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Immunology and Infection

세포 배양 및 초파리 멜라노가스터에서 산화 아연 나노 입자의 독성 연구

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59510
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

Summary

우리는 특히 산화 아연 나노입자(ZnO NPs)의 독성학적 프로파일을 평가하기 위한 상세한 프로토콜을 설명하며, 특히 인간 MRC5 폐 섬유아세포에서의 세포 사멸 유형 및 과일 플라이 드로소필라에서의ROS 형성을 설명한다.

Abstract

산화 아연 나노 입자 (ZnO NPs)는 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있지만 ZnO NP 관련 독성에 대한 보고의 수는 최근 몇 년 동안 급속히 증가하고 있습니다. 그러나, ZnO NP 유도 독성에 대 한 기본 메커니즘을 해명 하는 연구는 부족. 우리는 시험관 내 및 생체 내 실험 모델을 모두 사용하여 ZnO NPs의 독성 프로파일을 결정했습니다. ZnO NP-노출된 MRC5 폐 섬유아세포에서 세포 생존력의 현저한 감소가 관찰되었으며, ZnO NPs가 세포 독성 효과를 발휘한다는 것을 보여준다. 유사하게, 흥미롭게도, ZnO NPs에 노출된 장은 과일 플라이 드로소필라에서반응성 산소 종 수준(ROS)의 극적인 증가를 나타냈다. 소비자에 의한 ZnO NP의 증가된 사용에 대한 위험 평가를 수립하기 위해서는 보다 심층적인 연구가 필요합니다.

Introduction

나노 기술은 의학, 재료 과학 및 생화학을 포함한 모든 과학 분야에서 사용되는 나노 크기의 재료의 응용을 말합니다. 예를 들어, 자외선 산란, 화학 적 감지 및 항균 특성뿐만 아니라 높은 전기 전도성으로 알려진 ZnO NPs는 식품 포장, 화장품, 섬유, 고무, 배터리, 자동차 꼬리 가스 처리용 촉매 및 생물 의학 관련 응용 분야1,2,3.

그러나, ZnO NP 기반 제품의 급성장 응용 프로그램, ZnO NP에 대 한 인간의 노출증가로 이어지는, 인간의 건강에 그들의 잠재적인 불리 한 영향에 대 한 우려를 제기 했다. 시험관 내 세포 내 연구의 숫자는 ZnO NPs 산화 스트레스를 유도할 수 있음을 입증했다, 자가 포식 관련 세포 독성, 염증, 및 유독성4,5,6,7,8 . 특히, ZnO NPs의 독성은Zn2+ 이온을 해방시키기 위해 Zn의 용해뿐만 아니라 ZnO의 표면 반응성에 의해 유발되는 것으로 추정되며, 이로 인해 세포 이온성 및 대사 불균형이 손상된 이온 성 항상성과 결합되어 이온 수송의 억제4,7,9,10. 중요한 것은, 연구 결과는 반응성 산소 종의 생성이 (ROS) ZnO NPs 관련 독성의 근본적인 기계장치 의 한개이다는 것을 보여주었습니다. ROS 모욕 에 따른 불충분한 항산화 활성은 세포 독성 및 DNA 손상을 유도하는 데 책임이 있는 것으로 나타났다9. ZnO NPs의 독성 효과는 또한 설치류1,제브라피시11,12,무척추 동물 초파리13을포함하는 동물 모델에서 보고되었다.

Drosophila는 화학 물질 및 나노 물질 (NMs)14,15의독성 스크리닝을 위한 잘 확립된 대체 동물 모델로서 역할을 한다. 중요한 것은, NMs와 같은 환경 오염물질에 대한 생물학적 반응을 평가하기 위한 생체 내 모델로 Drosophila의 사용을 정당화하는 인간과 초파리 사이의 유전적 및 생리적 유사성의 높은 수준이 있습니다. 16. 또한, 때문에 작은 크기, 짧은 수명, 유전 편의 성, 쉽고 비용 효율적인 유지 보수에 초파리를 사용하는 많은 장점이 있습니다. 더욱이, Drosophila는 유전학, 분자 및 발달 생물학의 연구 결과, 그것의 가득 차있는 게놈이 2000년에 다시 년 전에 완전히 연속된 이래로 널리 채택되었습니다, 그러므로 높은 처리량 검열의 다양한 을 위해 적당하 그리고 해결되지 않은 생물학적 질문을 해결하기 위해17,18,19,20,21. 최근에는 초파리에서 다양한 유형의 NPs를 이용한 면역독성에 관한 다수의 연구가15,22,23,24로보고되고 있다. Drosophila를 사용하여 연구 결과에서 얻은 이 근본적인 새로운 지식은 나노 독성학의 우리의 이해에 더 많은 통찰력을 제공하는 것을 도왔습니다.

