Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء فحوصات لوسيفيراز سريعة منخفضة التكلفة في متوسطة الإنتاجية باستخدام غوسيا لوسيفيراز المرتبطة بالأنسولين كوكيل لإفراز الأنسولين من خلايا بيتا. يمكن إجراء الفحص مع معظم قارئات لوحة الانارة والماصات متعددة القنوات.
Abstract
إجراء الفحوصات المستندة إلى الأجسام المضادة لجمع الأنسولين المفرزة بعد العينة عادة ما يتطلب بضع ساعات إلى يوم من وقت الفحص ويمكن أن تكون مكلفة، اعتمادا على الفحص المحدد. فحوصات لوسيفيراز المفرزة تعجل النتائج وتخفض تكلفة التذوق لكل عينة بشكل كبير. هنا نقدم نهج غير المستخدمة نسبيا لقياس النشاط إفراز الأنسولين من خلايا البنكرياس بيتا باستخدام غوسيا لوسيفيراز إدراجها وراثيا داخل الببتيد C. أثناء المعالجة بروتيوليك من بروسولين, يتم استئصال الببتيد C الإفراج عن لوسيفيراز داخل الحويصلات إفراز الأنسولين حيث يتم تفرزه مع الأنسولين. يمكن الحصول على النتائج في غضون دقائق بعد جمع عينة بسبب سرعة الاختبارات لوسيفيراز. وهناك قيد من المقاييس هو أنه هو قياس نسبي لإفراز الأنسولين وليس كمية مطلقة. ومع ذلك، هذا البروتوكول هو اقتصادي، قابلة للتحجيم، ويمكن تنفيذها باستخدام معظم قارئات لوحة الإضاءة القياسية. تسهل الماصات التناظرية والرقمية متعددة القنوات خطوات متعددة من القياس. العديد من الاختلافات التجريبية المختلفة يمكن اختبارها في وقت واحد. بمجرد أن يتم تحديد مجموعة مركزة من الشروط، ينبغي قياس تركيزات الأنسولين مباشرة باستخدام الاختبارات المستندة إلى الأجسام المضادة مع منحنيات قياسية لتأكيد نتائج اختبار لوسيفيراز.
Introduction
الطريقة المعروضة هنا يسمح إفراز الأنسولين من خط خلية بيتا المعدلة وراثيا أن يتم فحصها بسرعة وبأسعار معقولة في شكل 96 لوحة جيدا. المفتاح لهذا البروتوكول هو نسخة معدلة من الأنسولين مع لوسيفيراز غوسيا بطبيعة الحال (GLuc, ~ 18 كدا) إدراجها (انظر الشكل1) في C-الببتيد لتوليد الأنسولين-غاوسيا (InsGLuc)1,2. البروتينات الأخرى الكبيرة، مثل GFP (~25 kDa)، تم إدخالها بنجاح في الببتيد C من الأنسولين وعرضت المعالجة المتوقعة بعد الترجمة من proinsulin-GFP إلى الأنسولين وGFP-C-الببتيد3،4. للكشف عن الشبهات في هذا البروتوكول، وقد تم CoLuc الأمثل للتعبير الثدييات واثنين من الطفرات قد أدخلت لتعزيز الحركية مثل توهج5،6. يمكن بسهولة اختبار تركيبات متعددة وتكرار من ظروف العلاج في شكل 96 جيدا لوحة ويمكن الحصول على نتائج إفراز مباشرة بعد التجربة.
