Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מחקר רעילות של תחמוצת אבץ חלקיקים בתרבות התא ו- Drosophila ילה מלאנוסטר

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59510
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

Summary

אנו מתארים פרוטוקול מפורט להערכת פרופילי הרעילות של חלקיקי תחמוצת אבץ (ZnO NPs) בפרט, סוג של מוות התאים בMRC5 ריאות האדם היווצרות ו רוס המבנה של הפרי זבוב Drosophila ילה.

Abstract

תחמוצת אבץ חלקיקי (ZnO NPs) יש מגוון רחב של יישומים, אבל מספר דוחות על רעילות ZnO NP-הקשורים גדל במהירות בשנים האחרונות. עם זאת, מחקרים שבהסבר המנגנון הבסיסי לרעילות ZnO NP המושרה הם scanty. קבענו את פרופילי הרעילות של ZnO NPs באמצעות שניהם בתוך מבחנה במודלים ניסיוני vivo. ירידה משמעותית בכדאיות התאים נצפתה ב-ZnO NP-חשופים MRC5 ריאות פיברותקיעות, מראה כי אין NPs להפעיל אפקטים ציטוטוקסיים. באופן דומה, מעניין, המעיים חשופים ל-ZnO NPs הציגו עלייה דרמטית ברמות מינים של חמצן תגובתי (ROS) בזבוב הפירות דרוזוהילה. מחקרים מעמיקים יותר נדרשים כדי ליצור הערכת סיכונים עבור השימוש המוגבר של NPs ZnO על ידי הצרכנים.

Introduction

ננוטכנולוגיה מתייחסת ליישום של חומרים ננו הנמצאים בשימוש בכל התחומים המדעיים, כולל רפואה, מדעי החומרים, וביוכימיה. לדוגמה, החומרים הידועים לפיזור האולטרה סגול, החישה הכימית ותכונות האנטי-מיקרוביאלית, כמו גם מוליכות חשמלית גבוהה, מנוצלים בייצור מוצרי צריכה שונים כגון אריזות מזון, קוסמטיקה, טקסטיל, גומי, סוללות, זרז לטיפול בגז זנב מכוניות, ויישומים הקשורים בביו-רפואית1,2,3.

עם זאת, היישומים המתפתחת של מוצרים מבוססי ZnO NP, המוביל חשיפה אנושית מוגברת ל-ZnO NPs, העלו חששות על תופעות לוואי פוטנציאליות שלהם על בריאות האדם. מספר מחקרים סלולריים מחוץ לתחום הוכיחו כי הNPs zno יכול לגרום ללחץ חמצוני, מכשירים אוטומטיים הקשורים ציטורעילות, דלקת, ו-גנוגיה4,5,6,7,8 . בעיקר, רעילות של הארגון zno היא נגרמת על ידי פירוק של zno כדי לשחרר zno2 + יונים, כמו גם את הפעילות מחדש של zno, וכתוצאה מכך יוני הסלולר וחוסר איזון מטבולי המקושרים עם לקויי הומאוסטזיס היוניים ו עיכוב של הובלת יונים4,7,9,10. חשוב מאוד, מחקרים הראו כי הדור של מיני חמצן תגובתי (ROS) הוא אחד המנגנונים העיקריים המשמשים הרעילות ZnO הקשורים NPs. מספיק נגד חמצון פעילות לאחר העלבון ROS הוכח להיות אחראי על הגורם הרעילות הציטוזה נזק DNA9. ההשפעות הרעילות של הNPs של זאין יש גם דווחו בדגמי בעלי חיים, כולל מכרסם1, zbrafish11,12, כמו גם את חסרי חוליות drosophila ילה13.

