Summary
כאן, אנו מתארים את ההרכבה של RNA פולימראז II (Pol II) מתחמי התארכות הדורשים רק די-אן-איי סינתטי ו-RNA olig, ומטוהרים פול II. מתחמי אלה שימושיים עבור מנגנוני לימוד בבסיס עיבוד שכונתיות של התעתיקים הקשורים למכלול התארכות פול השני.
Abstract
הסינתזה של eukaryotic הוא תהליך ביוכימיים מורכב המחייב תמלול של תבנית DNA לתוך RNA מקודמת על ידי אנזים רב subunit RNA פולימראז II ו-co-transcript השילוב של RNA הקודמן כדי ליצור את mRNA בוגרת. במהלך סינתזה mRNA, מתחם התארכות RNA פולימראז II הוא יעד לרגולציה על ידי אוסף גדול של גורמי שעתוק השולטים בפעילות הקטליטית שלה, כמו גם הסגירה, השילוב, ו 3 '-עיבוד אנזימים היוצרים את mRNA בוגרת. בגלל המורכבות הטבועה של סינתזה של mRNA, מערכות ניסוי פשוטות יותר המאפשרות בידוד וחקירה של שלבי ההמרה השונים שלה יש תועלת רבה.
במאמר זה, אנו מתארים אחד מערכת ניסיונית פשוטה כזו המתאימה לחקירת הסגירה שיתוף RNA. מערכת זו מסתמכת על הגדרת RNA פולימראז II מתחמי התארכות התאספו מ פולימראז מטוהרים ובועות תעתיק מלאכותי. כאשר מקיבוע באמצעות ה-DNA biotinylated, אלה מתחמי התארכות RNA פולימו II מספקים כלי manipulable בקלות לניתוח מנגנוני הסגירה של RNA ומנגנונים שבהם מורכבות התארכות המגוייסים ומווסת את האנזים הסגירה במהלך שיתוף עם הסגירה של RNA. אנו מצפים מערכת זו יכול להיות מותאם ללימוד גיוס ו/או הרכבה של חלבונים או מתחמי חלבונים עם תפקידים בשלבים אחרים של התבגרות mRNA בשילוב למכלול התארכות RNA פולימראז II.
Introduction
Eukaryotic RNA (mRNA) סינתזה היא תהליך ביוכימיים מורכבים המערבת סינתזה של רנ א מעובד מעובד על ידי RNA פולימראז II ועיבוד של RNA הקודמן להניב mRNA בוגרת. פעולות עיבוד ה-RNA של הסגירה, החבור והפוליאדלציה מתבצעות במידה רבה באופן משותף. מתחם התארכות פול השני משמש כפיגום שמגוייסים ומתזמונים את פעילותם של רבים מאנזימי העיבוד של RNA. כתוצאה מכך, ההבנה האולטימטיבית של הדרך בה מופקים מערכת mrnas בוגרת, תסתמך במידה רבה על פיתוח מערכות נסיוניות כדי לאפשר ניתוח של המנגנונים הביוכימיים המשמשים לגיוס למכלול התארכות ו התקנה של אנזימים האחראים לסגירה משותפת, שחבור ופוליאדלציה.
לא באופן מפתיע, פיתוח מערכות נסיוניות כאלה היה קשה. מכשול גדול כבר המורכבות המדהימה של שעתוק פול השני עצמו היכן פשוט מחדש את התמלול בסיס על ידי פול השני בפריפרייה דורש קבוצה מינימלית של חמישה גורמים כלליים ליזום שעתוק: TFIIB יברות, TFIIB, TFIIB, TFIIB, ו TFIIB 1. יתר על כן, מחדש כל סוג של שעתוק פול II מוסדר בתוך מבחנה דורש קבוצה גדולה עוד יותר של מרכיבי שעתוק ומתאמים. כך, המטרה העיקרית הייתה לפתח מערכות ניסיוני פשוט המאפשר החוקה של מתחמי התארכות פעיל פול השני מתאים לחקירות של הזיווג הפונקציונלי של שעתוק פול השני ו-RNA עיבוד.
אחת שיטה פשוטה כזאת לחידוש מתחמי התארכות החדש של פול השני הוכיחה שימושי עבור מחקרים מבניים וביוכימיים של להאריך Pol II ו, לאחרונה, עבור חקירת שיתוף RNA עיבוד2,3 ,4,5. במאמר זה, אנו מראים כיצד פול התארכות מתחמים הכין מטוהרים פול II ובועות תמלול סינתטי ניתן להשתמש ביעילות כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים שיתוף החוצה של התעתיקים המתהווה פול השני.
הסגירה מתייחסת התוספת הקוולנטי של 5 '-guanosine "כובע" כדי 5 '-triphosphate לסיים את התעתיקים פול השני המתהווה. הכובע חשוב עבור השלבים הבאים של mrna התבגרות, תחבורה, תרגום, ותהליכים אחרים6,7. הכובע מתווסף בשיתוף פעולה לתעתיקים של פול השני על ידי אנזים המכונה אנזים סגירה. בתאי היונקים, אתרים פעילים האחראים RNA 5 '-triphosphatase ו guanylyl טרנספראז פעילויות של אנזים הסגירה כלולים בתוך פוליפטידים אחד8. האנזים הסגירה מגויס למכלול התארכות פול השני באמצעות אינטראקציות עם זאת כדי להיות משטחים מוגדרים על הגוף Pol II והתחום Rpb1 xy-מסוף (CTD) זרחניות על Ser5 הפטניות שלה חוזר על5. במתחם התארכות, האנזים הסגירה מזרז תוספת של 5 '-guanosine כובע פעם התעתיק המתהווה מגיע לאורך של לפחות 18 נוקלאוטידים והגיח מערוץ היציאה של RNA פולימראז. בשלב הראשון של תגובת הסגירה, triphosphatase הידרו RNA 5 '-triפוספט כדי להניב 5 '-diphosphate. בשלב השני, gtp הוא ידרוליזה ל-GMP על ידי guanylyl transferase, ויוצרים ביניים אנזים הסגירה של gmp. לבסוף, guanylyl טרנספראז העברת GMP לקצה 5 '-diphosphate של התעתיק המתהווה לייצר את הכובע.
תכונה יוצאת דופן של תגובת הסגירה היא שיתוף הסגירה המשותף (כלומר, הסגירה של התעתיקים הקשורים עם מכלולי התארכות פול 2 של פונקציונלי) הוא הרבה יותר יעיל מאשר הסגירה של RNA חינם5,9. לפיכך, השאלה העיקרית בתחום הייתה כיצד הפעלה דרמטית זו של הסגירה מושגת באמצעות אינטראקציות של אנזים הסגירה עם קומפלקס התארכות פול השני. בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההרכבה של פעיל RNA פולימראז II מתחמי התארכות באמצעות מטוהרים רק RNA פולימראז II ובועות תעתיק מלאכותי. שיטות אלה לאפשר יצירה של RNA פולימראז II מתחמי התארכות עם תעתיקים של אורך ורצף מוגדר. במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו אלה מוגדרים RNA פולימראז II מתחמי התארכות כמודל לחקירת היבטים של מנגנוני הסגירה של RNA5. בפרט, הראנו כי (אני) הסגירה של RNA הקשורים עם מתחמי התארכות אלה היה יותר מ 100-קיפול יעיל יותר מאשר הסגירה של RNA חינם ו (ii) היה מגורה על ידי TFIIH תלוי זרחון של השני של הפול CTD. הגישה המתוארת כאן יכולה עקרונית להיות מותאם כדי ליצור מצעים עבור לימוד אחרים שיתוף ההמרה לעיבוד RNA תגובות הקשורות למכלול התארכות פול II.
