Summary
Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der toxikologischen Profile von Zinkoxid-Nanopartikeln (ZnO NPs), insbesondere der Art des Zelltodes in menschlichen MRC5-Lungenfibroblasten und der ROS-Bildung in der Fruchtfliege Drosophila.
Abstract
Zinkoxid-Nanopartikel (ZnO NPs) haben eine breite Palette von Anwendungen, aber die Anzahl der Berichte über ZnO NP-assoziierte Toxizität hat in den letzten Jahren rapide zugenommen. Jedoch, Studien, die die zugrunde liegenden Mechanismen für ZnO NP-induzierte Toxizität aufklären, sind spärlich. Wir ermittelten die Toxizitätsprofile von ZnO NPs anhand von In-vitro- und In-vivo-Experimentalmodellen. Bei ZnO NP-exponierten MRC5-Lungenfibroblasten wurde eine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit beobachtet, was zeigt, dass ZnO NPs zytotoxische Wirkungen ausüben. In ähnlicher Weise, interessanterweise, Darm ausgesetzt ZnO NPs zeigte einen dramatischen Anstieg der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Fruchtfliege Drosophila. Es sind eingehendere Studien erforderlich, um eine Risikobewertung für die verstärkte Nutzung von ZnO-NPs durch Verbraucher zu erstellen.
Introduction
Nanotechnologie bezieht sich auf die Anwendung nanogroßer Materialien, die in allen wissenschaftlichen Bereichen verwendet werden, einschließlich Medizin, Materialwissenschaft und Biochemie. ZnO NPs, die für ihre ultraviolette Streuung, chemische Sensorik und antimikrobielle Eigenschaften sowie hohe elektrische Leitfähigkeit bekannt sind, werden beispielsweise bei der Herstellung verschiedener Konsumgüter wie Lebensmittelverpackungen, Kosmetika, Textilien, Kautschuke, Batterien, Katalysatoren für die Rückgasbehandlung von Kraftfahrzeugen und biomedizinische Anwendungen1,2,3.
Die aufkeimenden Anwendungen von ZnO NP-basierten Produkten, die zu einer erhöhten Exposition des Menschen gegenüber ZnO-NPs führen, haben jedoch Bedenken hinsichtlich ihrer möglichen nachteiligen Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit aufkommen lassen. Eine Reihe von in vitro zellulären Studien haben gezeigt, dass ZnO NPs oxidativen Stress, autophagiebedingte Zytotoxizität, Entzündung und Genotoxizität4,5,6,7,8 induzieren können . Insbesondere wird angenommen, dass die Toxizität von ZnO NPs durch die Auflösung von Zn zu freien Zn2+-Ionen sowie die Oberflächenreaktivität von ZnO verursacht wird, was zu den zellulären ionischen und metabolischen Ungleichgewichten führt, die mit einer beeinträchtigten ionischen Homöostase und Hemmung des Ionentransports4,7,9,10. Wichtig ist, dass Studien gezeigt haben, dass die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) einer der primären Mechanismen ist, die ZnO NPs-assoziierte Toxizität zugrunde liegen. Unzureichende antioxidative Aktivität nach ROS Beleidigung hat sich als verantwortlich für die Auslösung der Zytotoxizität und DNA-Schäden9. Die toxischen Wirkungen von ZnO NPs wurden auch in Tiermodellen berichtet, einschließlich Nagetier1, Zebrafisch11,12, sowie die wirbellose Drosophila13.
Drosophila dient als etabliertes alternatives Tiermodell für das Toxizitätsscreening chemischer Einheiten und Nanomaterialien (NMs)14,15. Wichtig ist, dass es ein hohes Maß an genetischer und physiologischer Ähnlichkeit zwischen dem Menschen und Drosophila gibt, was die Verwendung von Drosophila als In-vivo-Modell für die Bewertung biologischer Reaktionen auf Umweltschadstoffe wie NMs rechtfertigt. 16. Darüber hinaus gibt es viele Vorteile der Verwendung von Drosophila aufgrund seiner geringen Größe, kurze Lebensdauer, genetische Amenabilität, und einfache und kostengünstige Wartung. Darüber hinaus ist Drosophila weithin für die Erforschung der Genetik, Molekular- und Entwicklungsbiologie angenommen worden, seit sein vollständiges Genom vor Jahren im Jahr 2000 vollständig sequenziert wurde, wodurch es für eine Vielzahl von Hochdurchsatz-Screenings geeignet ist. und zur Behandlung ungelöster biologischer Fragen17,18,19,20,21. In den letzten Jahren, eine Reihe von Studien im Zusammenhang mit Immuntoxizität mit verschiedenen Arten von NPs in Drosophila wurden berichtet15,22,23,24. Dieses grundlegende neue Wissen aus den Studien mit Drosophila hat dazu beigetragen, mehr Einblicke in unser Verständnis der Nanotoxikologie zu geben.