Drosophila ילה משמש מודל מבוסס בעלי חיים חלופיים עבור הקרנת רעילות של ישויות כימיות וננו (nms)14,15. וחשוב מכך, ישנן רמות גבוהות של דמיון גנטי ופיזיולוגי בין בני אדם לדרוסופילה המצדיק את השימוש בדרוסופילה כמודל vivo להערכת תגובות ביולוגיות למזהמים סביבתיים כגון nms 16. יתר על כן, ישנם יתרונות רבים של שימוש Drosophila ילה בשל גודלו הקטן, תוחלת חיים קצרה, האיומים הגנטיים, ותחזוקה קלה וחסכונית. יתר על כן, Drosophila ילה אומצה באופן נרחב לחקר הגנטיקה, מולקולרית והתפתחותית ביולוגיה, מאז הגנום המלא שלה היה מלא רצף לפני שנים בחזרה 2000, ולכן הופך אותו מתאים עבור מגוון של הקרנת תפוקה גבוהה ולהתמודדות עם שאלות ביולוגיות לא פתורות17,18,19,20,21. בשנים האחרונות, מספר מחקרים הקשורים לאימונוטוקסיקולוגיה באמצעות סוגים שונים של NPs בדרוזוהילה דווחו15,22,23,24. הידע הבסיסי הזה שהתקבל ממחקרים שנעשו באמצעות דרוזופילה עזר לספק תובנות נוספות להבנת הננו-טוקסיקולוגיה.

ROS הוא העבריין הידוע עבור הרעלת ציטוזה ורעילות הנגרמת על ידי NPs, בפרט, בסיס מתכת מבוסס NPs25. רוס הם מינים כימיים המכילים חמצן עם תכונות תגובתי גבוהה יותר מאשר חמצן מולקולרי. רדיקלים חופשיים כגון סופראוקסיד רדיקלים (O2-) ואפילו, מולקולות שאינן קיצוניות כגון מי חמצן (H2o2) יכול לשמש ROS. תחת המצב הפיזיולוגי הרגיל, הם נדרשים לשמור על הומאוסטזיס הסלולר26, עם זאת, מוגזם ROS בשל הפקת יתר או דיסרגולציה של מערכת ההגנה נוגד חמצון יכול לגרום ללחץ חמצוני, המוביל נזק לחלבונים, שומנים וחומצה deאוקסיריוונקלאית (DNA)27. למשל, כמו העלייה ברמות של רוס ו גלוטתיון (gsh) הרמה פוחתת במקביל, שיבוש אדנוזין טריפוספט (ATP) סינתזה מתרחש ו לקטט דהידרוגנאז (ldh) רמת מגדילה בינונית, ששיאה במוות התאים27.

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע ניתוחים סלולריים וגנטיים תוך שימוש בתאי יונקים מתורבתים ודרוזוהילה כדי לקבוע את ההשפעות השליליות הפוטנציאליות של אי-הצורך בNPs. מבט כולל על השיטה המשמשת לחקר רעילות של ZnO NPs מוצג באיור 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מיון תאים פלואורסצנטית מופעל (FACS) ניתוח על תאים חיים/קבועים

  1. Sonicate ZnO NPs בהשעיה עבור 15 דקות.
  2. הכנת NPs בריכוזים שונים (g, 0, 10, 25, 50,100 ו 200 μg/mL) באמצעות 1 מ"ג/mL ZnO NP מניות פתרון לטיפול בתאים מתורבתים.
  3. זרעים MRC5 בריאות האדם (1 x 105 תאים/גם) על צלחת 6-היטב התרבות ביום מראש, ולאחר מכן לטפל בתאים עם 2 מ ל של הבית Zno NPs (בטריליטים) עבור 8 h, 16 h, ו 24 h.
  4. בכל רגע, לאסוף את התאים על ידי תפרידו ב 300 x g עבור 5 דקות.
  5. רוחצים את כדורי התא פעמיים עם תמיסת מלח באגירה מפוספרת (PBS).
  6. השהה מחדש את התאים באמצעות מאגר איגוד של 1x, המורכב מ-0.1 M הידרוקסיד/נתרן הידרוקסידי (NaOH), 1.4 M נתרן כלוריד (הנאגל), ו -25 מ"מ סידן כלוריד (CaCl2), בריכוז של 1 x 105 תאים לכל 100 μl.
  7. הוסף 5 μL של פלואורואסעין isothiocyanate (FITC) הכתם V ו 5 μL של propidium יודיד (PI) כתם דנ א, ו מספחת את התאים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT; 25 ° c) בחושך.
  8. למעלה את הדגימות עם 400 μL נוספים של מאגר איגוד של 1x לפני מיון התאים על ידי הזרמת cy, try. מינימום של 10,000 תאים מנותח עבור כל דוגמה.
  9. בסדר את תרשים העמודות באמצעות העוצמה החציוני שהושגה.

