mesmo dia. O RNA pode ser mantido em-80 ° c por um par dias antes do processamento mais adicional, mas não deixa por uns tempos mais longos.
- Preparação de amostras de RNA para eletroforese em gel
- Permita que as amostras descongele, misture invertendo 2-3 vezes, e centrifugue por 15 minutos em 21.000 x g, 4 ° c, em um centrifugador do tabletop. Enquanto isso, configure a mistura de gel desnaturante (secção 3.4.1).
- Remova cuidadosamente o etanol das amostras sem o pellet perturbador.
- Adicionar 500 μL de 70% etanol, inverter tubo um par de vezes para lavar a pelota, e depois centrifugar novamente a 21.000 x g por 5 min em qualquer temperatura ambiente ou 4 ° c.
- Remova o máximo de etanol possível e faça uma rotação rápida (5-10 s) dos tubos em uma centrífuga de tampo da mesa. Em seguida, com uma ponta de carregamento de gel, retire o último volume restante de etanol.
- Ar-seco pellet para 3 min em temperatura ambiente.
- Dissolva o RNA adicionando 4 μL de H2o à parte superior de cada pelota. Incubar 5 min à temperatura ambiente.
- Adicione 4 μL de corante de RNA 2x (ver tabela de materiais) à mistura e, em seguida, vórtice cada tubo durante alguns segundos para resuspender totalmente o RNA.
Nota: A tintura do RNA que contem o formamida em vez da ureia é recomendada, desde que o último precipita em baixas temperaturas. - Gire rapidamente os tubos e, em seguida, incubar-os a 70 ° c por 10 min em um bloco de calor.
-
Armazene os tubos no gelo seco até que apronte para carregar no gel.
Nota: manter o RNA em gelo seco permite a flexibilidade para trabalhar em outros experimentos, enquanto o gel está polimerizando. As amostras não precisam ser reaquecidos após o descongelar. Entretanto, o RNA pode diretamente ser carregado após o aquecimento se o gel está pronto para funcionar.
- Preparando o gel da Urea-página
- Para a mistura de gel de 40 mL, combine em um tubo cônico de 50 mL: 16,7 g de ureia, 15 mL de 40% bis: solução de acrilamida (19:1 ratio), 4 mL de 10x TBE (1 M de Tris-HCl, 1 M de borato de sódio, 20 mM de EDTA) e 8 mL de H2O. Este volume é suficiente para um gel de tamanho padrão (18 cm de altura x 16 cm de largura) com espaçadores de 1,0 mm.
Atenção: A acrilamida é extremamente tóxica. Quando não houver nenhum risco da inalação quando estiver na solução, use sempre o revestimento, as luvas, e os vidros de segurança do laboratório ao segurar.
Nota: Esta mistura é para moldar uma desnaturação 15% gel de poliacrilamida, que prontamente resolve RNA entre 15-50 NT. mude a concentração de bis/acrylamide como necessário para resolver transcritos diferentes do RNA de comprimentos diferentes. - Coloc o tubo fechado que contem a mistura do gel em um pulverizador até que o urea esteja dissolvido inteiramente.
- Configurar a estação de fundição de gel com placas de vidro, espaçadores de 1 mm e um pente de 15 poços.
- Trabalhando rapidamente, adicione 40 μL de TEMED e 400 μL de solução de persulfato de amónio a 10% para solução de gel e misture bem. Usando um Pipet de 25 mL, derrame a solução do gel entre placas, pente da inserção, e permita que o gel polimerize pelo menos 2 h.
Nota: Se o gel é derramado mais de 2 h antes de usar, uma vez que tem polimerizado cobri-lo com toalha de papel úmido (deixando o pente no lugar) e enrole com plástico envoltório para impedi-lo de secar.
- Para a mistura de gel de 40 mL, combine em um tubo cônico de 50 mL: 16,7 g de ureia, 15 mL de 40% bis: solução de acrilamida (19:1 ratio), 4 mL de 10x TBE (1 M de Tris-HCl, 1 M de borato de sódio, 20 mM de EDTA) e 8 mL de H2O. Este volume é suficiente para um gel de tamanho padrão (18 cm de altura x 16 cm de largura) com espaçadores de 1,0 mm.