ROS는 NPs, 특히 금속 계 NPs25에의한 세포 독성 및 유독성에 대한 잘 알려진 범인입니다. ROS는 분자 산소보다 반응성이 높은 산소 함유 화학 종입니다. 수퍼옥사이드 라디칼(O2-)과 같은 자유 라디칼은과산화수소(H2O2)와같은 비라디칼 분자도 ROS로서 작용할 수 있다. 정상적인 생리적 상태에서, 그들은 세포 항상성26을유지하는 데 필요합니다, 그러나, 과다 한 ROS 때문에 과다 한 ROS 과잉 생산 또는 항 산화 방어 시스템의 dysregulation 산화 스트레스를 일으킬 수 있습니다., 단백질에 손상을 선도 하 고, 지질 및 디옥시리보핵산(DNA)27. 예를 들어, ROS 수치가 증가하고 글루타티온(GSH) 수준이 수반적으로 감소함에 따라, 아데노신 삼인산(ATP) 합성의 중단이 일어나고 배지에서 젖산 탈수소효소(LDH) 수준이 증가하여 세포사멸(27)이절정에 달한다.

여기에서, 우리는 ZnO NPs의 잠재적인 역효과를 결정하기 위하여 배양된 포유류 세포 및 Drosophila를 사용하여 세포와 유전 분석을 능력을 발휘하기 위한 프로토콜을 제공합니다. ZnO NPs의 독성 연구에 사용되는 방법에 대한 개요는 그림 1에나와 있습니다.

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Protocol

1. 살아있는/고정된 세포에 대한 형광 활성화 세포 선별(FACS) 분석

  1. 15 분 동안 정지에 초음파 ZnO NPs.
  2. 배양 된 세포의 치료를 위해 1 mg / mL ZnO NP 스톡 솔루션을 사용하여 다양한 농도 (예를 들어, 0, 10, 25, 50,100 및 200 μg / mL)에서 ZnO NP를 준비하십시오.
  3. MRC5 인간 폐 섬유아세포(1 x 105 세포/웰)를 하루 전에 6-웰 배양 판위에, 그리고 8시간, 16시간 및 24시간 동안 ZnO NPs 2 mL(삼중)으로 세포를 치료한다.
  4. 각 시점에서, 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다.
  5. 세포 펠릿을 인산완충식염수(PBS)로 두 번 세척합니다.
  6. 0.1 M HEPES/수산화 나트륨 (NaOH), 1.4 M 염화 나트륨 (NaCl), 25 mM 염화 칼슘 (CaCl2)으로구성된 1x 결합 버퍼로 세포를 100 μL 당 1 x 105 세포의 농도로 다시 중단하십시오.
  7. 플루오레세인 이소티오차네이트(FITC) 아넥신 V 얼룩 5 μL과 프로피듐 요오드화물(PI) DNA 얼룩 5 μL을 넣고 어두운 실내 온도(RT; 25°C)에서 15분 동안 세포를 배양합니다.
  8. 유세포 분석으로 세포를 분류하기 전에 1x 결합 버퍼의 추가 400 μL로 샘플을 위로 합니다. 각 샘플에 대해 최소 10,000개의 셀이 분석됩니다.
  9. 얻은 중앙값을 사용하여 막대 차트를 표로 표로 표시합니다.

2. 초파리에 ZnO NPs의 노출

  1. 다른 농도의 나노 입자 1 mL을 바이알에 넣고 9 mL의 플라이 푸드를 추가하여 0.1 mg / mL, 0.25 mg / mL 또는 0.5 mg / mL ZnO NPs의 최종 농도를 만듭니다.
  2. 나노 입자를 파이펫을 사용하여 바이알에 음식과 철저히 혼합하십시오.
  3. ZnO NPs가 들어 있는 플라이 푸드를 사용하기 전에 적어도 2-3시간 동안 식히십시오.
  4. 5 일 동안 바이알에 성인 남성과 암컷 파리를 소개하고 음식의 표면에 계란 (흰 반점으로 나타나는)을 짝짓기하고 낳을 수 있습니다.
  5. 부모의 파리를 제거하고, 계란이 4 개의 다른 발달 단계 (배아, 애벌레, pupal 및 성인 단계)로 구성된 추가 발달을 겪도록 허용합니다.