2. חשיפת NPs לדרוזוהילה

  1. להוסיף 1 מ ל חלקיקי חלקיקים בריכוזים שונים לתוך מבחנות, ואחריו 9 מ ל של מזון לעוף כדי להפוך את הריכוז הסופי של 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL או 0.5 mg/mL ZnO NPs.
  2. מערבבים חלקיקים עם מזון ביסודיות בבקבוקונים באמצעות הפיפטה.
  3. אפשר לעוף מזון המכיל את ה-ZnO NPs להתקרר לפחות 2-3 h לפני השימוש.
  4. הציגו בתוכם גברים ונשים זבובים לתוך הבקבוקונים במשך 5 ימים, והרשו להם להזדווג ולהטיל ביצים (המופיעות ככתמים לבנים) על פני האוכל.
  5. להסיר את הזבובים הורים, ולאפשר לביצים לעבור פיתוח נוסף, אשר מורכב 4 שלבים התפתחותיים שונים (עובריים, זחל, גולמי ובוגרים הבמה).

3. חיתוך זבוב

  1. לאסוף מאוחר 3 הזחליםסינטסיומאיה מהקיר של הבקבוקונים לניתוח. ביצים טריות שהונחו בדרך כלל להתפתח לסוף 3 הזחלים סינטסיומאיה לאחר 72-120 h ב RT.
  2. נקו את צלחת החיתוך ומלאו את הבאר עם חיתוך בינוני/PBS.
  3. לנתח את הזחלים (בסוף 3שרואד instar) תחת stereomicroscope, באמצעות זוג מלקחיים.
  4. השתמש קצה של מלקחיים לעשות חור קטן לשבור לפתוח את שכבת הקוטיקולה של הזחלים. בזהירות למשוך את המעיים ולמקם אותו לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL המכילה את מדיום הדרוסופילה של שניידר, לפני השלב התיקון באמצעות 1 מ ל 4% פאראפורמלדהיד (PF).
  5. 3.5 לתקן את המעיים ב-PF עבור 10 דקות ב-RT, עבור ניסויים עוקבים, כגון כתמים חיסוני.

4. האיתור של רוס באמצעות דהידרואתידיום (היא) צביעת

  1. התייחסו לזחלים בריכוזים שונים של הזנו NPs כמתואר בשלב 2.1.
  2. לאחר הניתוח של המעיים מ 3 הזחליםסינטסיומאיה כמתואר לפי סעיף 3, דגירה את המעיים של שניידר בינוני הדרוזולה ב-RT לפני ביצוע מכתים רקמות. התמוססות 1 μL של הצבע שלה (מתוך ריכוז המניה של 30 מ"מ) ב 1 מ ל של המדיום של שניידר, ביצוע ריכוז העבודה הסופי של 10-30 μM לצבוע.
  3. מודמת את הבטן למשך 5 דקות ב-RT בחושך, ולאחר מכן רוחצים שלוש פעמים באמצעות המדיום של שניידר עבור כל 5 דקות.
  4. לתקן את הבטן עם 4% PF (צעד אופציונלי) ו הר את הבטן על שקופיות זכוכית, עם מדיום הרכבה אנטי לדעוך המכיל 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI). לכידת תמונות תחת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.