وهناك ميزة رئيسية، كمالوحظ سابقا 2، هو انخفاض تكلفة هذا القياس إفراز القائم على لوسيفيراز (< 0.01 دولار/جيد) الذي يميزه عن التكاليف الأعلى نسبيا والجوانب التقنية للاختبارات المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISAs) ( > $2/well) ومتجانسة الوقت حل فلوري (HTRF) أو غيرها من Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) الأجسام المضادة القائمة (> $1/well) الاختبارات. بالمقارنة مع هذه الاختبارات القائمة على الأجسام المضادة، والتي تقيس تركيز الأنسولين من خلال الرجوع إلى منحنى قياسي، يقيس اختبار InsGLuc النشاط الإفرازي كمقارنة نسبية للسيطرة على الآبار على اللوحة. ولهذا السبب، تتطلب كل تجربة إدراج ضوابط مناسبة. وهذا التمييز هو مقايضة تسمح بإجراء قياسات سريعة وغير مكلفة. ومع ذلك، تم إثبات إفراز InsGLuc أن تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا مع إفراز الأنسولين كما يقاس ELISA1،2. وقد تم توسيع نطاق هذه التكنولوجيا لفحص عالية الإنتاجية1،2،7 ، وأدى إلى تحديد المغيرات الجديدة لإفراز الأنسولين بما في ذلك مثبط قناة البوتاسيوم بوابة الجهد7 فضلا عن مثبط المنتج الطبيعي من وظيفة الخلية بيتا، الكرومومايوسين A28. استخدام InsGLuc هو الأكثر ملاءمة للباحثين الذين يخططون لاختبار باستمرار العديد من ظروف العلاج المختلفة لتأثيرها على إفراز الأنسولين. في تجارب المتابعة من الضروري تكرار النتائج الرئيسية في خط الخلية بيتا الأبوية، وعلى النحو الأمثل في المورين أو الجزر البشرية، وقياس إفراز الأنسولين باستخدام فحص الأجسام المضادة القائمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 - إعداد الكواشف والوسائط والمخازن المؤقتة (الجدول 1)
- إعداد الوسائط الكاملة MIN6 في 500 مل من ارتفاع الجلوكوز (4.5 غرام / لتر) دولبيككو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) مع الإضافات التالية: 15٪ مصل جنين يوفي (FBS)، 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستريبتوميسين، 292 ميكروغرام / مل L-الجلوتامين، و 50 ميكروM (الـ(ميركابتوثانول
ملاحظة: يتم الحفاظ على خط الخلايا مستقرة في هذه الحالة في 250 ميكروغرام / مل من المضادات الحيوية G418. - إعداد كريبس- رينجر بيكربونات العازلة (KRBH) عن طريق جعل حل يحتوي على 5 m KCl، 120 m كلوريد الصوديوم،15 m HEPES (ح 7.4)، 24 م NAHCO 3، 1 mM MgCl2،2 mM CaCl2، و 1 ملغ / مل راديوي المناعة الصف الزلال المصل (BSA). الجلوكوز يضاف حيث ما هو محدد من 2 M الأسهم.
ملاحظة: يتم استخدام KRBH لحضن الخلايا مع وبدون التحفيز من أجل تقييم الأنسولين و / أو إفراز لوسيفيراز غاوسيا. - إعداد حل coelenterazine (CTZ) الأسهم على النحو التالي. إعداد الميثانول الحمضي بإضافة 106 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز إلى 10 مل من الميثانول. بعد ذلك، حل CTZ lyophilized في الميثانول الحمضية في 1 ملغ / مل وتخزينها في -80 درجة مئوية في أنابيب المسمار كاب.
ملاحظة: تحتفظ هذه المخزونات بنشاط كاف ٍ في الاختبارات الروتينية للفحص لوسيفيراز، حتى بعد سنة واحدة من التخزين المناسب. - إعداد غاوسيا لوسيفيراز (GLuc) مخزن الكبح على أساس الأدب9 وكذلك معلومات براءات الاختراع10 للمساعدة في نصف عمر من كاسياس لوسيفيراز غاوسيا في 96 شكل لوحة بئر. استخدام الصيغة: 25 m تريس pH 8, 1 mm EDTA, 5% الجلسرين, 1 ملغ / مل Na2PO4,300 mm أسكوربات الصوديوم, 200 mNa2SO3 في الماء. تجميد المخزونات عند -20 درجة مئوية. بعد الذوبان، قم بتخزين المخزن المؤقت عند 4 درجة مئوية.
- لإعداد حل العمل غاوسيا لوسيفيراز، إضافة 4.2 μL /مل من 1 ملغ / مل (2.36 mM) حل المخزون CTZ إلى العازلة الكبح GLuc. وهذا يؤدي إلى حل عمل 2X من 10 ميكرومتر CTZ التي سيكون لها تركيز نهائي 5 ميكرومتر في الاختبارات.