- Desnaturação gel RNA eletroforese
- Após a polimerização, transferência de gel para o tanque de corrida e pre-executá-lo em 20 mA em 1x TBE para 15-30 min.
- Enquanto isso, descongelar amostras (se congeladas), vortex, e girá-los por 4 min em 2.000 x g, 4 ° c.
- Quando estiver pronto, desligue a fonte de alimentação e Lave cuidadosamente cada poço com 1x TBE usando uma seringa.
- Use pontas do gel-carregamento para carregar amostras no gel.
- Executar gel em uma constante 20-30 mA para cerca de 2 h ou até menor corante (xileno cianol FF) atinge a parte inferior do gel.
- Retire o gel, coloque-o sobre um pedaço de papel absorvente, e enrole com plástico Wrap.
- Expor o gel radiolabeled a um phosphorscreen.
- Digitalize o phosphorscreen usando um phosphorimager e analise a imagem.
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Representative Results
As figuras 2 e 3 mostram reações representativas do resultado usadas para gerar complexos artificiais do alongamento que contêm transcrições de comprimentos diferentes estendendo ou pol II das fontes diferentes. A Figura 4 mostra como esses complexos de alongamento podem ser usados para o ensaio de fosforilação cotranscricional CTD-dependente de RNA tampando.
A Figura 2a é um diagrama de moléculas de DNA e RNA em complexos de alongamento artificial. A Figura 2b mostra transcrições de diferentes comprimentos gerados em reações realizadas exatamente como descrito no protocolo 1, em que os complexos de alongamento artificial inicial foram preparados usando um oligo de RNA sintético de 20 NT (azul escuro na Figura 2a ; RNA_20mer, tabela 1). Como sabemos o comprimento de RNA inicial e a sequência de modelos de DNA, podemos determinar o subconjunto de nucleotides — ATP, CTP, GTP ou UTP — necessário para percorrer pol II para uma posição definida ao longo do modelo. O número de nucleotídeos recém-sintetizados é adicionado ao tamanho inicial da cartilha de oligonucleotídeo RNA para determinar o comprimento esperado final (tamanho do RNA oligo + número de nucleotídeos adicionados). Na presença de ATP e UTP, pol II pode adicionar 3 NT ao oligo do RNA de 20 NT para gerar os complexos do alongamento que contêm um RNA 23mer. Se um lava afastado região ATP e UTP e adiciona então o ATP e o CTP, o oligo de 20 NT é estendido por 2 NT para fazer um 25mer, e se um então outra vez lava nucleotídeos região afastado e adiciona ATP e GTP, o Transcript é estendido uns 4 NT adicionais para fazer um 29mer. Sin o CE as transcrições recentemente geradas correspondem ao tamanho esperado do RNA e desde que quase todos os 23mers radiolabeled podem quantitativamente ser perseguidos em uns produtos mais longos, um sabe que usando este método (i) o oligo do RNA é posicionado corretamente na saída de pol II canal durante a montagem e (II) RNAs radiolabeled são associados com os complexos ativos do alongamento de pol II.
A Figura 2C mostra uma variação do protocolo, em que os complexos de alongamento inicial foram preparados usando o mesmo modelo de DNA e oligos de vertente não-modelo e um oligo RNA (RNA_29mer, tabela 1) que contém 9 nucleotídeos adicionais em seu 5 '-fim mas é de outra maneira idêntica na seqüência ao oligo do RNA de 20 NT. Porque o comprimento inicial do RNA é 29 NT neste caso, os complexos do alongamento que contêm 32mer, 34mer, e 38mer transcritos podem ser gerados usando as mesmas etapas de passeio de pol II descritas acima.
Dependendo do escopo de análise, este método permite flexibilidade na fonte de pol II. Na Figura 3 , comparamos as reações usando pol II de diferentes fontes. Nas reações mostradas nas primeiras 4 vias, complexos de alongamento artificial foram montados com endógena, tipo selvagem pol II purificada a partir de fígado de rato ou levedura de fissão e caminhou como descrito acima para gerar 23mers ou 25mers. O fermento de rato e fissão pol IIs utilizado nestas reações foram purificados para perto de homogeneidade utilizando múltiplas etapas cromatográficas.