בסעיף 1 של פרוטוקול זה, מכלולי התארכות מלאכותיים נוצרים על-ידי חישול תבנית סינתטי גדיל ה-DNA olig, הגאות ל-RNA olig, משלימה ב 3 '-end שלה כ 9 נוקלאוטידים של ה-DNA תבנית סטרנד. פול II נטען לאחר מכן על ה-DNA: רנ א דופלקס. מתחם התארכות מושלם לאחר מכן על-ידי תוספת של משלימה באופן חלקי, DNA שאינו תבנית של החיבור האלחוטי, אשר מתויג עם ביוטין ב 3 '-end (איור 1 ואיור 2a). ה-RNA olig, הגאות והשפל מורחב על ידי פול השני במערכות התארכות אלה כדי להפוך את התעתיקים המוגדרים של האורך והרצף בתוספת של שילובים הולמים של הנוקלאוטידים. בנוסף, שימוש בשילוב של שוטף כדי להסיר נוקלאוטידים משולבים ותוספת נוספת של צירופים שונים של נוקלאוטידים, אחד יכול "ללכת" פול II למיקומים שונים לאורך תבנית ה-DNA ולסנתז RNA של אורכי מוגדר. RNA הוא לאחר מכן מטוהר ונתון לאלקטרופורזה בדאתהיכה שתנן-דף ג ' לים. בסעיף 2 לפרוטוקול, מערכות התארכות מלאכותיות משמשות לניתוח הסגירה של RNA שכונתיות. הדוגמה המוצגת מודדת את ההשפעה של זרחון התלוי ב-TFIIH של ה-CTD של הפול השני בנוגע לסגירה משותפת של RNA. בניסוי זה, אנו מודדים את היקף הסגירה של שיתוף הפעולה כפונקציה של הגבלת ריכוז האנזים (5, 15 ו 45 ng לכל תגובה) וזמן (1, 2 ו 4 דקות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הרכבת של מכלולי התארכות מלאכותיים ופול השני הליכה
- השתק 1 nmol של שאינם תבנית DNA oligo המכיל 3 ' ביוטין מולקולה על חרוזים מגנטיים.
הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים מראש כדי להתכונן לניסויים עתידיים. כל רצפי oligo המשמשים בפרוטוקול זה מסופקים בטבלה 1. ה-RNA oligos מסונתז עם 5 '-triphosphate שינויים.- הוסף 200 μL של חרוזים מגנטיים (10 מ"ג/mL) לתוך כריכת חלבון נמוך 1.5 mL שפופרת, ולאחר מכן מניחים על מדף מגנטי עבור 2 דקות.
- בעוד הצינור הוא על המדף המגנטי, להסיר את הנוזל מהצינור מבלי להפריע את החרוזים. כדי לשטוף את החרוזים, להסיר את הצינור מארון התקשורת, להוסיף 1 מ ל 5 mM טריס-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M הנאגל, להחזיר את הצינור לארון התקשורת, ולהסיר את הפתרון לשטוף לאחר 2 דקות.
- חזור על שוטף 2 פעמים נוספות באמצעות 200 μL של אותו מאגר.
- השעיה מחדש חרוזים מגנטיים ב 400 μL של 10 מ"מ מילימטר טריס-HCl pH 7.5, 1 מ"מ EDTA, 2 M הנאל, מאגר. לאחר מכן לערבב עם 380 μL של H2O ו 20 μl של 10 μm לא תבנית ביולוגית DNA oligo. מניחים את הצינור על הצינורית והדגירה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף ללא קיבוע תבנית DNA oligo 3 פעמים עם 200 μL של 5 mM טריס-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M הנאל, ולאחר מכן 3 פעמים עם 200 μL של 20 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% גליצרול, 100 mM KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 mg/mL סרום הפרה.
- השאירו שפופרת לילה ב 4 ° צ' כדי לסיים את החרוזים עם BSA.
- למחרת, מניחים את הצינור בארון המגנטי, להסיר ולמחוק את הנוזל, ו מחדש מחרוזות ב 200 μL של 20 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% גליצרול, 100 mM KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 mg/mL סרום הפרה אלבומין ולהעביר לצינור חדש. עבור תבנית זו של DNA, ריכוז סופי הוא כ 5 μM.
הערה: דגירה הזמן הריכוז oligo צריך להיות מקובע עבור כל דנ א biotinylated. תבנית זו צריכה לספק מספיק עבור 200 תגובות, והאחרונה לפחות 6 חודשים כאשר מאוחסנות ב -4 ° c.
- אנאל RNA ותבנית ה-DNA מגדיל את הזרם באמצעות היחס הטוחנת 2:1 (20 ו-10 pmol, בהתאמה) כדי להשיג את ה-DNA: רנ א דופלקס.
- הגדרת שילוב ריפוי של 10 μL כפי שמתואר בטבלה 2.
הערה: 10 μl של חישול ערבוב מספיקים עבור 10 תגובות. את ערבוב הריפוי ניתן לשנות בהתאם לצורך, אם יש לבצע מספר רב יותר. - בצעו את תגובות הריפוי בציקלנר תרמי באמצעות התוכנית הבאה: 5 דקות ב 45 ° c, ואחריו 12 מחזורים של 2 דקות כל אחד, החל ב 43 ° c והפחתת הטמפרטורה 2 ° c לכל מחזור. לא פעיל ב -4 ° c.
הערה: זוהי נקודת זמן גמישה. הריפוי מסתיים בתוך ~ 30 דקות, אך ניתן להשאיר אותו ב -4 ° c לתקופה ארוכה יותר. במעבדה, תערובות ריפוי נשארו לשבת עד 4 שעות מבלי לצפות בירידה ביעילות התגובה. - בעוד הריפוי RNA ל-DNA סטרנד תבנית, להכין מאגרים לשלבים מאוחרים יותר של הפרוטוקול. החומרים הדרושים כדי להכין כל מאגר עבור תגובה אחת עם כל מאגר מפורטים בטבלאות 2 עד 8. קנה מידה של מתכונים בפקטור של [Y (X + 1) + 1] עבור כביסה ו-(X + 1) עבור כל המאגרים האחרים. X = מספר התגובות שיש להכין; Y = מספר צעדי כביסה הדרושים (מינימום 3).
הערה: הכינו את כל המאגרים רעננים ביום הניסוי. אין למקם צינורות על הקרח לאחר PVA נוספה למאגרים. הוסף את Pol II או נוקלאוטידים למאגרים בדיוק לפני השימוש.
- הגדרת שילוב ריפוי של 10 μL כפי שמתואר בטבלה 2.
- טען מטוהרים RNA פולימראז II אל ה-DNA: RNA היברידי.
- מערבבים 1 pmol (1 μL) של ה-DNA: רנ א דופלקס עם 13 μL של מאגר פול II ( מלוח 3).
- להוסיף ~ 0.02 יחידות של RNA מטוהרים פול II (1 μL) לתערובת משלב 1.3.1 ולערבב על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה וזע עם טיפ פיפט, מבלי להציג בועות. מודקון עבור 10 דקות ב 30 ° c.
הערה: כמויות שניתנו מכאן והלאה הן לתגובה אחת; לעלות בקנה מידה לפי הצורך במספר התגובות בניסוי. RNA פול II מטוהר מכבד חולדה כמתואר10 משמש בדוגמה זו; עם זאת, RNA Pol II מטוהרים ממקורות אחרים, כולל תאים מהיונקים התרבותי או שמרים יכול לשמש גם3,4,5,11,12,13.