2. ثقافة الخلايا INSGLuc MIN6 والبذر لفحوصات إفراز
- لزراعة الخلايا MIN6، trypsinize والبذور الخلايا مرة واحدة في الأسبوع باستخدام تقنيات الثقافة الخلايا القياسية. تغيير الوسائط على الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام. تضمين المضادات الحيوية اختيار المناسبة، مثل 250 ميكروغرام / مل من G418 في وسائل الإعلام.
- لتوفير عدد كاف من الخلايا أسبوعيا للتجارب، والحفاظ على الخلايا في قوارير T75. البذور 6 X 106 خلايا في T75 في 10 مل من وسائل الإعلام عادة ما تسفر عن 30 X 106 إلى 40 X 106 خلايا المجموع لكل T75 بعد 7 أيام من الثقافة.
- لإعداد الخلايا للتصفيح في لوحات 96 جيدا، وغسل T75 confluent من InsGLuc الخلايا MIN6 مرتين مع PBS وإضافة 2 مل من التربسين. يُحتجّ عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تقريبًا أو حتى تُنفصل الخلايا عن القارورة. تحديد تركيز الخلية لكل ملليلتر.
- تمييع الخلايا في وسائط كاملة إلى 1 × 106 خلايا / مل لينتج عن 1 × 105 خلايا في 100 ميكرولتر لكل بئر في لوحة 96 جيدا. يجب أن تكون الخلايا مُتَقَدَّة ً كافية للإجراء بعد 3-4 أيام.
ملاحظة: لتمديد فترة الثقافة، يمكن أن يكون نصف تركيز الخلية مطلي. لا يلزم إجراء تغييرات في وسائل الإعلام قبل يوم الاختبار ما لم تخضع الخلايا لعلاجات تجريبية.
- تمييع الخلايا في وسائط كاملة إلى 1 × 106 خلايا / مل لينتج عن 1 × 105 خلايا في 100 ميكرولتر لكل بئر في لوحة 96 جيدا. يجب أن تكون الخلايا مُتَقَدَّة ً كافية للإجراء بعد 3-4 أيام.
3. الجلوكوز حفز الشاشي لوسيفيراز إفراز فحص
- في يوم الاختبار إعداد ما يكفي KRBH للتجربة (الخطوة 1.2). ويلزم بحد أدنى 50 مل من KRBH لكل لوحة 96 بئر، وبالتالي إعداد ما لا يقل عن 75 مل لضمان وجود مخزن مؤقت كاف للتجربة. إعداد العازلة إضافية إذا تركيبات مختلفة من حالات العلاج من المخدرات سوف تتطلب KRBH لتخفيف.
- إعداد خزان مع KRBH خالية من الجلوكوز. انزع العلبة المتوسطة من لوحة (صات) 96 جيدا عن طريق عكس بسرعة لوحة على بالوعة مختبر ثم وصمة عار بحزم على كومة من المناشف الورقية لإزالة المتوسطة الزائدة.
- باستخدام إما ماصة إلكترونية أو يدوية من 8 قنوات، ماصة 100 ميكرولتر /جيداKRBH من الخزان عبر لوحة (صات) 96 بئر. كرر ما مجموعه اثنين من البواز.
- (خطوة اختيارية من العلاجات المركبة الحادة) إذا لم يتم إجراء العلاجات الدوائية، انتقل مع الخطوتين 3.5 و 3.6 دون تعديل. لاختبار آثار الجزيئات الصغيرة على إفراز الأنسولين، يمكن إضافة المركبات إلى الخلايا خلال فترة الحضانة، فترة التحفيز، أو كليهما.
- إحدى التقنيات هي إضافة مركبات دفعة إلى KRBH في أنابيب 1.5 مل واستخدام ماصة رقمية 8 قنوات قابلة للتعديل لنقل المخدرات-KRBH من الأنابيب إلى الخلايا في لوحات 96 بئر.
ملاحظة: إذا لم تتوفر ماصة قابلة للتعديل، يمكن إجراء طبق طبق من 96 بئر من عقار-KRBH ويمكن استخدام ماصة قياسية من 8 قنوات لنقل المخزن المؤقت. ويمكن إجراء تعديلات أخرى على نموذج العلاج لعلاج الخلايا لمدة 24 ح في وسائل الإعلام قبل الفحص، كما سبق وصفه1،8.