O método pode igualmente ser usado para gerar os complexos artificiais do alongamento que contêm o tipo selvagem ou o mutante pol II preparado usando um método simples, de uma etapa da purificação. As duas últimas faixas na figura mostram ensaios realizados usando uma forma mutante de humano pol II que carece da CTD em sua subunidade Rpb1, o que não é necessário para a atividade catalítica pol II, mas ajuda a transcrição de casal para a tampagem de RNA. O CTD-less pol II utilizado nestes ensaios foi purificado por imuno-purificação de anti-FLAG a partir de uma linha celular humana expressando um epítopo da FLAG com a versão marcada de Rpb1. É importante notar que a concentração de pol II ativa variará desde a preparação até a preparação. Assim, é essencial realizar experimentos iniciais em que a quantidade de pol II usada em reações é variada para determinar a quantidade necessária para obter a atividade desejada.
A Figura 4 mostra um exemplo representativo de um ensaio comparando a tampagem de transcritos radiomarcado associados a complexos de alongamento artificial contendo pol II com CTD fosforilada ou não fosforilada. Para esses ensaios, foram preparados complexos de alongamento contendo 23 transcritos de nucleotídeo com uma extremidade de 5 '-trifosfato, conforme descrito no protocolo 2.
A incubação de complexos de alongamento com enzima tampando leva a um deslocamento de mobilidade de cerca de 1 NT, indicando a adição de um tampão de 5 '14, 15. Para quantificar as reações de nivelamento, uma determina a eficiência tampando, expressada como a porcentagem do RNA que é tampado. A eficiência tampando é a relação do RNA tampado ao RNA total, dividido pelo tampamento obtenível máximo. Em nossos ensaios encontramos o máximo de nivelamento obtenível de RNA oligos obtido a partir de fontes comerciais é de ~ 85%, provavelmente devido à trifosforilação incompleta do RNA sintético.
Nas reações mostradas nas primeiras 3 vias, os complexos de alongamento foram incubados com o fator de transcrição geral TFIIH e o co-fator ATP para fossificar o pol II CTD antes da tampagem. Nestas reações, a limitação máxima próxima foi observada ~ 1 minuto após a adição de 5 ng da enzima tampando. Quando os ensaios foram realizados usando complexos de alongamento que não são incubados com TFIIH e, portanto, contêm pol II não fosforilado, demorou quase 10 vezes mais enzima tampando para observar níveis semelhantes de tampando. As duas últimas faixas da Figura 4 mostram os produtos de reações em que os complexos de alongamento foram incubados com ou sem enzima tampando, na presença de TFIIH. É importante ressaltar que a TFIIH-dependência de complexos de alongamento artificial de nivelamento cotranscricional demonstrado nesta figura é muito semelhante àquela observada em complexos de alongamento que iniciaram a transcrição em um promotor em sistemas enzimáticos mais complexos a 5.