ROS ist ein bekannter Schuldiger für Zytotoxizität und Genotoxizität, verursacht durch NPs, insbesondere metallbasierte NPs25. ROS sind sauerstoffhaltige chemische Spezies mit höheren reaktiven Eigenschaften als molekularer Sauerstoff. Freie Radikale wie Superoxid-Radikal (O2-) und sogar nicht-radikale Moleküle wie Wasserstoffperoxid (H2O2) können als ROS fungieren. Unter normalen physiologischen Bedingungen sind sie verpflichtet, zelluläre Homöostase26zu erhalten, jedoch kann übermäßige ROS aufgrund von Überproduktion oder Dysregulation des antioxidativen Abwehrsystems oxidativen Stress verursachen, was zu Schäden an Proteinen führen, Lipide und Desoxyribonukleinsäure (DNA)27. Zum Beispiel, wenn ROS-Spiegel erhöhen und Glutathion (GSH) Niveau sinkt gleichzeitig, Störung der Adenosintriphosphat (ATP) Synthese findet statt und Lactat-Dehydrogenase (LDH) Niveau steigt im Medium, gipfelnd in Zelltod27.
Hier bieten wir Protokolle für die Durchführung zellulärer und genetischer Analysen mit kultivierten Säugetierzellen und Drosophila, um die potenziellen Nebenwirkungen von ZnO NPs zu bestimmen. Abbildung 1zeigt eine Übersicht über die Methode zur Toxizitätsstudie von ZnO NPs .
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Protocol
1. Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) Analyse von lived/Fixed Cells
- Sonicate ZnO NPs in Suspension für 15 min.
- Bereiten Sie ZnO NPs in verschiedenen Konzentrationen (z.B. 0, 10, 25, 50,100 und 200 g/ml) mit 1 mg/ml ZnO NP-Stammlösung zur Behandlung kultivierter Zellen vor.
- Seed MRC5 menschliche Lungen-Fibroblasten (1 x 105 Zellen/gut) auf eine 6-Well-Kulturplatte pro Tag im Voraus, und dann behandeln Sie die Zellen mit 2 ml ZnO NPs (in Triplicates) für 8 h, 16 h und 24 h.
- Zu jedem Zeitpunkt die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min sammeln.
- Waschen Sie die Zellpellets zweimal mit Phosphatgepufferter Saline (PBS).
- Setzen Sie die Zellen mit 1x Bindungspuffer, der aus 0,1 M HEPES/Natriumhydroxid (NaOH), 1,4 M Natriumchlorid (NaCl) und 25 mM Calciumchlorid (CaCl2) besteht, bei einer Konzentration von 1 x 105 Zellen pro 100 l wieder auf.
- Fügen Sie 5 L Fluorescein isothiocyanat (FITC) Annexin V Fleck und 5 l Propidiumiodid (PI) DNA-Färbung, und inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei Raumtemperatur (RT; 25 °C) im Dunkeln.
- Aufladen Sie die Proben mit einem zusätzlichen 400-L-Bindungspuffer, bevor Sie die Zellen nach Durchflusszytometrie sortieren. Für jede Probe werden mindestens 10.000 Zellen analysiert.
- Tabuulieren Sie das Balkendiagramm mit der erhaltenen Medianintensität.
2. Exposition von ZnO NPs gegenüber Drosophila
- Fügen Sie 1 ml Nanopartikel in verschiedenen Konzentrationen in Fläschchen, gefolgt von 9 ml Fliegenfutter, um eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml oder 0,5 mg/ml ZnO NPs zu erreichen.
- Mischen Sie die Nanopartikel mit Lebensmitteln gründlich in den Fläschchen mit der Pipette.
- Fliegenfutter mit ZnO NPs vor Gebrauch mindestens 2-3 h abkühlen lassen.
- Führen Sie erwachsene männliche und weibliche Fliegen in die Fläschchen für 5 Tage, und lassen Sie sie zu paaren und legen Eier (die als weiße Flecken erscheinen) auf der Oberfläche der Nahrung.