- השלם את מכלול התארכות על-ידי הוספת דנ א של תבנית ביולוגית ללא תבניות.
- הוסף 5 ליטר (1 μL) של מקיבוע DNA שאינו תבנית העיצוב ל -14 μL של מאגר DNA ללא תבנית ( מטבלה 4), להוסיף צינור משלב 1.3.2, ו דגירה עבור 10 דקות ב 37 ° c.
- מניחים את המדגם בארון תקשורת מגנטית עבור 2 דקות. לשטוף 1x עם 30 μL של מאגר לשטוף ( מטבלה 7) כדי להסיר את משולב פול השני ו oligos.
- הפקת מכלולי התארכות המכילים רדיויניום בעלי מערכות RNA 23mers.
- בצע את כל הincubations הנוספות ב -30 ° c. להוסיף 1 μL של 15 μM ATP ו 10 μCi (1 μL) של [α-32P] utp (3,000 ci/ממול) עד 23 μl של מאגר הדופק ולהשתמש בו כדי להשהות מחדש את החרוזים מגנטי שטף.
זהירות: . חומר רדיואקטיבי הוא מסוכן הקפידו ללבוש ציוד הגנה מתאים ולעקוב אחר כל הנחיות המעבדה לשימוש בטוח ולסילוק חומרים רדיואקטיביים.
הערה: החלף את UTP עם 15 μM UTP כאשר רנ א הוא לא נחוץ, כגון ניסויים כתמי המערבי. - מקרינה את התגובה עבור 10 דקות כדי לאפשר סינתזה של הרדיו 23mers מרס.
- הוסף 1.5 μL של פתרון המכיל 100 μM ATP ו-100 μM UTP ערבוב כדי 3.5 μL של מאגר מרדף, להוסיף צינור המכיל מתחמי התארכות מראש, ו דגירה עבור 5 דקות כדי לרדוף אחר כל התעתיקים המתהווה לתוך 23mers.
- מניחים את המדגם בארון תקשורת מגנטית עבור 2 דקות, להסיר את supernatant, לשטוף פעם אחת עם 30 μL של מאגר לשטוף כדי להסיר נוקלאוטידים משולבים, ולהשעות מחדש 30 μL של מאגר לשטוף.
- או להוסיף 94 μL של להפסיק לערבב עם הפרוטאינאז K ו הגליקוגן (שולחן 9) כדי לסיים את התגובות או להמשיך בסעיף 1.6 כדי ליצור מתחמי התארכות עם תעתיקים יותר או סעיף 2 לבצע סגירה assays.
- בצע את כל הincubations הנוספות ב -30 ° c. להוסיף 1 μL של 15 μM ATP ו 10 μCi (1 μL) של [α-32P] utp (3,000 ci/ממול) עד 23 μl של מאגר הדופק ולהשתמש בו כדי להשהות מחדש את החרוזים מגנטי שטף.
- אופציונלי ללכת פול II כדי להפוך 23, 25, ו 29 נוקלאוטיד התעתיקים
- בצע את ההליך המתואר בשלבים 1.2.1 באמצעות 1.5.4 כדי להכין מכלולי התארכות המכילים מרכזי לאורך 23 מרס. קנה מידה 4-קיפול להפקת 120 μL של מכלולי התארכות שנשטפו, אשר מתחמים מספיק עבור 4 תגובות.
- תווית 3 צינורות חדשים "23mer", "25mer" ו-"29mer". העברה 30 μL של שטף מכלולי התארכות כדי "23mer" הצינור ולהוסיף 94 μL של להפסיק לערבב עם והגליקוגן.
- מניחים את הצינור המכיל את הנותרים 90 μL של שטוף מתחמי התארכות בארון תקשורת מגנטית עבור 2 דקות, להסיר את supernatant, ו מחדש חרוזים ב 90 μL של BTB בתוספת 1.2 μL כל אחד 1.5 mM ATP ו 1.5 mM CTP. מודקון עבור 10 דקות ב 30 ° c.
- לאחר שטיפת פעם אחת עם 90 μL של לשטוף את המאגר ואת השעיית מחדש ב 90 μL של מאגר לשטוף כמתואר בשלב 1.5.4, העברה 30 μL של מכלולי התארכות ל "25mer" צינור ולהוסיף 94 μL של להפסיק לערבב עם הגליקוגן ומוספים.
- מניחים את הצינור המכיל את הנותרים 60 μL של מתחמי התארכות במדף המגנטי עבור 2 דקות, להסיר את supernatant, ו מחדש חרוזים ב 60 μL של BTB בתוספת 0.8 μL כל אחד מ-ATP 1.5 מילימטר ו-1.5 mM CTP.
- דגירה עבור 10 דקות ב 30 ° צ', לשטוף פעם אחת עם 60 μL של מאגר לשטוף כמו בסעיף 1.5.5, ולהשעות מחדש ב 60 μL של מאגר לשטוף.
- העברה 30 μL ממדגם 2x כדי "29mer" צינור ולהוסיף 94 μL של להפסיק לערבב עם פרוטטינואז K ו הגליקוגן או להמשיך לסעיף 2 לבצע הסגירה assays.
- המשך לטיהור וניתוח RNA (סעיף 3).
2. שימוש במערכות התארכות מלאכותיות לגבי שיטת שמיפות
- צור מכלולי התארכות שנשטפו המכילים 23mers על ידי שינוי קנה המידה של ההליך המתואר בשלבים 1.2.1 באמצעות 1.5.5 13-קיפול. זה מספיק 12 תגובות + 1 תוספת.
-
פול השני CTD זירחון
- מניחים את הצינור המכיל שטף התארכות מתחמי במדף המגנטי עבור 2 דקות, להסיר את supernatant, ו מחדש חרוזים 377 μL של BTB בתוספת עם 13 μL של 1.5 mM ATP.
- הכינו שתי שפופרות חדשות, המסומנות כ-H ו-H, בהתאמה. לצינור המסומן + H להוסיף 3 μL של ~ 300 ng/μL TFIIH, ועל הצינור המסומן-H להוסיף 9 μL של 20 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% גליצרול, 100 mM KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 mg/mL סרום של שור.
הערה: אנו בדרך כלל משתמשים TFIIH מטוהרים מכבד חולדה, אבל יש לנו השיגו תוצאות דומות באמצעות ~ 0.6 μg/התגובה של מסחרית-רקומביננטי Cdk7/ציקלונים H/MAT1 (עוגה, שהוא מודול קינאז מ TFIIH). ראה טבלת חומרים למידע. - הוסף 87 μL של מכלולי התארכות שטף משלב 2.2.1 לצינור המסומן + H ו 270 μL של מכלולי התארכות שנשטפו אל הצינור המסומן-H. דגירה 10 דקות ב 30 ° c.
- מניחים דגימה בארון תקשורת מגנטי עבור 2 דקות. כדי להסיר העודפים נוקלאוטידים וחלבון לא מאוגד, לשטוף מכלולי התארכות ב + H ו-H תגובות עם 90 μL או 270 μL של מאגר לשטוף, בהתאמה.
-
הסגירה של RNA
- מחדש מכלולי התארכות בצינור המסומן + H ב 87 μL של שילוב הסגירה (BTB בתוספת 50 μM GTP (שולחן 10). השעיית מכלולי התארכות מחדש בצינור המסומן-H ב 261 μL של ערבוב הסגירה.