Figura 1: montagem de complexos de alongamento artificial. (A) o RNA oligo (azul escuro) de 20 NT é recozido a uma vertente do molde do ADN (verde) com uma seqüência complementar de 9 NT. (B) o RNA POLYMERASE II (pol II) é misturado com o ADN recozido: híbrido do RNA para posicionar o RNA 3 '-extremidade no local catalítico de pol II. (C) um excesso do molar de 3 ' o oligo biotinylated do ADN da vertente do não-molde (azul claro) é adicionado à mistura da reação para delimitar e estabilizar mais o complexo do alongamento. (D) complexos de alongamento imobilizados são lavados para remover o excesso de oligos e incubados com combinações apropriadas de nucleotídeos para permitir que pol II estenda o RNA oligo ao comprimento desejado. A parte recém-sintetizada do RNA é mostrada em amarelo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: pol II andando usando oligos de RNA de diferentes comprimentos. (A) diagrama de complexos de alongamento artificial, mostrando nucleotídeos adicionados durante as caminhadas. A vertente do não-molde e o ADN da vertente do molde são mostrados na luz-azul e verde, respectivamente. O oligo de RNA de 20 NT é mostrado em azul escuro. Também são mostrados nucleotídeos adicionados durante sucessivas caminhadas para gerar RNA 23mer (laranja), 25mer RNA (marrom), e 29mer RNA (magenta). (B) eletroforese em gel desnaturante mostrando RNAs de comprimento definido obtido após a marcha de pol II utilizando uma cartilha de RNA de 20 NT, conforme descrito no protocolo 1. Nucleotídeos adicionados durante cada passo sequencial do protocolo são cor laranja codificado (23mer), marrom (25mer), e magenta (29mer). (C) pol II andando começando com um primer de RNA de 29 NT, mas de outra forma exatamente como o mostrado em b. (b e C) mostram partes do mesmo gel, mas foram separadas para fins ilustrativos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: transcritos sintetizados por complexos de alongamento artificial contendo tipo selvagem ou mutante pol II. Os complexos artificiais do alongamento foram montados usando a primeira demão do RNA de 20 NT e o pol II endógeno altamente purified do fígado do rato ou do fermento da fissão ou da bandeira immunopurified pol II que faltam o Rpb1 das pilhas de HeLa (F: Rpb1-ΔCTD). O RNA em cada complexo foi estendido mais a 23 NT ou a 25 NT. Consulte o texto para obter detalhes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: ativação da fosforilação dependente da tampagem de RNA cotranscricional. Os complexos artificiais do alongamento que contêm o fígado do rato pol II e o RNA 23mer radiolabeled foram incubados com ATP e o fator geral tfiih da transcrição ou tampão por 10 minutos ao fosforilar o pol II CTD. Após a lavagem, os complexos de alongamento foram incubados com 5 ng, 15 ng, ou 45 ng de enzima de nivelamento de mamíferos para 1, 2 ou 4 min. tampado e sem tampos 23mers foram resolvidos em um gel de desnaturação (Top, primeiras 12 pistas) e o% de RNA tampado foi quantificado e plotado (inferior). Esta parte da figura foi publicada originalmente na Ref 5, que foi publicada como um artigo de acesso aberto uma licença CC-by. As duas últimas pistas, que vêm de uma experiência separada, ilustram os produtos de reações em que os complexos de alongamento foram incubados com ou sem a enzima tampando, na presença de TFIIH. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Seqüência | Comentários | |
| RNA_20mer | O ACUCUTCAUGUCUO | 5 ' modificação de trifosfato; Página & RP-HPLC purificada |
| RNA_29mer | O ACUCUTAUGACUCUBUCAUGUCUO | 5 ' modificação de trifosfato; Página & RP-HPLC purificada |
| Template Strand DNA | CTACGGTTAAGCTCACGGTACATTTCTGAA TTAAGCATCATGG |
PÁGINA dupla & HPLC purificada |
| Não-template Strand DNA | ATCAGAAATGTACCGTGAGCTTAACCGTAG | 5 ' TEG-biotinylated; HPLC purificada |
Tabela 1: DNA e RNA oligonucleotídeos
| Concentração final | Volume | |