- Entfernen Sie die Elternfliegen, und lassen Sie die Eier weiterentwickeln, die aus 4 verschiedenen Entwicklungsstadien besteht (embryonale, Larven- und Erwachsenenstadium).
3. Zerlegung der Fliege
- Sammeln Sie späte 3rd instar Larven von der Wand der Fläschchen für Analysen. Frisch gelegte Eier entwickeln sich in der Regel zu späten3. Instar Larven nach 72-120 h bei RT.
- Reinigen Sie die Sezierschale und füllen Sie den Brunnen mit Dissektionsmedium/PBS.
- Sezieren Sie die Larven (später 3rd instar) unter dem Stereomikroskop, mit einem Paar Zangen.
- Verwenden Sie die Spitze der Zange, um ein winziges Loch zu machen und brechen Sie die Nagelhautschicht der Larven. Ziehen Sie den Darm vorsichtig heraus und legen Sie ihn in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Schneiders Drosophila-Medium, bevor der Befestigungsschritt mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PF) verwendet wird.
- 3.5Befestieren Sie den Darm in PF für 10 min bei RT, für nachfolgende Experimente, wie z. B. Immunfärbung.
4. ROS-Erkennung mit Dihydroethidium (DHE) Färbung
- Behandeln Sie Larven mit verschiedenen Konzentrationen von ZnO NPs, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
- Nach der Zerlegung des Darms von3. Instar-Larven, wie unter Abschnitt 3 beschrieben, inkubieren Sie den Darm in Schneiders Drosophila-Medium bei RT, bevor Gewebefärbung durchgeführt wird. Lösen Sie 1 l DHE-Farbstoff (aus der Lagerkonzentration von 30 mM) in 1 ml Schneiders Medium auf, was eine endige Arbeitskonzentration von 10-30 m DHE-Farbstoff macht.
- Inkubieren Sie den Darm für 5 min bei RT im Dunkeln, und waschen Sie dann dreimal mit Schneiders Medium für alle 5 min.
- Fixieren Sie den Darm mit 4% PF (optionaler Schritt) und montieren Sie den Darm auf Glasschlitten, mit Anti-Fade-Montagemedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI). Erfassen Sie Bilder unter einem konfokalen Mikroskop.
5. Messung der Fluoreszenz mit ImageJ-Software
- Importieren Sie die erfassten Fluoreszenzbilder, die mit Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Laserscanmikroskopie aufgenommen wurden, in die ImageJ-Software.
- Klicken Sie auf das Menü Analysieren und wählen Sie Messungen einstellen.
- Wählen Sie die Ausgabemessung aus, z. B. flächenintegrierte Intensität und mittlerer Grauwert.
- Klicken Sie auf Messen.
- Wählen Sie einen Bereich ohne Fluoreszenz aus, um den Hintergrund festzulegen.
- Exportieren Sie die Daten in die Excel-Tabelle, und ermitteln Sie die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) mithilfe der berechnungsgemäß enden.
CTCF = Integrierte Dichte - (Fläche der ausgewählten Zelle X Mittlere Fluoreszenz von Hintergrundwerten) - Erstellen Sie ein Balkendiagramm, und führen Sie statistische Analysen durch.
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Representative Results
NP-exponierte Zellen wurden mit dem Zellfärbereagenz-Kit verarbeitet, gefolgt von der Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie. ZnO NP-behandelte Zellen (unten, rechter Bereich) weisen einen höheren Prozentsatz früher (R3)/später apoptotischer Zellen (R6) auf als Kontrollzellen (R5, unten, links). Der nekrotische Zelltod wird durch R4 (oben, rechts) bezeichnet (Abbildung 2). Die Ergebnisse des FITC/Annexin V Assays auf ZnO NP-behandelten MRC-5-Fibroblasten sind in Abbildung 2dargestellt.
Für die Drosophila-Experimente wurden beschallte ZnO-NPs in verschiedenen Konzentrationen zu Fliegenfutter in 10 ml-Röhren hinzugefügt und dann mit einem Pipettenregler gut gemischt (Abbildung 3). Spätdritte Instar-Larven, die von Fläschchen gesammelt wurden, wurden unter dem Stereomikroskop seziert. Die Larven wurden zuerst gewaschen, um Reste der verbleibenden Nahrung zu entfernen (Abbildung 4). Die äußere Nagelhautschicht wurde auseinandergerissen, um innere Organe freizulegen. Der Darm wurde durch das charakteristische lange und halbtransparente Aussehen identifiziert (wobei andere Organe unter dem Mikroskop undurchsichtig und hellgelb erscheinen) (Abbildung 5). Der Darm wurde sorgfältig entfernt, ohne zu brechen, und in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen, das fixatives auf Eis enthält (Abbildung 6).