- הכינו 4 צינורות חדשים המסומנים 5 ng CE + H, 5 ng לסה נ, 15 ng לסה נ, 45 ng CE. לדלל את האנזים הסגירה (לסה נ) לתוך 20 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% גליצרול, 100 mM KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 mg/mL סרום הפרה אלבומין להכין פתרונות המכילים 5 ng CE/μL, 15 ng לסה נ/μL, או 45 ng לסה נ/μl ומחלק 3 μL של הפתרון המתאים לתוך כל אחד 4 צינורות.
- להכין 12 צינורות חדשים עם 94 μL של מאגר העצירה (2.1.1) נוסף לכל.
- התחל כל תגובת הסגירה על ידי הוספת 87 μL של מורכבות התארכות שטופלו TFIIH או לא לתייג צינורות המכילים אנזים הסגירה. מודטה ב -30 ° c בבלוק חום.
- אחרי 1, 2, או 4 דקות, להפסיק את התגובות על ידי העברת 30 μL של כל תערובת התגובה צינורות המכילים 94 μL של מאגר לעצור. לטהר ולנתח מוצרי תגובה כמתואר בסעיף 3.
3. רנ א טיהור וניתוח
- לטהר את ה-RNA
- מוצרים התגובה מודטה במאגר לעצור עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: . נקודת השהיה דגימות במאגר זה נשמר עד 4 שעות ללא אובדן או השפלה של RNA. - לחלץ פעם אחת עם 124 μL של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (25:24:1) ופעם עם כלורופורם: isoamyl אלכוהול (24:1).
זהירות: פנול הוא רעיל מאוד והוא נספג במהירות על ידי העור. . תלבש ציוד הגנה מתאים
הערה: כדי למקסם את ההתאוששות של RNA במהלך החילוץ, השתמש בצינורות הזמינים מסחרית המכילה ג'ל בצפיפות גבוהה, המהווה מחסום יציב בין שלבים מימית ואורגניים. ראה דיון ורשימת חומרים. - להעביר את השלב מימית (השכבה העליונה) לצינורות חדשים המכילים 12.4 μL של 3 M סודיום אצטט pH 5.2.
- מוצרים התגובה מודטה במאגר לעצור עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- משקעים באתנול
- הוסף 350 μL של 100% אתנול ולערבב ביסודיות על ידי היפוך.
- דגירה לפחות 10 דקות על קרח יבש.
הערה: . נקודת השהיה לנוחיותכם, ניתן לעצור כאן ולהשלים את ההליך ביום שלמחרת; עם זאת, ניתן להמשיך ישירות לשלב 3.3 ולהפעיל את הג באותו יום. RNA ניתן לשמור ב-80 ° c לכמה ימים לפני העיבוד הנוסף, אבל לא לעזוב במשך זמן רב יותר.
- הכנת דגימות RNA עבור אלקטרופורזה בג
- אפשר דגימות להפשיר, לערבב על ידי היפוך 2-3 פעמים, ו צנטריפוגה עבור 15 דקות ב 21,000 x g, 4 ° c, ב צנטריפוגה שולחן. בינתיים, להגדיר מיקס ג'ל הרפתקאות (סעיף 3.4.1).
- להסיר בזהירות אתנול מדגימות ללא גלולה מטרידה.
- הוסף 500 μL של 70% אתנול, היפוך צינור כמה פעמים כדי לשטוף את הגלולה, ולאחר מכן צנטריפוגה שוב ב 21,000 x g עבור 5 דקות או בטמפרטורת החדר או 4 ° c.
- הסר כמו אתנול הרבה ככל האפשר ולעשות ספין מהיר (5-10 s) של צינורות בצנטריפוגה השולחן העליון. לאחר מכן, עם טיפ העמסה ג'ל, להסיר את הנפח האחרון שנותר של אתנול.
- כיפת האוויר יבש 3 דקות בטמפרטורת החדר.
- לפזר RNA על ידי הוספת 4 μL של H2O לחלק העליון של כל גלולה. משטח הטמפרטורה 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 4 μL של צבען 2x RNA (ראה טבלת חומרים) לתערובת, ולאחר מכן מערבולת כל צינור במשך כמה שניות כדי להשהות מחדש את RNA.
הערה: לצבוע RNA המכיל כיוון במקום אוריאה מומלץ, שכן האחרון מזרז בטמפרטורות נמוכות. - מהיר לסובב את הצינורות, ולאחר מכן הדגירה אותם ב 70 ° c עבור 10 דקות בבלוק חום.
-
לאחסן צינורות על קרח יבש עד מוכן לטעון על ג'ל.
הערה: שמירת רנ א על קרח יבש מאפשרת את הגמישות לעבוד על ניסויים אחרים בעוד הג הוא פולימניזציה. אין צורך לחמם מחדש דגימות לאחר הפשרה. עם זאת, RNA יכול להיות טעון ישירות לאחר החימום אם ג'ל מוכן לרוץ.
- הכנת ג'ל לעמוד אוריאה
- עבור 40 mL ג'ל לערבב, לשלב 50 מ ל שפופרת חרוטי: 16.7 g של אוריאה, 15 מ ל של 40% bis: הפתרון אקרילאמיד (19:1 יחס), 4 מ ל של 10x TBE (1 M טריס-HCl, 1 M נתרן borate, 20 מ"מ EDTA), ו 8 מ ' של H2O. כרך זה מספיק עבור ג'ל אחד גודל סטנדרטי (18 ס"מ גובה x 16 ס"מ רוחב) עם 1.0 mm מרווחים.
זהירות: אקרילאמיד הוא רעיל מאוד. למרות שאין סיכון באינהלציה כאשר הוא בפתרון, יש לענוד תמיד מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי בטיחות בזמן הטיפול.
הערה: תערובת זו היא עבור השלכת הרפתקאות 15% פוליאקרילמיד ג'ל, אשר פותר בקלות RNA בין 15-50 nt. לשנות את הריכוז של bis/אקרילאמיד לפי הצורך כדי לפתור תעתיקים שונים של RNA באורכים שונים. - מניחים צינורית סגורה המכילה ג'ל לערבב על הנטור עד אוריאה הוא התפרקה לחלוטין.
- כוונן את התחנה ליציקת ג'ל עם צלחות זכוכית, מרווח של 1 מ"מ ומסרק של 15 היטב.
- עבודה במהירות, להוסיף 40 μL של TEMED ו 400 μL של 10% אמוניום מפרסולפט הפתרון ג'ל ומערבבים היטב. באמצעות 25 מ ל pipet, למזוג את התמיסה ג'ל בין צלחות, להוסיף מסרק, ולאפשר ג'ל לפולימו עבור לפחות 2 h.
הערה: אם הג נשפך יותר מ 2 לפני השימוש, ברגע שהוא מכסה את המכסה עם מגבת נייר לח (משאירים את המסרק במקום) ועוטפים עם ניילון נצמד כדי למנוע את התייבשות.
- עבור 40 mL ג'ל לערבב, לשלב 50 מ ל שפופרת חרוטי: 16.7 g של אוריאה, 15 מ ל של 40% bis: הפתרון אקרילאמיד (19:1 יחס), 4 מ ל של 10x TBE (1 M טריס-HCl, 1 M נתרן borate, 20 מ"מ EDTA), ו 8 מ ' של H2O. כרך זה מספיק עבור ג'ל אחד גודל סטנדרטי (18 ס"מ גובה x 16 ס"מ רוחב) עם 1.0 mm מרווחים.
- ג'ל לייצור מ, אלקטרופורזה ב-RNA
- לאחר פולימוניזציה, ג'ל העברה לטנק ריצה מראש להפעיל אותו ב 20 mA ב 1x TBE עבור 15-30 דקות.
- בינתיים, דגימות הפשרה (אם קפואים), מערבולת, ו לסובב אותם 4 דקות ב 2,000 x g, 4 ° c.