- إحدى التقنيات هي إضافة مركبات دفعة إلى KRBH في أنابيب 1.5 مل واستخدام ماصة رقمية 8 قنوات قابلة للتعديل لنقل المخدرات-KRBH من الأنابيب إلى الخلايا في لوحات 96 بئر.
- أضف 100 ميكرولتر من KRBH تحتوي على التركيز المطلوب من الجلوكوز أو المركبات ووضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
ملاحظة: اعتمادا ً على التخطيط التجريبي، من المفيد للغاية أن يكون لديك ماصة إلكترونية متعددة القنوات تسمح بانتقال مسافات القناة من عمود من ثمانية أنابيب 1.5 مل إلى الصفوف 8 من لوحة 96 بئر. - بعد 1 ساعة من preincubation، decant العازلة في الحوض وصمة عار بحزم على منشفة ورقية. أضف 100 لتر من KRBH خالية من الجلوكوز في البئر لغسل الخلفية المتراكمة من لوسيفيراز غوسيا. قم بإزالة اللوحة مرة أخرى وأضف التحكم والظروف المحفزة إلى اللوحة بمعدل 100 ميكرولتر لكل بئر. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
- قم بتحصيل 50 ميكرولتر من الماصة باستخدام ماصة متعددة القنوات، وتغيير النصائح بين ظروف العلاج حسب الضرورة، ونقل الـ supernatant إلى طبق فحص أبيض غير شفاف نظيف 96- بئر.
ملاحظة: يمكن استخدام لوحات بيضاء الجدران واضحة القاع إذا لزم الأمر، على الرغم من أن كمية كبيرة من إشارة لوسيفيراز سوف تضيع. - بعد جمع 50 ميكرولتر من KRBH supernatant، يمكن فحص العينة على الفور. إذا لزم الأمر، وختم وتخزين عينات في 4 درجة مئوية لبضعة أيام (GLuc النشاط نصف العمر ~ 6 أيام) أو -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد11،12.
4. فرزها كاسيا لوسيفيراز
- لإعداد حل عمل سعر التسوية GLuc، ماصة الكمية المطلوبة من محلول مخزون CTZ (4.2 ميكرولتر/مل) في مخزن حصر GLuc المؤقت. لمنع ارتفاع درجة حرارة CTZ، ماصة CTZ بسرعة في -80 درجة مئوية الفريزر أو إبقاء الأنبوب على الجليد الجاف.
- باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات، قم بسرعة بإضافة 50 ميكرولتر من محلول GLuc للتسوية في البئر عبر طبق 96 جيداً الذي يحتوي على النانانات KRBH المجمعة. إذا كان هناك أي قطرات على جانبي أي آبار، تدور لفترة وجيزة لوحة في طاولة أعلى سوينغ دلو الطرد المركزي.
- قراءة الإضاءة في قارئ لوحة مناسبة في غضون بضع دقائق وقراءة كل بئر مع 0.1 ق وقت التكامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقياس أداء الفحص تحت ظروف التحكم، يمكن الانتهاء من منحنى جرعة استجابة الجلوكوز بسيطة أو التحفيز باستخدام نموذج ديازوكسيد. في حالة الأولى، قبل الاحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في ظروف خالية من الجلوكوز تليها علاج ل1 ح مع زيادة تركيزات الجلوكوز ينبغي أن يؤدي إلى نشاط إفرازي قليلة جدا في وأقل من 5 mM، في حين لوحظ تفرز زيادة أعلاه 8 الغلوكوز mm (الشكل 2). التحفيز مع 35 m KCl كما بمثابة السيطرة الإيجابية لإفراز حفز. يجب أن يعطي إدراج الأدوية التي تعدل إفراز خلال فترة التحفيز تثبيط المتوقع أو التعزيز من نشاط GLuc المفرزة (الشكل 3). على سبيل المثال، diazoxide يربط قناةATP K ويمنعها من إغلاق على زيادة [ATP / ADP] نسبة، ومنع إزالة الاستقطاب غشاء ومنع إفراز13. استرات فوربول مثل بارا-ميثوكسي امفيتامين (PMA) تنشيط البروتين كيناز C (PKC) ومكبرات الصوت المعروفة من إفراز الأنسولين14. وأخيرا، التحفيز مع 1 μM ادرينالين ينشط α2A-مستقبلات الأدرينالية التي بدورها تنشيط غير متجانسة G-البروتين مجمع جي، تثبيط الغشاء depolarization وإفراز الأنسولين15. من المهم أن ندرك أنه في حين أن الخلايا MIN6 هي خط خلية خالدة، فإنها تبدأ في فقدان الاستجابات المناسبة إفراز الأنسولين الناجم عن الجلوكوز (مثل التحول الأيسر من منحنى الاستجابة) بعد تمرير الموسعة16. لهذا السبب، فمن الممارسات الجيدة لزراعة بشكل روتيني جميع خطوط الخلية MIN6 لمدة تصل إلى ثمانية أسابيع (تقسيم مرة واحدة في الأسبوع) قبل البدء من جديد من أرصدة النيتروجين السائل.