5. מדידת קרינה פלואורסצנטית באמצעות ImageJ תוכנה

  1. יבא את תמונות הזריחה שנתפסו שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית או מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית לתוך תוכנת imagej.
  2. לחצו על התפריט ' ניתוח ' ובחרו ' קביעת מדידות'.
  3. בחר באמצעי הפלט כגון עוצמה משולבת בשטח וערך אפור ממוצע.
  4. לחץ על מדידה.
  5. בחר אזור ללא זריחה כדי להגדיר את הרקע.
  6. יצא את הנתונים לתוך הגיליון האלקטרוני של Excel וקבע את הזריחה הכוללת של התא הכולל (CTCF), באמצעות החישוב כמוצג להלן.
    CTCF = צפיפות משולבת-(שטח של תא נבחר X ממוצע הזריחה של קריאות רקע)
  7. בנה תרשים עמודות ובצע ניתוח סטטיסטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התאים שנחשפו NP עובדו עם ערכת הצביעת תא מגיב, ואחריו מיון התא באמצעות הזרמת cy, לנסות. ZnO NP-מטופלים תאים (למטה, הלוח הימני) התערוכה אחוז גבוה יותר של מוקדם (R3)/תאים מאוחר האפוטוטיים (R6) מאשר בתאי שליטה (R5, התחתון, פאנל שמאל). נמק מוות של תאים מסומן על ידי אר 4 (למעלה, הלוח הימני) (איור 2). התוצאות של שיטת ה-FITC/אנשין החמישי בטיפול בחומרים מטופלים מטעם מטופל מיוצג באיור 2.

עבור ניסויים Drosophila ילה , Sonicated Zno NPs בריכוזים שונים נוספו להטיס מזון 10 מ"ל צינורות ולאחר מכן מעורב היטב באמצעות בקר פיפטה (איור 3). מאוחר יותר הזחלים השלישי שנאספו מבקבוקונים נעשו תחת stereomicroscope. הזחלים נשטפו לראשונה כדי להסיר שרידי מזון שנותר (איור 4). שכבת הקוטיקולה החיצונית נקרעה לגזרים. כדי לחשוף איברים פנימיים הבטן זוהתה על ידי המראה הארוך והשקוף למחצה (בעוד שאיברים אחרים מופיעים כאטומים ומוארים באור צהבהב מתחת למיקרוסקופ) (איור 5). הבטן הוסרה בזהירות, מבלי לשבור, והועברה לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה המכילה קבע על הקרח (איור 6).

עבור כימות העוצמה הפלואורסצנטית כגון עוצמת הבדיקה של ה-la בבטן, התמונות יוצאו בפורמטים JPEG או TIFF ונפתחו עם התוכנה ImageJ. החלק של המעיים לניתוח נבחר וזוהה, למשל, באמצע המעיים או באזור הבטן, והאינטנסיביות הפלואורסצנטית של אזור הריבית (ROI) נמדד. כדי להשוות בין העוצמות היחסיות של הקבוצות הנסיוניות השונות, העסקנו באותה שיטת מיקרוסקופ כמותית שתוארה בסעיף הקודם. להשוואת עוצמות הקרינה, הפרמטר הוגדר באמצעות הפקד השלילי שאינו מטופל. חישובי עוצמת האות על בסיס עוצמות כיול של שליטה לא מטופלת אפשרה השוואה ישירה בין קבוצות נסיוניות שונות. איור 7 מראה את העוצמה הממוצעת של האות מארה ב במעי הזחלהשלישי שנחשף לNPs בריכוזים שונים. המעיים של הזחלים שטופלו עם 0.5 mg/mL של הטיפול ZnO NP הראה את עוצמת הקרינה הגבוהה ביותר.

ההבדלים בעוצמות היחסיות בין כל הקבוצות הנסיוניות הוצעו בעבר, והניתוח הסטטיסטי בוצע ומספק גם תוצאות איכותיות וכמותיים (איור 8).