- כאשר מוכנים, לכבות את אספקת החשמל, ובזהירות לשטוף כל טוב עם 1x באמצעות מזרק.
- השתמש בטיפים לטעינת ג'ל כדי לטעון דגימות על ג'ל.
- הפעל ג'ל באופן קבוע 20-30 mA עבור 2 h או עד הצבע התחתון (xylene FF) מגיע לתחתית של ג'ל.
- מסירים את הג, מניחים אותו על נייר סופג, ועוטפים עם עטיפת ניילון.
- לחשוף את ג'ל הקרינה למסך זרחי.
- סרוק את הזצג באמצעות פוספרוורידים ונתח את התמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דמויות 2 ו- 3 להראות התגובה הייצוגית משמש ליצירת מתחמי הארכה מלאכותית המכילה תעתיקים של אורכים שונים על ידי הרחבת או פול השני ממקורות שונים. איור 4 מתאר כיצד אלה מתחמי התארכות ניתן להשתמש כדי לחשב שכונתיות ctd מותנית בסגירה של RNA.
איור 2A היא דיאגרמה של DNA ו-RNA מולקולות במערכות התארכות מלאכותיות. איור 2B מראה תעתיקים של אורך שונה שנוצר בתגובות שבוצעו בדיוק כפי שמתואר בפרוטוקול 1, שבו מתחמי התארכות המלאכותית המתחילים הוכנו באמצעות RNA סינתטי אוליגו של 20 nt (כחול כהה באיור 2b ; RNA_20mer, שולחן 1). מאחר שאנו מכירים את אורך ה-RNA המתחיל ואת רצף תבנית ה-DNA, אנחנו יכולים לקבוע את קבוצת המשנה של נוקלאוטידים — ATP, CTP, GTP, או UTP — הכרחי ללכת פול II למיקום מוגדר לאורך התבנית. מספר הנוקלאוטידים החדש מסונתז מתווסף לגודל ההתחלתי של RNA olig, הגאות והשפל כדי לקבוע את האורך הצפוי הסופי (RNA oligo גודל + מספר של נוקלאוטידים הוסיף). בנוכחות של ATP ו-UTP, פול השני יכול להוסיף 3 nt ל 20 nt RNA oligo כדי ליצור מתחמי התארכות המכילים ה-RNA 23mer. אם אחד שוטף משם ATP ו-UTP משולבים ולאחר מכן מוסיף ATP ו-CTP, 20 nt oligo מורחב על ידי 2 nt לעשות 25mer, ואם אחד שוב שוטף הרחק נוקלאוטידים משולבים ומוסיף ATP ו GTP, התעתיק הוא הרחיב נוסף 4 nt לעשות 29mer. סין ce התעתיקים שנוצר לאחרונה תואמים את הגודל הצפוי RNA ומאז כמעט כל הקרינה 23mers ניתן לכמת לתוך מוצרים ארוכים יותר, אחד יודע כי באמצעות שיטה זו (i) ה-RNA oligo ממוקם כראוי ביציאה Pol השני ערוץ במהלך ההרכבה ו-(ii) RNAs משויכים עם מתחמי התארכות פעיל של פול השני.
איור 2c מראה וריאציה של הפרוטוקול, שבו מתחמי התארכות ההתחלה הוכנו באמצעות אותה תבנית DNA ושאינו הגדיל התבנית ו-RNA oligos (RNA_29mer, טבלה 1) המכילה 9 נוספים נוקלאוטידים ב שלה 5 '-end אבל הוא זהה אחרת ברצף על 20 nt RNA oligo. בגלל אורך ה-RNA ההתחלתי הוא 29 nt במקרה זה, מתחמי התארכות המכילים 32mer, 34 מר, ו 38mer התעתיקים ניתן ליצור באמצעות אותו שלבים הליכה פול השני המתואר לעיל.
בהתאם להיקף הניתוח, שיטה זו מאפשרת גמישות במקור של Pol II. באיור 3 אנו משווים תגובות באמצעות פול השני ממקורות שונים. בתגובות המוצגות בארבעת הנתיבים הראשונים, מכלולי התארכות מלאכותיים התאספו עם אנדוגני, מסוג פראי פול השני מטוהר מכבד חולדה או שמרים ביקוע והלכו כמתואר לעיל כדי לייצר 23mers או 25mers. החולדה ביקוע שמרים פול IIs בשימוש בתגובות אלה היו מטוהרים לקרבת הומוגניות באמצעות שלבים כרומטוגרפי מרובים.
השיטה יכולה לשמש גם כדי ליצור מתחמי התארכות מלאכותיים המכילים סוג פראי או מוטציה פול II מוכן באמצעות שיטת טיהור פשוט, צעד אחד. שני הנתיבים האחרונים באיור מראים שבוצעה באמצעות צורה של מוטציה של האדם פול II כי חסר CTD ב Rpb1 subunit שלה, אשר אינו נדרש עבור פול השני פעילות קטליטי, אבל עוזר שעתוק כמה לסגירה RNA. Ctd-פחות פול השני בשימוש אלה בחני היה מטוהר על ידי אנטי-הדגל אימונוטיהור מתוך קו התא האנושי מבטאת את הדגל אפירופה גרסה מתויג של Rpb1. חשוב לציין כי הריכוז של פול השני הפעיל ישתנה מהכנה להכנה. לפיכך, חיוני לבצע ניסויים ראשוניים שבהם כמות פול II המשמשת בתגובות מגוונת כדי לקבוע את הסכום הדרוש כדי להשיג את הפעילות הרצויה.
איור 4 מציג דוגמה מייצגת של שיטת השוואת הסיראות של התעתיקים הקשורים למערכות התארכות מלאכותיות המכילות את פול השני באמצעות ctd או בלתי מנוכה. עבור אלה מספר, מתחמי התארכות המכיל 23 התעתיקים נוקלאוטיד עם 5 '-triphosphate סוף הוכנו כמתואר בפרוטוקול 2.
דגירה של מתחמי התארכות עם אנזים הסגירה מוביל לשינוי ניידות של סביב 1 nt, המציין את התוספת של 5 ' כובע14, 15. כדי לכמת תגובות הסגירה, אחד קובע את היעילות הסגירה, מבוטא באחוזים של RNA כי הוא הכתיר. יעילות הסגירה היא היחס של רנ א הכתיר ל-RNA סה כ, מחולק על ידי הסגירה המקסימלי השגה. בתוך שלנו אומר שאנחנו מוצאים את הסגירה המקסימלית להשגה של RNA oligos שהתקבלו ממקורות מסחריים הוא ~ 85%, סביר להניח בשל טריזלציה לא מלאה של RNA סינתטי.