3. 비행의 해부

  1. 분석을 위해 바이알의 벽에서 늦은3rd instar 애벌레를 수집합니다. 갓 낳은 계란은 일반적으로 RT에서 72-120 시간 후에 늦은 3rd instar 애벌레로 발전합니다.
  2. 해부 접시를 청소하고 해부 매체 / PBS로 우물을 채웁니다.
  3. 포셉 쌍을 사용하여 입체 현미경으로 애벌레 (늦은 3rd instar)를 해부하십시오.
  4. 포셉의 끝을 사용하여 작은 구멍을 만들고 애벌레의 표피 층을 열어 보냅니다. 조심스럽게 용기를 꺼내 슈나이더의 드로소필라 배지를 함유한 1.5 mL 마이크로원심지 튜브에 넣고, 4% 파라포름알데히드(PF)의 1 mL을 사용하여 고정 단계를 진행한다.
  5. 3.5 면역 염색과 같은 후속 실험을 위해 RT에서 10 분 동안 PF로 용기를 고정하십시오.

4. 디하이드로에티듐 (DHE) 염색을 이용한 ROS 검출

  1. 2.1단계에서 설명한 바와 같이 다양한 농도의 ZnO NPs로 애벌레를 치료한다.
  2. 섹션 3에 설명 된 대로 3rd instar 애벌레에서 창 자의 해부에 따라, 조직 염색을 수행 하기 전에 RT에서 슈나이더의 Drosophila 매체에 창 자를 배양. 슈나이더 배지의 1 mL에 DHE 염료 1 μL (30 mM의 재고 농도에서)을 용해시켜 최종 작업 농도를 10-30 μM DHE 염료로 만듭니다.
  3. 어두운 RT에서 5 분 동안 용기를 배양 한 다음 슈나이더의 매체를 사용하여 5 분마다 세 번 씻으하십시오.
  4. 4% PF (옵션 단계)로 용기를 고정하고 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 포함하는 안티 페이드 장착 매체로 유리 슬라이드에 용기를 장착하십시오. 공초점 현미경으로 이미지를 캡처합니다.

5. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 형광 측정

  1. 형광 현미경 또는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 획득한 캡처된 형광 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 가져옵니다.
  2. 분석 메뉴를 클릭하고 측정 설정을 선택합니다.
  3. 면적 통합 강도 및 평균 회색 값과 같은 출력 측정값을 선택합니다.
  4. 측정을 클릭합니다.
  5. 형광이 없는 영역을 선택하여 배경을 설정합니다.
  6. 데이터를 Excel 스프레드시트로 내보내고 아래와 같이 계산을 사용하여 수정된 총 셀 형광(CTCF)을 확인합니다.
    CTCF = 통합 밀도 - (선택한 셀 X의 영역 배경 판독값의 형광평균)
  7. 막대형 차트를 구성하고 통계 분석을 수행합니다.

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Representative Results

NP-노출된 세포는 세포 염색 시약 키트로 처리되었고, 이어서 유세포측정을 사용하여 세포 선별을 하였다. ZnO NP 처리 된 세포 (하단, 오른쪽 패널)는 대조군 세포 (R5, 하단, 왼쪽 패널)보다 초기 (R3) / 후기 세포 (R6)의 높은 백분율을 나타낸다. 괴사 세포 사멸은 R4(위, 오른쪽 패널)로 표시된다(그림2). ZnO NP 처리 MRC-5 섬유아세포에 대한 FITC/합병 V 분석의 결과는 도 2에나타내고 있다.

Drosophila 실험을 위해, 다양한 농도에서 초음파 처리된 ZnO NPs를 10 mL 튜브에서 플라이 푸드에 첨가한 다음 파이펫 컨트롤러를 사용하여 잘 혼합하였다(그림3). 바이알로부터 채취한 후반 제3의 유충은 입체현미경으로 해부되었다. 유충을 먼저 세척하여 남은 음식의 잔재를 제거하였다(그림4). 외부 표피 층은 내부 장기를 노출하기 위해 찢어졌다. 창자는 특징적인 길고 반투명한 외관에 의해 확인되었습니다 (다른 기관은 현미경의 밑에 불투명하고 밝은 황색으로 나타나는 반면)(그림 5). 장은 깨지지 않고 조심스럽게 제거하고 얼음에 고정제를 함유한 새로운 미세 원심 분리튜브로 옮겼습니다(그림6).