الشكل 1: وصف مراسل إنسجلوك. (أ) أولاً، تم إنشاء خط خلية بيتا مستقرة (في هذه الحالة الخلايا MIN6) التعبير عن الأنسولين-غوسيا ترانسجين من الفئران الأنسولين المروج. (ب) يتم تصنيع البروتين الكامل وتعبئته في حبيبات الأنسولين جنبا إلى جنب مع الأنسولين الذاتية. بروهورموني تحويلي ّة تشقق الببتيد, المشار إليها بالعلامات النجمية. (ج) الأنسولين المعالج وغاوسيا هي تفرز والكشف عن نشاط لوسيفيراز بإضافة CTZ في رد فعل ATP مستقلة، تعتمد على الأكسجين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مراسل InsGLuc هو وكيل مخلص لإفراز الأنسولين من خلايا بيتا MIN6. (أ) استجابة لخلايا MIN6 InsGLuc لزيادة تركيزات الجلوكوز وKCl (35 mM) مع إفراز لوسيفيراز غوسيا. البيانات هي متوسط أضعاف لوسيفيراز النشاط ± SE مقارنة مع 0 m ظروف الجلوكوز لثلاث تجارب مستقلة. *، P < 0.05. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Kalwat وآخرون ACS أجهزة الاستشعار 20161. © 2016 الجمعية الكيميائية الأمريكية. (ب) مراسل InsGLuc في الخلايا MIN6 يعرض الاستجابة الإفرازية المتوقعة لنموذج الديازوكسيد (Dz) حيث 250 μM Dz العلاج يحمل قناة كATP مفتوحة، ومنع إزالة الاستقطاب غشاء ما لم يتم توفير KCl خارج الخلية (35 mM) لإثارة تدفق الكالسيوم "التسبب". إضافة أخرى من الجلوكوز (20 m) تحت Dz + KCl حالة يكشف تضخيم التمثيل الغذائي للإفراز الذي يحدث دون زيادة أخرى في تدفق الكالسيوم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إدراج مركبات تحوير الإفراز اتجب ة بإفراز انسجل. وكانت الخلايا INSGLuc MIN6 مطلية في شكل 96 جيدا كما هو موضح مسبقا في KRBH خالية من الجلوكوز لمدة 1 ح. ثم عولجت الخلايا مع أو بدون 20 مل الجلوكوز في وجود ثنائي ميثيل السلفية (DMSO) (0.1٪)، KCl (35 mM)، ديازوكسيد (250 ميكرومتر)، PMA (100 طن)، أو الإبينفرين (1 μM) لمدة 1 ح. الرسم البياني بار تمثل متوسط ± SE من 3 تجارب مستقلة على الأقل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| كريبس- رينجر بيكربونات العازلة (KRBH) | |||
| محلول أو مسحوق | الاسهم | التركيز النهائي | 100 مل |
| KCl | 0.25 م | 5 مليون متر مربع | 2 مل |
| كلوريد الصوديوم | 4 م | 120 مليون متر مربع | 3 مل |
| Hepes, pH 7.4 | 1 م | 15 مليون متر مربع | 1.5 مل |
| نامكو3 | 0.5 مليون | 24 مليون متر مربع | 4.8 مل |
| مكلور 2 | 1 م | 1 مليون متر مربع | 0.1 مل |
| الكاكل2 | 1 م | 2 مليون متر مربع | 0.2 مل |
| المياه | H2o | 88.4 مل | |
| الوكالة الدولية للإدارة | مسحوق | 1 ملغ/مل | 100 مجم |
| جعل الطازجة في يوم من التجربة. | |||