בתגובות המוצגות בשלושת הנתיבים הראשונים, מכלולי התארכות היו מודללים עם מקדם התמלול הכללי TFIIH ואת שיתוף הפקטור ATP כדי לאחר לאחר הסגירה של פול השני CTD. בתגובות אלה, ליד הסגירה המקסימלית נצפתה ~ 1 דקות לאחר התוספת של 5 מנג של אנזים סגירה. כאשר בחני בוצעו באמצעות מתחמי התארכות כי הם לא מודבטים עם tfiih ולכן מכילים פול השני לא זרחתי, זה לקח כמעט פי 10 כמו אנזים הסגירה הרבה להתבונן רמות דומות של הסגירה. שני הנתיבים האחרונים של איור 4 להראות את המוצרים של תגובות בהם מתחמי התארכות היו מודבטים עם או בלי האנזים הסגירה, בנוכחות של TFIIH. והכי חשוב, התלות TFIIH של שיתוף שכונתיות מתחמי התארכות מלאכותית הפגינו בדמות זו דומה מאוד לזה שנצפה במערכות התארכות שיזמו שעתוק ביוזמת מיזם במערכת אנזימים מורכבים יותר 5. המשך
איור 1: הרכבת של מכלולי התארכות מלאכותיים. (א) rna אוליגו (כהה כחול) של 20 nt הוא מספח לתבנית ה-DNA סטרנד (ירוק) באמצעות רצף משלים של 9 nt. (ב) rna פולימראז ii (Pol ii) מעורב עם ה-DNA המגולף: rna היברידית למקם את ה-rna 3 '-end באתר הקטליטי של פול II. (ג) עודף משן טוחנת של 3 "biotinylated ללא תבנית ה-DNA oligo (כחול בהיר) מתווסף לערבב את התגובה כדי להקיף ולייצב עוד יותר את מתחם התארכות. (ד) קיבוע מתחמי התארכות שוטפים כדי להסיר oligos עודפים ו-דגירה עם שילובים המתאימים של נוקלאוטידים כדי לאפשר פול השני כדי להאריך את ה-RNA oligos לאורך הרצוי. החלק החדש מסונתז של ה-RNA מוצג בצהוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פול השני הליכה באמצעות RNA oligos באורכים שונים. (א) דיאגרמת מכלולי התארכות מלאכותיים, המציגה נוקלאוטידים שנוספו במהלך ההליכות. שאינם תבנית של סטרנד ו-DNA התבנית מוצגים בצבע כחול וירוק בהיר, בהתאמה. The 20 nt RNA oligo מוצג בכחול כהה. מוצגים גם נוקלאוטידים הוסיף במהלך הליכות רצופות כדי ליצור ה-RNA 23mer (כתום), 25mer RNA (חום), ו-29mer ה-RNA (מגנטה). (ב) הצגת אלקטרופורזה ג'ל מראה rnas של אורך מוגדר שהושג לאחר הליכה פול II באמצעות 20 nt RNA פריימר, כפי שמתואר בפרוטוקול 1. נוקלאוטידים הוסיף במהלך כל צעד הליכה רציפה של הפרוטוקול הם צבע כתום מקודד (23mer), חום (25mer), ו מגנטה (29mer). (ג) פול השני הליכה החל ב -29 nt RNA פריימר, אבל אחרת בדיוק כפי שמוצג ב b. (b ו-C) להראות חלקים של אותו ג'ל אבל הופרדו למטרות המחשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: התעתיקים מסונתז על ידי מתחמי התארכות מלאכותיות המכילים סוג פראי או מוטציה פול II. מתחמי התארכות מלאכותית התאספו באמצעות 20 nt RNA פריימר ומטוהרים מאוד אנדודוגני השני מן הכבד חולדה או שמרים ביקוע או הדגל החיסונית פול השני חסר Rpb1 מתאי הלה (F: Rpb1-ΔCTD). רנ א בכל קומפלקס הורחב יותר ל -23 nt או 25 nt. עיין בטקסט לקבלת פרטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זירחון-הפעלה תלויה בסגירה של RNA שכונתיות. מתחמי התארכות מלאכותיים המכילים כבד חולדה פול II ו-RNA 23mer לאחר מכן היו מודבטים עם ATP ואת הגורם הכללי שעתוק TFIIH או מאגר עבור 10 דקות כדי לזסוף את ה-CTD פול השני. לאחר כביסה, מכלולי התארכות הותוו ב-5 ng, 15 ng, או 45 ng של אנזים הגבלת מיונקים במשך 1, 2 או 4 דקות. הכתיר ובלתי מותוות 23ממרס נפתרו ג'ל הרפתקאות (למעלה, 12 הנתיבים הראשונים) ו-RNA הכתיר% היה כמת ו מותווים (למטה). חלק זה של הדמות פורסם במקור ב-ref 5, שפורסם כמאמר גישה פתוחה תחת רישיון CC-by. שני הנתיבים האחרונים, אשר מגיעים מניסוי נפרד, ממחישים מוצרים של תגובות שבהן מתחמי התארכות היו מודבטים עם או בלי אנזים סגירה, בנוכחות TFIIH. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| רצף | ערות | |
| RNA_20mer | אקוקוקוקוליה | 5 ' שינוי טריפוספט; מ&-מדפים מטוהרים |
| RNA_29mer | אקואוגאקוקוקוקולקוטואה | 5 ' שינוי טריפוספט; מ&-מדפים מטוהרים |
| תבנית של דנ א סטרנד | CTACGGTTAAGCTCACGGTACATTTCTGAA ליאת הכהן |
עמוד כפול & כיצד לטיהור |
| די. אנ. איי סטרנד לא מתבנית | ATCAGAAATGTACCGTGAGCTTAACCGTAG | 5 ' טרוג-ביוטיליס; כלי מטהר |
שולחן 1: דנ א והרנ א
| ריכוז סופי | אמצעי אחסון | |
| טריס HCl pH 7.5 | 12 מ"מ * | |
| 50 מ"מ מג2 | 5 ממ ' | 1 ליטר |
| 300 ממ י | 50 ממ ' | 1.67 מיקרומטר |
| 10 μM תבנית ה-DNA סטרנד הoligo ב 100 mM טריס-HCl pH 7.5 | 1 μM | 1 ליטר |
| 10 μM ה-RNA אוליגו בשנת 10 mM טריס-HCl pH 7.5 |
2 מיקרומטר | 2 מיקרומטר |
| מים | 4.33 מיקרומטר | |
| 10 מיקרומטר | ||
| * כל טריס-HCl מגיע DNA ו-RNA פתרונות oligo | ||
שולחן 2: קוקטייל לריפוי DNA ו-RNA אוליגוס
| מאגר פול השני | ריכוז סופי | נפח/תגובה |
| מים | 4.52 מיקרומטר | |
| 50 מ"מ מג2 | ^ 4.67 מ"מ | 1.40 מיקרומטר |
| 250 mM Tris הHCl, pH 7.5 | ^ 23 מ"מ | 1.40 מיקרומטר |
| 300 ממ י | * 27 מ"מ | 1.33 מיקרומטר |
| 50% גליצרול | 3 | 0.9 מיקרומטר |
| 20 מ"ג/ml BSA | 0.5 מ"ג/ml | 0.38 מיקרומטר |
| 100 מ"מ-DTT | 0.5 ממ ' | 0.08 מיקרומטר |
| 10% PVA | 2 | 3 מיקרומטר |
| שלוש עשרה μi | ||
| בדיוק לפני השימוש בהוספה למאגר: | ||
| ד. נ. א. התבנית מספח: RNA (מתוך לוח 1) | 1 ליטר | |
| רנ א פולימראז השני | 1 ליטר | |
| * הסופי KCl ריכוז בתמהיל הוא ~ 50 mM, עם KCl נוספים מגיע פול השני | ||