창자에 있는 DHE 프로브의 강도와 같은 형광 강도의 양을 위해, 심상은 JPEG 또는 TIFF 형식으로 내보내고 ImageJ 소프트웨어로 열렸습니다. 분석을 위한 장의 일부를 선택 및 확인하였고, 예를 들어, 중거트 또는 힌구트 영역, 관심 영역의 형광 강도(ROI)를 측정하였다. 상이한 실험군의 상대적 강도를 비교하기 위해, 우리는 이전 섹션에서 설명한 것과 동일한 정량적 공초점 현미경 방법을 채택하였다. 형광 강도의 비교를 위해, 매개변수는 음의 처리되지 않은 대조군을 사용하여 설정하였다. 처리되지 않은 제어의 교정 강도에 기초하여 신호 강도의 계산은 다른 실험 그룹 간의 직접적인 비교를 허용했다. 도 7은 상이한 농도에서 ZnO NPs에 노출된3rd instar 애벌레 장에서 DHE 신호의 평균 강도를 나타낸다. ZnO NP 치료의 0.5 mg/mL로 처리된 유충의 장은 가장 높은 형광 강도를 보였다.

모든 실험군 간의 상대적 강도의 차이를 더 표로 정리하고, 통계 분석을 수행하여 정성적 및 정량적 결과를 모두 제공하였다(그림8).

Figure 1
그림 1: ZnO NPs의 독성 연구에 사용되는 방법의 개요. 시험관내 작업의 경우, ZnO NP-처리 된 세포는 유세포 분석 전에 염색하였다. 생체 내 작업의 경우, 장은 3rd instar 애벌레에서 해부되었고, DHE 염료 및 이미지 획득으로 염색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: FITC 및 PE 염색에 따라 다른 집단으로 분리된 세포의 도트 플롯. 그림은 MRC-5에 ZnO-NPs의 24 시간 처리와 FITC/별관 V 분석의 결과를 보여줍니다. 다른 단계에서 세포의 통계 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: ZnO NP 함유 플라이 푸드 배지의 제조. (a)플라이 푸드용 성분을 물에 첨가하고, 팽창시키고, 5분간 끓인 후(B)교반을 통해 50°C로 식힌 후, 니파진을 넣고 철저히 혼합하였다. (C)나노 입자에 대한 마스터 믹스를 준비합니다 (총 부피는 최종 식품 부피의 10 %를 초과하지 않음). (D)배지는 다양한 농도에서 ZnO NPs와 혼합한 다음 aliquoted로 저장하기 전에 완전히 식힙니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 전체 창자 해부 절차. (A)해부 디스크에 3rd instar 애벌레를 전송합니다. (B)포셉을 사용하여 애벌레를 부드럽게 잡고(C)식염수를 사용하여 음식의 잔재를 씻어 냅니다. (D)장과 다른 내부 장기를 만지지 않고 표피를 부드럽게 찢어냅니다. (E)후속 시술을 위해 용기를 식염수에 넣습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 소화관/장의 해부학. Drosophila 유충에서 추출된 창자는 다른 발달 기원의 3개의 개별적인 도메인, 즉 포게트, midgut 및 힌구트로 나뉩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: DHE로 장 조직의 염색. (a)성장 배지 및 DHE(최종 농도 30 μM)를 함유하는 마스터 믹스를 준비한다. (B)마스터 믹스를 해부 디스크의 웰에 추가합니다. (C)DHE 마스터 믹스를 함유하는 웰내로 해부된 장 조직을 옮김을 옮니다. (D)RT에서 5 분 동안 인큐베이션하고 빛으로부터 조직을 보호하십시오. 5 분 동안 PBS / 식염수에서 3 x 씻어 .(E)10 분 동안 4 % PF로 수정하십시오. PBS (선택 사항)로 조직을 세 번 씻으하십시오. (F)용기를 유리 슬라이드에 부드럽게 옮기고, 조직을 접지 않고 평평하게 놓고 커버 유리로 덮기 전에 마운팅 매체로 장착하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7

도 7: ZnO NPs는 초파리 애벌레의 장에서 ROS를 유도한다. (a)제어 용기의 DHE 얼룩은 ROS의 기저 수준을 나타낸다. (b 및 c)처리된 장세포는 투여량 의존적 방식으로 DHE 강도의 점진적인 증가를 보여준다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: ImageJ를 사용하는 형광 이미지의 양량. (A)캡처한 이미지를 가져옵니다. (B) 분석 메뉴를 클릭하고 측정 설정 설정을 선택합니다. (C)영역 통합 강도 및 평균 회색 값을 선택합니다. 형광이 없는 영역을 선택하여 배경을 설정합니다. (D)데이터를 Excel로 내보내고 후속 통계 분석을 위해 CTCF를 계산합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