Für die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität, wie z.B. die Intensität der DHE-Sonde im Darm, wurden die Bilder in JPEG- oder TIFF-Formaten exportiert und mit der ImageJ-Software geöffnet. Der Teil des Darms für die Analyse wurde ausgewählt und identifiziert, zum Beispiel die Midgut- oder Hinterdarmregion, und die Fluoreszenzintensität der Region von Interesse (ROI) wurde gemessen. Um die relativen Intensitäten der verschiedenen Versuchsgruppen zu vergleichen, verwendeten wir dieselbe quantitative konfokale Mikroskopiemethode, die im vorherigen Abschnitt beschrieben wurde. Zum Vergleich der Fluoreszenzintensitäten wurde der Parameter mit der negativen unbehandelten Steuerung festgelegt. Berechnungen der Signalintensität auf der Grundlage von Kalibrierintensitäten der unbehandelten Steuerung ermöglichten einen direkten Vergleich zwischen verschiedenen Versuchsgruppen. Abbildung 7 zeigt die durchschnittliche Intensität des DHE-Signals im3. Instar-Larvendarm, der ZnO NPs in unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt ist. Der Darm der Larven, der mit 0,5 mg/ml ZnO NP-Behandlung behandelt wurde, zeigte die höchste Fluoreszenzintensität.
Die Unterschiede in den relativen Intensitäten zwischen allen Versuchsgruppen wurden weiter tabellarisch dargestellt, und es wurden statistische Analysen durchgeführt, die sowohl qualitative als auch quantitative Ergebnisse lieferten (Abbildung 8).
Abbildung 1: Überblick über die Methode zur Toxizitätsstudie von ZnO-NPs. Für In-vitro-Arbeiten wurden ZnO NP-behandelte Zellen vor der Durchflusszytometrie-Analyse gefärbt. Für in vivo Arbeiten wurde der Darm von3. Instar-Larven seziert, gefolgt von der Färbung mit DHE-Farbstoff und Bildaufnahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Punktdiagramm von Zellen, die basierend auf ihrer FITC- und PE-Färbung in verschiedene Populationen unterteilt sind. Die Piktogramme zeigen die Ergebnisse des FITC/Annexin V-Assays mit 24-h-Behandlung von ZnO-NPs auf MRC-5. Anschließend kann eine statistische Analyse der Zellen in verschiedenen Stadien durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Zubereitung von ZnO NP-haltigem Fliegenfuttermedium. (A) Zutaten für Fliegenfutter werden dem Wasser zugesetzt, anschwellen lassen und 5 Min. gekocht. (B) Nach abkühlen auf 50 °C unter Rühren wurde Nipagin zugesetzt und gründlich vermischt. (C) Bereiten Sie einen Master-Mix für die Nanopartikel vor (Gesamtvolumen von höchstens 10 % des endgültigen Lebensmittelvolumens). (D) Medium wird dann aliquoted, mit ZnO NPs in verschiedenen Konzentrationen gemischt und vor der Lagerung vollständig abkühlen lassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Das gesamte Darmsezieren. (A) Übertragen Sie3. inStarlarven auf eine Dissektionsscheibe. (B) Verwenden Sie Zangen, um eine Larve sanft zu halten, und (C) waschen Sie den Rest der Nahrung mit Kochsaline weg. (D) Reißen Sie die Nagelhaut vorsichtig auseinander, ohne den Darm und andere innere Organe zu berühren. (E) Legen Sie den Darm für die nachfolgende Prozedur in die Wäsche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Die Anatomie des Verdauungstraktes/Darms. Der aus der Drosophila-Larve gewonnene Darm ist in drei diskrete Domänen unterschiedlicher Entwicklungsherkunft unterteilt, nämlich das Vorgut, das Mittelgut und das Hintergut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Färbung des Darmgewebes mit DHE. (A) Bereiten Sie einen Master-Mix vor, der Wachstumsmedium und DHE (eine Endkonzentration von 30 m) enthält. (B) Fügen Sie den Master-Mix in den Brunnen einer Dissektionsscheibe ein. (C) Übertragen Sie das sezierte Darmgewebe in den Brunnen, der die DHE-Mastermischung enthält. (D) Inkubieren bei RT für 5 min und schützen Sie das Gewebe vor Licht; waschen 3x in PBS/Saline für 5min. (E) Fix in 4% PF für 10 min; waschen Sie das Gewebe dreimal mit PBS (optional). (F) Den Darm vorsichtig auf einen Glasschlitten übertragen, flach legen, ohne Gewebe gefaltet zu haben und mit Montagemedium zu montieren, bevor er mit Deckglas bedeckt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: ZnO NPs induzieren ROS im Darm von Drosophila Larven. (a) DHE-Färbung im Kontrolldarm zeigt den Basalgehalt von ROS. (b und c) Behandelte Darmzellen zeigen eine allmähliche Erhöhung der DHE-Intensität in dosisabhängiger Weise. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Quantifizierung von fluoreszierenden Bildern mit ImageJ. (A) Importieren Sie die aufgenommenen Bilder. (B) Klicken Sie auf das Menü Analysieren und wählen Sie Messungen einstellen. (C) Wählen Sie die integrierte Flächenintensität und den mittleren Grauwert aus. Wählen Sie einen Bereich ohne Fluoreszenz aus, um den Hintergrund festzulegen. (D) Exportieren Sie die Daten in Excel und berechnen Sie die CTCF für die nachfolgende statistische Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Um zu beurteilen, ob ZnO NP Apoptose in MRC5-Fibroblasten induzieren kann, verwenden wir Die durchflusszytometrie, um die Zellen vom nekrotischen oder apoptotischen Zelltod zu unterscheiden. In normalen lebenden Zellen wird Phosphatidylserin (PS) an der Zellmembran lokalisiert. Wenn Apoptose auftritt, wird PS in die extrazelluläre Packungsbeilage der Plasmamembran transziert, so dass die Bindung von Annexin V mit Fluorescein (FITC Annexin V)29gekennzeichnet ist. Andererseits ist das rotfluoreszierende Propidiumiodid (PI), ein Nukleinsäure-Bindungsfarbstoff, für lebende Zellen und apoptotische Zellen undurchlässig, färbt aber abgestorbene Zellen30. Dies ermöglicht es uns, die abgestorbenen Zellen (rot und grün), apoptotische Zellen (grüne Fluoreszenz) und lebende Zellen (wenig oder gar keine Fluoreszenz) mit einem Durchflusszytometer mit der 488 nm Linie eines Argon-Ionen-Lasers zur Anregung zu identifizieren.
Für die DHE-Färbung des Drosophila-Darms ist es wichtig, den Farbstoff mit DMSO kurz vor Beginn des Experiments zu rekonstituieren, da eine längere Lagerung zu einer Autooxidation des Farbstoffs führen kann, die den Farbstoff in dunkle/purpurfarbene Farbe verwandelt31, 32. Darüber hinaus verfallen die rekonstituierten Bestandslösungen tendenziell auch recht schnell, so dass man auf das "Verfallsdatum" achten muss. Alternativ könnten fluorogene Sonden wie die grüne Version der fototablen Sonde verwendet werden, die die zusätzliche Fähigkeit hat, mit Flecken multiplexiert zu werden, und viel klarere Signale als DHE erzeugen. Der sezierte Darm wurde ohne Fixierung auf Schneiders Medium übertragen, das den Farbstoff in der gewünschten Konzentration enthält. Dies soll die Aufnahme des Farbstoffs in lebende Zellen ermöglichen, und daher wird Färbung im Kulturmedium durchgeführt, um eine bessere Atmung der Zellen zu ermöglichen.
Im Hinblick auf die Quantifizierung der DHE-Färbung, für einen Anfang, vermeiden Sättigung der Pixel in der Kontrolle unbehandelte Zellen. Das Imaging-Softwareprogramm wurde verwendet, um die Belichtungszeit durch visuelle Kennzeichnung gesättigter Pixel zu bestimmen. Die unbehandelte Probe wurde verwendet, um die Belichtungszeit einzustellen und die gleichen Parameter bei der Aufnahme von Bildern für den Vergleich der Intensität über verschiedene Behandlungsgruppen beizubehalten, was für die Quantifizierung der Fluoreszenzbildintensität später wichtig ist. Es ist wichtig, alle Bilder (Steuern und behandelte Samples) mit dem gleichen System und Erfassungseinstellungen/Parametern zu erfassen, und der Hintergrund sollte für alle Bilder standardisiert werden (so dass Konsistenz für die Hintergrundsubtraktion vorhanden ist)33.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Studie wurde durch die Stipendiennummer R706-000-043-490 unterstützt. Die Studie stellt nicht die Ansicht des Stipendiaten dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| Cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| ImageJ software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
References
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