| ^ הסופי MgCl2 ו הריכוזים של הHCl של Tris הם 5 מ"מ ו -25 מ"מ בהתאמה, | ||
| התוספת MgCl2 ו-טריס HCl מגיעות מהדנ א הנ: מוצר RNA. | ||
שולחן 3: פול השני מערבב
| מאגר DNA שאינו תבנית | ריכוז סופי | נפח/תגובה |
| מים | 4.48 מיקרומטר | |
| 300 ממ י | * 43.33 מ"מ | 2.17 מיקרומטר |
| 50 מ"מ מג2 | 5 ממ ' | 1.50 מיקרומטר |
| 250 mM Tris הHCl, pH 7.5 | 25 ממ ' | 1.50 מיקרומטר |
| 50% גליצרול | 3 | 0.9 מיקרומטר |
| 20 מ"ג/mL BSA | 0.5 מ"ג/ml | 0.38 מיקרומטר |
| 100 מ"מ-DTT | 0.5 ממ ' | 0.08 מיקרומטר |
| 10% PVA | 2 | 3 מיקרומטר |
| 14 μL | ||
| בדיוק לפני השימוש בהוספה למאגר: | ||
| 5 דנ א ביולוגי בתבנית ביולוגית | 1 ליטר | |
| * הסופי KCl ריכוז בתמהיל הוא 50 mM, עם KCl נוספים מגיע מאגר ה-DNA oligo ללא תבנית. | ||
שולחן 4: שילוב DNA ללא תבנית
| מאגר תיוג דופק | ריכוז סופי | נפח/תגובה |
| מים | 9.98 מיקרומטר | |
| 300 ממ י | 60 ממ ' | 5 מיקרומטר |
| 50% גליצרול | 3 | 1.5 מיקרומטר |
| 20 מ"ג/mL BSA | 0.5 מ"ג/ml | 0.63 מיקרומטר |
| 500 מ"מ מג2 | 8 ממ ' | 0.4 מיקרומטר |
| 1 הHCl של טריס M, pH 7.9 | * 12 מ"מ | 0.3 מיקרומטר |
| 100 מ"מ-DTT | 0.5 ממ ' | 0.13 מיקרומטר |
| 1 M הפסי-NaOH, pH 7.9 | 3 ממ ' | 0.08 מיקרומטר |
| 10% PVA | 2 | 5 מיקרומטר |
| 23 μL | ||
| בדיוק לפני השימוש בהוספה למאגר: | ||
| 15 מע מיקרומטר | 0.6 μM | 1 ליטר |
| 3.3 μM [α-32P] utp | 0.13 μM | 1 ליטר |
| * הסופי הריכוז Tris HCl הוא 20mM, עם HCl נוסף של טריס מגיע מאגר נוקלאוטיד. | ||
שולחן 5: הדופק מיקס שילוב NTP
| מאגר צ'ייס | ריכוז סופי | נפח/תגובה |
| טריס HCl, pH 7.5 | * 30 מ"מ | |
| 300 ממ י | 60 ממ ' | 1 ליטר |
| מים | 0.6 מיקרומטר | |
| 50% גליצרול | 3 | 0.3 מיקרומטר |
| 10 מ"מ-DTT | 0.5 ממ ' | 0.25 מיקרומטר |
| 100 מ"מ הפסי-NaOH, pH 7.9 | 3 ממ ' | 0.15 מיקרומטר |
| 20 מ"ג/mL BSA | 0.5 מ"ג/ml | 0.13 מיקרומטר |
| 500 מ"מ מג2 | 8 ממ ' | 0.08 מיקרומטר |
| 10% PVA | 2 | 1 ליטר |
| 3.5 מיקרומטר | ||
| בדיוק לפני השימוש בהוספה למאגר: | ||
| 100 μM UTP, 100 μM ATP מדולל ב100 mM טריס-HCl, pH 7.5 | 5 μM | 1.5 מיקרומטר |
| * כל הHCl Tris מגיע מאגר נוקלאוטיד |
שולחן 6: מרדף מיקס NTP
| ריכוז סופי | נפח/תגובה | |
| מים | 24.21 מיקרומטר | |
| 1 מדיום | 60 ממ ' | 1.8 מיקרומטר |
| 50% גליצרול | 3 | 1.8 מיקרומטר |
| 20 מ"ג/ml BSA | 0.5 מ"ג/mL | 0.75 מיקרומטר |
| 1 הHCl של טריס M, pH 7.9 | 20 ממ ' | 0.6 מיקרומטר |
| 10% PVA | 0.2% | 0.6 מיקרומטר |
| 100 מ"מ-DTT | 0.5 ממ ' | 0.15 מיקרומטר |
| 1 M הפסי-NaOH, pH 7.9 | 3 ממ ' | 0.09 מיקרומטר |
| 30 μl |
טבלה 7: מאגר לכביסה
| ריכוז סופי | נפח/תגובה | |
| מים | 14.13 מיקרומטר | |
| 300 ממ י | 60 ממ ' | 6 מיקרומטר |
| 50% גליצרול | 3 | 1.8 מיקרומטר |
| 20 מ"ג/ml BSA | 0.5 מ"ג/ml | 0.75 מיקרומטר |
| 1 הHCl של טריס M, pH 7.9 | 20 ממ ' | 0.6 מיקרומטר |
| 500 מ"מ מג2 | 8 ממ ' | 0.48 מיקרומטר |
| 100 מ"מ-DTT | 0.5 ממ ' | 0.15 מיקרומטר |
| 1 M הפסי-NaOH, pH 7.9 | 3 ממ ' | 0.09 מיקרומטר |
| 10% PVA | 2 | 6 מיקרומטר |
| 30 μL |
שולחן 8: מאגר תמלול בסיס (BTB)
| עצור מאגר | ריכוז סופי | נפח/תגובה |
| מים | 55.74 מיקרומטר | |
| 1 הHCl של טריס M, pH 7.5 | 10 ממ ' | 0.6 מיקרומטר |
| 5 ליטר | 300 ממ י | 3.6 מיקרומטר |
| 500 מ"מ | 0.5 מ"מ | 0.06 מיקרומטר |
| 10% SDS | 0.2% SDS | 1.2 מיקרומטר |
| 60 מיקרומטר | ||
| בדיוק לפני השימוש בהוספה למאגר: | ||
| 15 מ"ג/מ"ל גליקוגן | 2 מיקרומטר | |
| 20 מ"ג/mL פרוטאינאז K | 2 מיקרומטר | |
| מים | 30 μL | |
שולחן 9: מיקס להפסיק
| ריכוז סופי | נפח/תגובה | |
| מים | 11.9 מיקרומטר | |
| 300 ממ י | * 53.33 מ"מ | 5.33 מיקרומטר |
| 50% גליצרול | 3 | 1.8 מיקרומטר |
| 1.5 μM GTP מדולל ב 100 mM טריס HCl, pH 7.5 | 50 μM | 1 ליטר |
| 100 יחידות/mL אי-אורגניים פירופוספטאז, שמרים | 0.1 יחידות/תגובה | 1 ליטר |
| 20 מ"ג/ml BSA | 0.5 מ"ג/ml | 0.75 מיקרומטר |
| 1 הHCl של טריס M, pH 7.9 | ^ 16.67 מ"מ | 0.5 מיקרומטר |
| 500 מ"מ מג2 | 8 ממ ' | 0.48 מיקרומטר |
| 100 מ"מ-DTT | 0.5 ממ ' | 0.15 מיקרומטר |
| 1 M הפסי-NaOH, pH 7.9 | 3 ממ ' | 0.09 מיקרומטר |
| 10% PVA | 2 | 6 מיקרומטר |
| 29 μL | ||
| בדיוק לפני השימוש בהוספה למאגר: | ||
| סגירה של אנזים | 1 ליטר | |
| * הסופי KCl הריכוז בתמהיל הוא ~ 60 mM, עם KCl נוספים באים מהאנזים הסגירה ו פירופוספטאז | ||
| ^ הסופי הריכוז של הHCl הוא 20 מ"מ, עם HCl נוסף של Tris מגיע ממאגר נוקלאוטיד | ||
שולחן 10: שילוב הסגירה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים שמבקשים לבתר את האירועים ביחד למכלול התארכות פול השני כגון עיבוד רנ א ורגולציה של ההתארכות עצמה ניתן להקל מאוד על ידי שימוש במערכת אנזימים מאוד מטוהרים. הגדרת מערכות אנזימים כאלה יכולה להיות מאתגרת. התעתיק התלוי של היזם על ידי פול השני דורש לפחות חמישה גורמי שעתוק כלליים. הכנת הגורמים הללו והאגירה יכולה להימשך חודשים; מכאן, שלב הגבלת קצב בתהליך זה הוא לעתים קרובות פשוט הכנת קאדר של הגורמים התמלול הדרושים כדי להוות שעתוק בסיס במבחנה הבדיקה.