ZnO NP가 MRC5 섬유아세포에서 세포사멸을 유도할 수 있는지 평가하기 위해, 우리는 유동 세포분석기를 사용하여 세포를 괴사 세포 또는 세포사멸과 구별합니다. 일반적인 살아있는 세포에서는, 포스파티딜세린 (PS)는 세포막에서 국한됩니다. 세포자멸이 발생하는 경우, PS는 혈장막의 세포외 리플렛으로 옮겨져, 플루오레세인(FITC Annexin V)으로 표지된 아넥신 V의 결합을허용한다(FITCAnnexin V) 29. 한편, 적형프로피듐(PI)은 핵산 결합 염료로, 살아있는 세포및 세포사멸세포에 불투과성이지만 죽은세포(30)를염색한다. 이를 통해 우리는 죽은 세포 (적색 및 녹색), 세포 사멸 세포 (녹색 형광) 및 살아있는 세포 (거의 또는 전혀 형광)를 식별 할 수 있으며, 여기를 위한 아르곤 이온 레이저의 488 nm 라인을 가진 유세포계를 사용합니다.

Drosophila 창자의 DHE 염색을 위해, 장기간 저장하면 염료를 어둡고 보라색 으로 변하는 염료의 자동 산화로 이어질 수 있으므로 실험을 시작하기 직전에 DMSO로 염료를 재구성하는 것이 중요합니다31, 32. 또한, 재구성 된 주식 솔루션은 다소 빨리 만료되는 경향이 있으므로 "만료 날짜"에주의를 기울여야합니다. 양자택일로, 얼룩으로 다중화될 수 있는 추가 능력을 가지고 있고, DHE 보다는 훨씬 더 명확한 신호를 생성하는 광안정 탐사기의 녹색 버전과 같은 형광성 프로브는, 사용될 수 있었습니다. 해부된 장은 고착을 첨가하지 않고 원하는 농도로 염료를 함유하는 슈나이더배지로 옮겨졌다. 이것은 살아있는 세포에 염료의 혼입을 허용하기 위한 것이며, 따라서 염색은 배양 배지에서 수행되어, 세포의 더 나은 호흡을 허용한다.

DHE 염색의 정량에 관해서는, 시작을 위해, 처리되지 않은 세포를 대조군으로 픽셀의 포화를 피하십시오. 이미징 소프트웨어 프로그램은 포화 픽셀을 시각적으로 플래그로 노출 시간을 결정하는 데 사용되었습니다. 처리되지 않은 샘플은 나중에 형광 이미지 강도의 정량화에 중요한 상이한 치료 군에서 강도의 비교를 위해 이미지를 캡처할 때 노출 시간을 설정하고 동일한 파라미터를 유지하는 데 사용되었다. 동일한 시스템 및 수집 설정/매개 변수를 사용하여 모든 이미지(제어 및 처리된 샘플)를 획득하는 것이 필수적이며, 배경은 모든 이미지에 대해 표준화되어야 합니다(배경 빼기의 일관성이 있음)33.

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Disclosures

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

이 연구는 보조금 번호 R706-000-043-490에 의해 지원되었다. 이 연구는 보조금 스폰서의 견해를 나타내지 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15% Methyl 4-Hydroxybenzoate Sigma Aldrich
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Bacto Agar BD biosciences
cncCK6/TM3, Sb a gift from Dr. Kerppola T
Cornmeal, glucose, yeast brewer Sigma Aldrich
CyAn ADP with Summit Software DAKO https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine) Thermo Fisher Scientific D11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD biosciences 556547
Fluorescent microscope Olympus
Glucolin Supermarket
ImageJ software NIH
MRC5 human lung fibroblast ATCC CCL-171
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fisher Scientific 21720-024
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO NIG-FLY
Zinc Oxide Nanoparticles Sigma Aldrich 721077 Refer Sheet 2

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면역학 및 감염 문제 151 산화 아연 나노 입자 독성 세포 사멸 산화 스트레스 MRC5 세포 초파리
세포 배양 및 <em>초파리 멜라노가스터에서</em> 산화 아연 나노 입자의 독성 연구
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Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E.,… More

Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E., Bay, B. H., Baeg, G. H. Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e59510, doi:10.3791/59510 (2019).

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