| غاوسيا المخازن المؤقتة* | |||
| محلول أو مسحوق | الاسهم | التركيز النهائي | 50 مل |
| فوسفات الصوديوم | مسحوق | 0.1٪ (1 ملغ / مل) | 50 ملغ |
| الجلسرين | 40 في المائة | 5 في المائة | 6.25 مل |
| بروميد الصوديوم | مسحوق | 150 مليون متر مربع | 772 ملغ |
| EDTA pH 8 | 0.5مليون دولار أمريكي | 1 مليون متر مربع | 100 μL |
| تريس-هيدروكلورايد pH 8 | 1 مليون دولار | 25 مليون متر مربع | 1.25 مل |
| حمض الأسكوربيك* | مسحوق | 300 مليون متر مربع | 2.64 غ |
| Na2SO3** | مسحوق | 200 مليون متر مربع | 1.26 غ |
| المياه | حتى 50 مل | ||
| يُخزن في الحصص الأليّة عند -20 درجة مئوية، ويُذوّب واحدًا في كل مرة ويُحفظ عند 4 درجة مئوية. | |||
| * تعديل وصفة من لوفت وآخرون. | |||
| مُحَسَلّة | |||
| محلول أو مسحوق | الاسهم | التركيز النهائي | 10 مل |
| الميثانول | 100 في المائة | 10 مل | |
| Hcl | 11.65 م | 1.06% | 0.106 مل |
| حل الكالتينرازين | |||
| محلول أو مسحوق | الاسهم | التركيز النهائي | 1 مل |
| كويلينتيرازين | مسحوق | 1 ملغ/مل (2.36 ملمتر) | 1 ملغ |
| الميثانول الحمضي | 1 مل | ||
| 4.2 μL من المخزون لكل 1 مل من Gaussia الاختبارات العازلة النتائج في 10 ميكرومتر CTZ لاستخدامها كحل العمل 2X. | |||
| على سبيل المثال، إضافة 50 μL من 2X حل العمل إلى 50 μL من عينة KRBH تحتوي على Gaussia مفرزة. | |||
الجدول 1: وصفات حل المخازن المخزنة والمخزون المستخدمة لإجراء الاختبارات المقدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقدم هنا طريقة لتقييم استجابات إفراز الأنسولين المحفز للجلوكوز بسرعة من خلايا MIN6 β. للحصول على أفضل الردود في القياس من المهم أن البذور الخلايا MIN6 في الكثافة المناسبة والسماح لهم أن تصبح 85-95% confluent. وهذا يحسن الاستجابات الخلية β للجلوكوز بسبب تحسن اتصالات الخلية الخلوية والتزامن، والذي يحدث على حد سواء في الجزر الأولية17،18،19،20،21 وكذلك MIN6 الخلايا16،18. لمنع الخسائر في استجابة إفرازية لتحفيز الجلوكوز، من المهم للحفاظ على الخلايا في أدنى من مرور ممكن والثقافة الخلايا لمدة 6-8 أسابيع فقط قبل ذوبان قارورة جديدة من مخزونات النيتروجين السائل. ويمكن إجراء تعديلات على استراتيجية الطلاء في القسم 2 بروتوكول للتكيف مع المعدات المتاحة حسب الضرورة. تصفيح الخلايا INSGLuc MIN6 في لوحات 96 جيدا لفحوصات إفراز يوفر عددا كبيرا من الآبار للتلاعب التجريبي (بما في ذلك تكرار) وكذلك الحفاظ على دقة الطلاء في بيئة مختبر العادي، والطلاء في الأطباق مع ارتفاع جيدا وغالبا ما تتطلب الأرقام معدات خاصة متاحة عادة في النوى عالية الإنتاجية الفرز.