במאמר זה, אנו מתארים עיבוד של שיטות שפותחו בעבר ליצירת שעתוק מלאכותי מכלולי התארכות2,3 באמצעות פול מטוהרים רק השני, DNA סינתטי ו-RNA olig, מחלת הגאות. מתחמי התארכות כתוצאה מכך פעילים ומתאימים לשימוש בחקירת צימוד התעתיק של פול השני והסגירה של RNA5. חשוב לציין כי שעתוק ו-RNA הסגירה מתרחשים בvivo בהקשר של כרומטין וחלבונים רבים אחרים לא נוכח במערכת האנזים המוגדר הזה; מכאן, מערכת זו צפויה ללכוד מראש רבים, אך לא כל, תכונות של תגובות המתרחשות vivo. הפרוטוקול שאנו מתארים בונה על שיטות קודמות על ידי שינוי מכלולי התארכות מלאכותית באמצעות DNA biotinylated מאוגד חרוזים מגנטיים, המאפשר לחוקר בקלות לשנות את תנאי התגובה ו/או להסיר נוקלאוטידים ללא שולבו בשלבים שונים של הספר. חשוב מכך, משום שהתג המשמש לשתק מכלולי התארכות נמצא בקצה אחד של הגדיל שאינו תבנית של DNA ולא על פול השני עצמו או על סטרנד תבנית, רק אלה פול IIs הקשורים עם מתחמי התארכות מלאה יישמרו על חרוזים.
בגלל התעתיקים המתהווה חייב להיות מסוף 5 '-triphosphate כדי להיות שונה על ידי האנזים הסגירה, RNA סינתטי olig, משמש עבור ניסויים הסגירה נרכשים עם 5 '-triphosphate termini. עם זאת, ה-RNA oligos לא שונה ניתן להשתמש עבור יישומים אחרים, כולל מחקרים של אחרים שיתוף פעולה בעיבוד RNA אירועים או הפעילויות של שעתוק גורמים לווסת התארכות פול השני. ללא קשר ליישום הזרם, מומלץ להרכיב מתחמי התארכות עם דנ א מטוהר מאוד ו-RNA oligos. בפרט, יש לטהר את ה-DNA הביוטילי ביולוגי באמצעות הבדיקות, ולטהר את ה-DNA ו-RNA האחרים באמצעות אלקטרופורזה ב ג'ל פוליאקרילאמיד ו/או בדיקות. עם זאת, הטוהר של פעילויות אנזימטיות יהיה חייב להיקבע על בסיס מקרה אחר-מקרה ויהיה תלוי בהיקף של כל ניסוי.
הוספת ה-DNA ביולוגי שאינו תבנית, oligo בשלב האחרון של ההרכבה צריך להיות, בעיקרון, מספיק כדי לקבל תסביך טרנארי. עם זאת, אנו תמיד כוללים לפחות אחד "הליכה" צעד כדי לאשר פול II משלבת את המספר הנכון של נוקלאוטידים: אם המטרה של הניסוי היא ליצור מצעים עבור לומר החוצה שכונתיות הסגירה או שלבים אחרים עיבוד RNA או כדי לעקוב אחר פול השני התארכות, אנו תמיד כוללים 32P מתויג ribonucleotide הראשון "הליכה" כך התמליל יכול להיות מדמיין ולהשתמש ללא תווית "קר" נוקלאוטידים עבור צעדים הליכה הבאים כך הפעילות הספציפית של התעתיקים של באורכים שונים נשאר קבוע. למרות השיטה המתוארת בפרוטוקול זה משתמשת 32P-התווית נוקלאוטידים כדי להמחיש את התעתיקים המתהווה, המבוסס על קרינה פלואורסצנטית ניתן להשתמש כדי למדוד תיוג RNA כאשר לא ניתן לעבוד עם חומרים רדיואקטיביים. עם זאת, חשוב לציין כי הרגישות של מאמר כזה היא בדרך כלל הרבה פחות מאלה המשתמשים בתוויות רדיואקטיביות, והם בדרך כלל דורשים כמויות גדולות יותר של אנזימים.
צעד מפתח לניסויים לשחזור הוא טוב התאוששות RNA במהלך פנול: כלורופורם: החילוץ isoamyl ומשקעים אתנול. מצאנו כי באמצעות צינורות מיקרוצנטריפוגה המכילים ג'לים בצפיפות גבוהה (ראה טבלת חומרים) עבור פנול: כלורופורם: החילוץ isoamyl מגביר את היכולת והתשואה של חומצת הגרעין משלב זה. בנוסף, השימוש הגליקוגן בצבע ( לראות את הטבלה של חומרים) כמו המוביל במהלך משקעים אתנול עושה את זה קל יותר לראות כדורי חומצות גרעין קטן, מה שהופך אותו פחות סביר כי אחד מאבד בשוגג את הגלולה על ידי מנושב אותו במהלך הסרת ה . האתנול האנונטי
מתחמי התארכות מלאכותיים שנוצרו באמצעות פרוטוקולים דומים לאלה שאנו מתארים צריכים גם להיות שימושיים למדידת האינטראקציות של חלבון חלבון או חלבון-גרעין בין מורכבות התארכות פול II וגורמים המווסתים תעתיק התארכות או אירועי עיבוד RNA המקושרים להתארכות. במקרה זה, חלבונים שנותרו מאוגדים למערכות התארכות מלאכותיות לאחר שטיפת הכביסה מזוהה על ידי הכתמים המערביים או הספקטרומטר ההמוני; רנ א-RNA אינו הכרחי ואנו עושים את כל שלבי התמלול עם נוקלאוטידים בלבד "קר".
לבסוף, שיטה זו יכולה להיות שימוש עבור ניתוחים מבניים של מכלולי תמלול. ואכן, שיטות קשורות שימשו בלימודי ההקפאה עם אנזימים שמרים וממוניים כדי ליצור מחדש את הקשר בין האינטראקציות אנזים פול II13, ואינטראקציות של פול II עם חלבונים או מכלולי חלבון אחרים במהלך התארכות12, משהה16,17, ולאחרונה, מחויב נוקלאוטיחלק18. סיבוך אפשרי עבור ניתוחים מבניים של שעתוק מתחמי שנוצר באמצעות שיטה זו היא הצורך להסיר את ביוטין/חרוזים מגנטיים מהמתחם; עם זאת, זה יכול להיפתר על ידי כלילת DNA oligos אתרים ספציפיים המוכרים על ידי אנזימים הגבלה או באמצעות ביוטין לינוטים כי הם ביקלו ביטול לאחר טיפול קרני UV19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לס' שומאן על אספקת האנזים להגבלת היונקים. עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מענק למכון הסטורים למחקר רפואי מקרן הלן נלסון לחקר הרפואה בקרן הקהילה רבתי בקנזס סיטי. ניתן לגשת לנתונים המקוריים שבבסיס כתב יד זה ממאגר הנתונים המקורי של סטורס ב-http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D.
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