Figure 1
איור 1: מבט כולל על השיטה המשמשת לחקר רעילות של NPs. עבור עבודה מחוץ לגופית, התאים ZnO NP מטופלים היו מוכתמים לפני הזרימה cy, try ניתוח. עבור בעבודה vivo, המעיים היהגזור 3 הזחלים סינטסיומאיה, ואחריו כתמים עם הצבע הסופי ורכישת תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: העלילה נקודה של תאים מופרדים לתוך אוכלוסיות שונות המבוססות על FITC שלהם וכתמים PE. הציורים מראים את התוצאות של שיטת FITC/אנשין V עם 24 שעות טיפול של ZnO-NPs ב-MRC-5. לאחר מכן ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי של התאים בשלבים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הכנת מדיום מזון לטיסה של ZnO NP. (א) מרכיבים למזון לעוף נוספו למים, מותר להתנפח, והורתחו במשך 5 דקות. (ב) לאחר התקררות עד 50 ° c עם ערבוב, התווסף nipagin והיה מעורב ביסודיות. (ג) להכין תערובת הורים עבור חלקיקי חלקיקים (כולל נפח לא יעלה על 10% של נפח המזון הסופי). (ד) בינוני הוא לאחר מכן מצוטט, מעורב עם Zno NPs בריכוזים שונים ומותר להתקרר לחלוטין לפני האחסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: כל תהליך החיתוך של המעיים. (A) העברת הזחלים3rd הזחל לדיסק לנתיחה. (ב) השימוש מלקחיים להחזיק בעדינות זחל, ו (ג) לשטוף את שארית המזון באמצעות תמיסת מלח. (ד) קרע את הקוטיקולה לגזרים בלי לגעת בבטן ובאיברים פנימיים אחרים. (ה) מניחים את המעיים לתוך תמיסת המלח עבור ההליך העוקב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: האנטומיה של מערכת העיכול/בטן. המעיים הנשאבים מזחל הדרוסופילה מחולקים לשלושה תחומים נפרדים של מוצא התפתחותי שונה, כלומר המעי הקדמי, המעיים והבטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: כתמים של רקמת הבטן עם היא. (א) להכין מיקס מאסטר המכיל צמיחה בינונית ו-א (הריכוז הסופי של 30 μm). (ב) הוסף את המיקס הראשי לתוך הבאר של דיסק לנתיחה. (ג) להעביר את הרקמה לגזור את רקמת הבאר המכילה את התמהיל הראשי של ארה ב. (ד) מודטה at RT עבור 5 דקות ולהגן על הרקמה מאור; לשטוף את 3x ב PBS/תמיסת מלח עבור 5min. (E) לתקן ב 4% PF עבור 10 דקות; לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם PBS (אופציונלי). (ו) בעדינות להעביר את הבטן על שקופית זכוכית, שכב שטוח מבלי לקבל כל רקמה מקופל להר עם הרכבה בינונית לפני כיסוי עם זכוכית מכסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7

איור 7: אין NPs לגרום רוס בבטן הזחלים של דרוזוהילה. (א) היא כתם בבטן בקרת מראה את הרמה הבזליים של ROS. (b ו- c) תאי בטן מטופלים מראים עלייה הדרגתית בעוצמה הרבה באופן התלוי במינון.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: כימות של תמונות פלורסנט באמצעות ImageJ. (א) לייבא את התמונות שנלכדו. (ב) לחץ על התפריט ניתוח ובחר הגדרת מדידות. (ג) בחר בעוצמה המשולבת באזור ובערך אפור ממוצע. בחר אזור ללא זריחה כדי להגדיר את הרקע. (ד) לייצא את הנתונים לתוך Excel ולחשב את CTCF עבור ניתוח סטטיסטי העוקב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

על מנת להעריך אם ZnO NP יכול לגרום אפופטוזיס ב MRC5 פיברותקיעות, אנו משתמשים בזרם cy, לנסות להבדיל בין התאים נמק או מוות של תאים האפוטוטיים. בתאים חיים רגילים, פוספולידיסרין (PS) מותאם לשפה הקרום של התא. אם ואפופטוזיס מתרחשת, PS הוא translocated מוקם לתוך העלון של קרום הפלזמה, המאפשר את הכריכה של אנשין V מתויג עם fluorescein (FITC אנשין V)29. מצד שני, propidium יודיד אדום-פלורסנט (PI), לצבוע את חומצת הגרעין, הוא אטום לתאי החיים ותאי האפוטוטיים אך כתמי תאים מתים30. זה מאפשר לנו לזהות את התאים המתים (אדום וירוק), תאים אפוטוטיים (זריחה ירוקה) ותאים חיים (מעט או לא זריחה), באמצעות cytometer זרימה עם קו של 488 ננומטר של לייזר של ארגון יון לעירור.