وتشمل الاختبارات الحالية لإفراز الأنسولين، بخلاف الفحص غير المباشر لللوسيفيراز الموصوف هنا: ELISAs التي تستخدم المقروءة الملونة (الفحص المباشر)، واختبارات المناعة الراديوية (الفحص المنافس) التي تستخدم التلاوات المشعة، والأجسام المضادة القائمة على FRET اختبار المنافسة22 و HTRF23 الذي يستخدم FRET بين الأجسام المضادة المرتبطة بالصبغة لقياس الأنسولين مباشرة، والحمض النووي aptamers24. كل من هذه الأساليب لها مزاياها الخاصة، ولكن بشكل عام فهي أكثر تكلفة و/أو تستغرق وقتا طويلا من تقييم لوسيفيراز. أحد القيود الرئيسية للكشف عن InsGLuc هو حقيقة أن النشاط الانارة من لوسيفيراز الإفراز اتمنى هو مجرد وكيل لإفراز الأنسولين الفعلي. بالإضافة إلى ذلك، لا يوجد فرق متوقع في نشاط لوسيفيراز بين غاوسيا مع شظايا من الببتيد C على N- و C-تيرميني أو غاوسيا داخل بروتين البروسولين، كما تم استخدام بنجاح غاوسيا لوسيفيراز كعلامة لقياس إفراز البروتينات الأخرى25. وهذا يسلط الضوء على شرط دراسات التأكيد باستخدام الاختبارات التي تقيس الأنسولين المجهزة على وجه التحديد. ويمكن أيضا أن تستخدم بدائل للقياسات المباشرة وغير المباشرة لإفراز الأنسولين لتقييم وظيفة الخلية بيتا. توجد مجموعة متنوعة من المراسلين البصرية للقراءة بما في ذلك ATP: نسبة ADP، وتدفق الكالسيوم، NAD+/ NADH نسبة، خارج الخلوية إشارة تنظيم كيناز (ERK) تفعيل، أو دوري الأدينوسين أحادي الفوسفات (cAMP) مستويات26.
ويبدو أن التطبيقات المستقبلية لـ InsGLuc على وجه الخصوص في الفحص عالي الإنتاجية. وقد تم استخدام هذا التقييم بالفعل في حفنة من الشاشات الصغيرة المنشورة1,2 وشاشات أكبر غير منشورة إما الانتهاء7 أو جارية. قد ينطوي تطوير التكرارات الأخرى لهذه التكنولوجيا على وضع علامات على هرمونات أخرى من البُسر المفرزة مع لوسيفيراز لتسهيل القياسات السريعة، مثل الجلوكاجون أو السوماتوستاتين. ويمكن إجراء تعديلات في أي حال حيث يتم إعادة إنشاء خط الخلية باستخدام نهج بديلة بما في ذلك CRISPR/Cas9، أو فيروس lentivirus، أو الإدراج بوساطة transposase في أي خط خلية بيتا مناسب. قد تشمل التعديلات المحتملة الإضافية على المراسل الأصلي استبدال لوسيفيراز البديل المفرزة لغوسيا أو الجمع بين العديد من luciferases يفرز مختلفة مرتبطة بهرمونات مختلفة لفحص متعدد الإرسال. وراء ثقافة الخلية، تقدم تكنولوجيا CRISPR/Cas9 إمكانية توليد نموذج الماوس حيث يتم طرقت لوسيفيراز مناسبة في لمنطقة الترميز C-الببتيد من Ins2 في الجينوم. مثل هذا الفأر سيكون ممكنا بالنظر إلى أن الفئران المعدلة وراثيا قد تم إنشاؤها مع GFP طرقت في لنفس موقع C-الببتيد27، وسوف تسمح بقياس وظيفة الخلية بيتا الذاتية مع قياس لوسيفيراز في الجسم الحي أو الحي السابق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويشكر المؤلفون جميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر كوب على العمل والمناقشات القيمة، وديون وير على المساعدة الإدارية. مايكل كالوات مدعوم من مؤسسة أبحاث مرض السكري للأحداث SRA-2019-702-Q-R. وقد أصبح هذا العمل ممكنا من خلال المعاهد القومية للصحة R37 DK34128 ومؤسسة ويلش منحة I1243 إلى ميلاني كوب. كما تم دعم الأجزاء الأولى من هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة FK100113 لمايكل كالوات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
- Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
- Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. , WO2018175324A1 (2018).
- Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
- Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
- Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
- Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
- Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
- Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
- Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
- Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
- Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
- Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
- Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
- Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
- Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