| Tris HCl pH 7,5 | 12 mM * | |
| 50 mM MgCl2 | de 5 mM | 1 μL de |
| 300 milímetros KCl | 50 milímetros | 1,67 μL |
| 10 μM template Strand DNA oligo em 100 mM Tris-HCl pH 7,5 | 1 μM | 1 μL de |
| 10 μM de RNA oligo em 10 mM Tris-HCl pH 7,5 |
2 μM | 2 μL de |
| Água | 4,33 μL | |
| 10 μL de | ||
| * All Tris-HCl vem de DNA e soluções de RNA oligo | ||
Tabela 2: coquetel para recozimento de DNA e RNA oligos
| Tampão de pol II | Concentração final | Volume/reacção |
| Água | 4,52 μL | |
| 50 mM MgCl2 | ^ 4,67 milímetro | 1,40 μL |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | ^ 23 milímetros | 1,40 μL |
| 300 milímetros KCl | * 27 mM | 1,33 μL |
| 50% glicerol | 3 | 0,9 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 milímetros | 0, 8 μL |
| 10% PVA | 2 | 3 μL de |
| 13 μl | ||
| Direito antes de usar o buffer adicionar: | ||
| ADN recozido da vertente do molde: RNA (da tabela 1) | 1 μL de | |
| RNA polimerase II | 1 μL de | |
| * A concentração final de KCl na mistura é ~ 50 milímetro, com o KCl adicional que vem de pol II | ||
| ^ As concentrações finais de MgCl2 e de Tris HCl são 5 milímetros e 25 milímetros respectivamente, | ||
| O MgCl adicional2 e o Tris HCl vêm do ADN recozido: produto do RNA. | ||
Quadro 3: mistura pol II
| Buffer de DNA não-template | Concentração final | Volume/reacção |
| Água | 4,48 μL | |
| 300 milímetros KCl | * 43,33 milímetro | 2,17 μL |
| 50 mM MgCl2 | de 5 mM | 1,50 μL |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | de 25 mM | 1,50 μL |
| 50% glicerol | 3 | 0,9 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 milímetros | 0, 8 μL |
| 10% PVA | 2 | 3 μL de |
| 14 μL de | ||
| Direito antes de usar o buffer adicionar: | ||
| 5 μM biotinylated não-modelo oligo DNA | 1 μL de | |
| * A concentração final de KCl na mistura é 50 milímetros, com o KCl adicional que vem do tampão do oligo do ADN do não-molde. | ||
Tabela 4: mistura do ADN do não-molde
| Amortecedor de rotulagem do pulso | Concentração final | Volume/reacção |
| Água | 9,98 μL | |
| 300 milímetros KCl | 60 milímetros | 5 μL de |
| 50% glicerol | 3 | 1,5 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,63 μL |
| 500 mM MgCl2 | de 8 mM | 0,4 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | * 12 milímetros | 0,3 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 milímetros | 0,13 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | de 3 mM | 0, 8 μL |
| 10% PVA | 2 | 5 μL de |
| 23 μL de | ||
| Direito antes de usar o buffer adicionar: | ||
| 15 μM ATP | 0,6 μM | 1 μL de |
| 3,3 μM [α-32P] UTP | 0,13 μM | 1 μL de |
| * A concentração final do HCl de tris é 20mM, com o HCl adicional de Tris que vem do amortecedor do nucleotide. | ||
Tabela 5: pulso que etiquetam a mistura de NTP
| Tampão da perseguição | Concentração final | Volume/reacção |
| Tris HCl, pH 7,5 | * 30 mM | |
| 300 milímetros KCl | 60 milímetros | 1 μL de |
| Água | 0,6 μL | |
| 50% glicerol | 3 | 0,3 μL |
| 10 mM DTT | 0,5 milímetros | 0,25 μL |
| 100 mM HEPES-NaOH, pH 7,9 | de 3 mM | 0,15 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,13 μL |
| 500 mM MgCl2 | de 8 mM | 0, 8 μL |
| 10% PVA | 2 | 1 μL de |
| 3,5 μL | ||
| Direito antes de usar o buffer adicionar: | ||
| 100 μM UTP, 100 μM ATP diluído em 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 | 5 μM | 1,5 μL |
| * Todos os Tris HCl vem do tampão do nucleotide |
Tabela 6: perseguição NTP Mix
| Concentração final | Volume/reacção | |
| Água | 24,21 μL | |
| 1 M KCl | 60 milímetros | 1,8 μL |
| 50% glicerol | 3 | 1,8 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/mL | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | de 20 mM | 0,6 μL |
| 10% PVA | 0,2% de | 0,6 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 milímetros | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | de 3 mM | 0, 9 μL |
| 30 μl |
Tabela 7: tampão de lavagem
| Concentração final | Volume/reacção | |
| Água | 14,13 μL | |
| 300 milímetros KCl | 60 milímetros | 6 μL de |
| 50% glicerol | 3 | 1,8 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | de 20 mM | 0,6 μL |
| 500 mM MgCl2 | de 8 mM | 0,48 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 milímetros | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | de 3 mM | 0, 9 μL |
| 10% PVA | 2 | 6 μL de |
| 30 μL de |
Tabela 8: tampão de transcrição base (BTB)
| Parar o buffer | Concentração final | Volume/reacção |
| Água | 55,74 μL | |
| 1 M Tris HCl, pH 7,5 | de 10 mM | 0,6 μL |
| 5 M NaCl | 300 mM NaCl | 3,6 μL |
| 500 mM EDTA | 0,5 mM EDTA | 0, 6 μL |
| 10% SDS | 0,2% SDS | 1,2 μL |
| 60 μL | ||
| Direito antes de usar o buffer adicionar: | ||
| 15 mg/mL de glicogênio | 2 μL de | |
| 20 mg/mL proteases K | 2 μL de | |
| Água | 30 μL de | |
Tabela 9: parar a mistura
| Concentração final | Volume/reacção | |
| Água | 11,9 μL | |
| 300 milímetros KCl | * 53,33 milímetro | 5,33 μL |
| 50% glicerol | 3 | 1,8 μL |
| 1,5 μM GTP diluído em 100 mM Tris HCl, pH 7,5 | 50 μM | 1 μL de |
| 100 unidades/mL Pyrophosphatase inorgânico, fermento | 0,1 unidades/reação | 1 μL de |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | ^ 16,67 milímetro | 0,5 μL |
| 500 mM MgCl2 | de 8 mM | 0,48 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 milímetros | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | de 3 mM | 0, 9 μL |
| 10% PVA | 2 | 6 μL de |
| 29 μL de | ||
| Direito antes de usar o buffer adicionar: | ||
| Enzima tampando | 1 μL de | |
| * A concentração final de KCl na mistura é ~ 60 milímetro, com o KCl adicional que vem da enzima tampando e da pirofosfatase | ||
| ^ A concentração final de Tris HCl é 20 milímetros, com o HCl adicional de Tris que vem do amortecedor do nucleotide | ||
Tabela 10: tampando a mistura
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Discussion
Os estudos que procuram dissecar eventos acoplados ao complexo do alongamento de pol II tais como o processamento do RNA e a regulação do alongamento do transcrito próprio podem extremamente ser facilitados pelo uso de um sistema altamente purified da enzima. A criação de tais sistemas enzimáticos pode ser desafiador. A transcrição dependente do promotor por pol II requer pelo menos cinco fatores gerais de transcrição. Preparar e estocar esses fatores pode levar meses; Portanto, a etapa limitante deste processo é, muitas vezes, simplesmente preparar o quadro de fatores de transcrição necessários para reconstituir a transcrição basal no tubo de ensaio.
Neste artigo, nós descrevemos uma adaptação de métodos previamente desenvolvidos para gerar complexos artificiais do alongamento da transcrição2,3 usando somente o pol II purified e o ADN sintético e o RNA oligonucleotides. Os complexos de alongamento resultantes são transcripcionalmente ativos e são adequados para o uso na investigação do acoplamento da transcrição de pol II e do RNA tampando5. É importante notar que a transcrição e a tampagem de RNA ocorrem in vivo no contexto da cromatina e muitas outras proteínas não presentes neste sistema enzimático definido; Portanto, este sistema é esperado para recapitular muitos, mas não todos, características de reações que ocorrem in vivo. O protocolo que nós descrevemos constrói em métodos precedentes imobilizando complexos artificiais do alongamento com o ADN biotinylated limitado aos grânulos magnéticos, permitindo que o investigador mude facilmente condições da reação e/ou remova nucleotídeos região durante diferentes estágios de ensaios. Importante, porque a etiqueta usada para imobilizar complexos do alongamento está em uma extremidade da vertente do não-molde do ADN um pouco do que no pol II próprio ou na vertente do molde, somente aqueles pol IIs associado com os complexos completos do alongamento serão retidos em grânulos.
Porque as transcrições nascente devem ter uma extremidade 5 '-triphosphate a fim ser modificadas pela enzima tampando, os oligonucleotídeos sintéticos do RNA usados para os experimentos tampando são comprados com 5 '-triphosphate Termini. No entanto, os oligos RNA não modificados podem ser usados para outras aplicações, incluindo estudos de outros eventos de processamento de RNA cotranscricional ou as atividades de fatores de transcrição que regulam o alongamento de pol II. Independentemente da aplicação a jusante, recomendamos a montagem de complexos de alongamento com DNA altamente purificado e oligos RNA. Em particular, os oligos biotinylated do ADN devem ser purificados pela HPLC, e outros oligos do ADN e do RNA devem ser purificados pela electroforese do gel do poliacrilamida e/ou pela HPLC. A pureza das atividades enzimáticas, no entanto, terá que ser determinada caso a caso e dependerá do escopo de cada experimento.
Adicionar o oligo de DNA não-modelo biotinilado na última etapa da montagem deve ser, em princípio, suficiente para obter um complexo ternário. No entanto, nós sempre incluímos pelo menos um passo "andando" para confirmar que pol II incorpora o número correto de nucleotídeos: se o objetivo do experimento é gerar substratos para a limitação de nivelamento cotranscricional ou outras etapas de processamento de RNA ou para seguir pol II alongamento, nós sempre incluímos um 32P-rotulado ribonucleotídeo na "caminhada" inicial para que a transcrição possa ser visualizada e usar nucleotídeos "frios" sem rótulo para etapas subsequentes de caminhada para que a atividade específica de transcrições de diferentes comprimentos permanece constante. Embora o método descrito neste protocolo use 32P-os nucleotídeos etiquetados para visualizar transcritos nascente, os ensaios fluorescência-baseados podem ser usados para medir a rotulagem do RNA quando não é possível trabalhar com materiais radioativos. No entanto, é importante notar que a sensibilidade de tais ensaios é tipicamente muito menor do que aqueles que usam rótulos radioativos, e eles geralmente exigem maiores quantidades de enzima.
Um passo fundamental para experimentos reprodutíveis é a boa recuperação do RNA durante o fenol: clorofórmio: extração de isoamilo e precipitação de etanol. Descobrimos que o uso de tubos de microcentrífuga contendo géis de alta densidade (ver tabela de materiais) para fenol: clorofórmio: extração de isoamilo aumenta a reprodutibilidade e rendimento do ácido nucleico a partir desta etapa. Além disso, o uso de glicogênio colorido (ver tabela de materiais) como portador durante a precipitação do etanol torna mais fácil de ver pequenas pelotas de ácido nucleico, tornando-se menos provável que um inadvertidamente perde a pelota, aspirando-o durante a remoção do sobrenadante de etanol.
Complexos de alongamento artificial gerados usando protocolos semelhantes àqueles que descrevemos também devem ser úteis para medir interações proteína-proteína ou ácido nucleico-proteína entre o complexo de alongamento pol II e fatores que regulam a transcrição eventos de alongamento ou de processamento de RNA ligados ao alongamento. Neste caso, as proteínas que permanecem ligadas a complexos de alongamento artificial após a lavagem são detectadas por western blotting ou espectrometria de massas; o RNA de radiomarcação não é necessário e nós fazemos todas as etapas da transcrição com somente nucleotides "frios".
Finalmente, esse método pode ser utilizado para análises estruturais de complexos de transcrição. De fato, métodos relacionados têm sido utilizados em estudos Cryo-EM com levedura e enzimas de mamíferos para reconstituir a tampagem enzima-pol II interações13, e interações de pol II com outras proteínas ou complexos proteicos durante o alongamento12, Pausando16,17, e mais recentemente, ligado a um Nucleossomo18. Uma possível complicação para as análises estruturais dos complexos de transcrição gerados utilizando este método é a necessidade de remover a biotina/grânulos magnéticos do complexo; Entretanto, isto pode ser resolvido incluindo em locais específicos do oligos do ADN reconhecidos por enzimas da limitação ou usando os linkers da biotina que são clivados fora após o tratamento do raio UV19.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a S. Shuman por fornecer a enzima tampando de mamíferos cDNA. Este trabalho foi apoiado em parte por uma subvenção para o Instituto de pesquisa médica de Stowers do fundo de pesquisa médica de Helen Nelson na fundação da Comunidade da grande Kansas City. Os dados originais subjacentes a este manuscrito podem ser acessados a partir do repositório de dados original do Stowers em http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
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