עבור כתמים של ה-" דרוזופילה ", חשוב ליצור מחדש את הצבע עם dmso בדיוק לפני תחילת הניסוי, כמו אחסון ממושך עלול להוביל לחמצון אוטומטי של הצבע ההופך את הצבע לצבע כהה/ארגמני31, 32. בנוסף, גם פתרונות המניה מחדש נוטים לפוג מהר מדיי, ולכן יש לשים לב לתאריך התפוגה. לחילופין, בדים פלואורוגנטיים כגון הגרסה הירוקה של בדיקה פוטויציבה, אשר יש את היכולת הנוספת להיות מריבוב עם כתמים, ומייצרת אותות ברורים הרבה יותר מאשר הסופי, ניתן להשתמש. המעיים הועברו למדיום של שניידר, המכיל את הצבע על הריכוז הרצוי ללא הוספה של תיקונים. זה כדי להתיר את השילוב של הצבע בתאים חיים, ולכן כתמים מבוצע במדיום התרבות, כדי לאפשר נשימה טובה יותר של התאים.

לגבי כימות הכדוריות הללו, לצורך התחלה, הימנע מרוויית הפיקסלים בתאים שאינם מטופלות בפיקוח. תוכנית הדימות שימש לקביעת זמן חשיפה באמצעות סימון פיקסלים רוויים בדגל חזותי. המדגם מטופל שימש כדי לקבוע את זמן החשיפה ולשמור על הפרמטרים אותם בעת לכידת תמונות להשוואת העוצמה על פני קבוצות טיפול שונות אשר חשוב לכמת את עוצמת התמונה הפלואורסצנטית בהמשך. חיוני לרכוש את כל התמונות (שליטה ומטופלים דגימות) באמצעות אותה מערכת והגדרות רכישה/פרמטרים, ואת הרקע צריך להיות מתוקננת עבור כל התמונות (כך שיש עקביות לחיסור הרקע)33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

המחקר היה נתמך על ידי מספר מענק R706-000-043-490. המחקר אינו מייצג את ההשקפה של נותן החסות המענק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15% Methyl 4-Hydroxybenzoate Sigma Aldrich
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Bacto Agar BD biosciences
cncCK6/TM3, Sb a gift from Dr. Kerppola T
Cornmeal, glucose, yeast brewer Sigma Aldrich
CyAn ADP with Summit Software DAKO https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine) Thermo Fisher Scientific D11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD biosciences 556547
Fluorescent microscope Olympus
Glucolin Supermarket
ImageJ software NIH
MRC5 human lung fibroblast ATCC CCL-171
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fisher Scientific 21720-024
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO NIG-FLY
Zinc Oxide Nanoparticles Sigma Aldrich 721077 Refer Sheet 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
  2. Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
  3. Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
  4. De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
  5. Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
  6. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
  7. Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
  8. Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
  9. Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
  10. Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
  11. Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
  12. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  13. Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
  14. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
  15. Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
  16. Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
  17. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  18. Jennings, B. H. Drosophila - a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  19. Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
  20. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
  21. Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
  22. Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
  23. Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
  24. Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
  25. Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
  26. Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
  27. Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
  28. Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
  29. Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
  30. Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , Chapter 1 (2011).
  31. Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
  32. Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
  33. Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 151 תחמוצת אבץ חלקיקים רעילות מוות תאים לחץ חמצוני MRC5 תאים דרוזוהילה
מחקר רעילות של תחמוצת אבץ חלקיקים בתרבות התא ו- <em>Drosophila ילה מלאנוסטר</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E.,… More

Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E., Bay, B. H., Baeg, G. H. Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e59510, doi:10.3791/59510 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter