Summary
In dit protocol wordt beschreven hoe u snelle Low-cost Luciferase-analyses uitvoeren bij medium-throughput met behulp van een insuline-linked Gaussia Luciferase als proxy voor insuline secretie van beta-cellen. De assay kan uitgevoerd worden met de meeste luminescentie plaat lezers en multichannel pipetten.
Abstract
Het uitvoeren van antilichaam-gebaseerde analyses voor afgescheiden insuline post-sample collectie vereist meestal een paar uur tot een dag van de assay tijd en kan duur zijn, afhankelijk van de specifieke assay. De afgescheiden Luciferase analyses versnellen resultaten en verminderen wezenlijk de analyse kosten per steekproef. Hier presenteren we een relatief onderbenut benadering van insuline secretoire activiteit van de pancreas β cellen meten met behulp van Gaussia Luciferase genetisch ingevoegd binnen de C-peptide. Tijdens Proteolytische verwerking van proinsuline, het C-peptide is het vrijgeven van de Luciferase binnen de insuline secretoire blaasje waar het wordt co-afgescheiden met insuline. De resultaten kunnen binnen minuten na steekproef inzameling wegens de snelheid van Luciferase analyses worden verkregen. Een beperking van de assay is dat het een relatieve meting van de insuline secretie en niet een absolute kwantificatie. Echter, dit protocol is zuinig, schaalbaar, en kan worden uitgevoerd met behulp van de meeste standaard luminescentie plaat lezers. Analoge en digitale MultiChannel pipetten vergemakkelijken meerdere stappen van de assay. Veel verschillende experimentele variaties kunnen gelijktijdig worden getest. Zodra een geconcentreerde reeks voorwaarden wordt beslist op, zouden de insuline concentraties direct moeten worden gemeten gebruikend op antilichaam-gebaseerde analyses met standaard krommen om de Luciferase testresultaten te bevestigen.
Introduction
De hier gepresenteerde methode maakt insuline secretie van een genetisch gemodificeerde Beta Cell line te worden getest snel en betaalbaar in 96-well-plate formaat. De sleutel tot dit protocol is een gewijzigde versie van insuline met de natuurlijk-afgescheiden Gaussia Luciferase (GLuc, ~ 18 kDa) ingevoegd ( Zie figuur 1) in het C-peptide te genereren insuline-Gaussia (InsGLuc)1,2. Andere grotere proteïnen, zoals GFP (~ 25 kDa), zijn met succes opgenomen in C-peptide van insuline en tentoongesteld de verwachte post-translationele verwerking van proinsuline-GFP aan insuline en GFP-C-peptide3,4. Voor de bepaling in dit protocol, GLuc is codon-geoptimaliseerd voor zoogdier expressie en twee mutaties zijn ingevoerd om te verbeteren Glow-like kinetica5,6. Meerdere combinaties en replicatie van de behandeling voorwaarden kunnen gemakkelijk worden getest in 96-goed-plaat formaat en de secretie resultaten kunnen onmiddellijk na het experiment worden verkregen.
Een groot voordeel, zoals eerder opgemerkt2, is de lage kosten van deze Luciferase-based secretie meting (< $0.01/well), die onderscheidt het van de relatief hogere kosten en technische aspecten van enzym-gebonden immunosorbent assays (Elisa) ( > $2/well) en homogene tijd-opgeloste fluorescentie (HTRF) of andere Förster resonantie energieoverdracht (FRET)-gebaseerd antilichaam (> $1/well) assays. In vergelijking met deze antilichaam-gebaseerde analyses, die de concentratie van insuline meten door naar een standaardkromme te verwijzen, meet de InsGLuc analyse secretoire activiteit als relatieve vergelijking aan controleputten op de plaat. Om die reden, elk experiment vereist de opneming van de juiste controles. Dit onderscheid is een trade-off om snelle en goedkope metingen mogelijk te maken. Echter, InsGLuc secretie is aangetoond dat sterk gecorreleerd met insuline secretie zoals gemeten door Elisa1,2. Deze technologie is opgeschaald voor high-throughput screening1,2,7 en heeft geleid tot de identificatie van nieuwe modulatoren van insuline secretie met inbegrip van een voltage-gated kaliumkanaal remmer7 evenals een natuurlijke product Inhibitor van β cel functie, Chromomycin a28. Het gebruik van InsGLuc is het meest geschikt voor onderzoekers die van plan zijn om voortdurend te testen veel verschillende behandelingsvoorwaarden voor hun impact op insuline secretie. In vervolgexperimenten is het noodzakelijk om zeer belangrijke bevindingen in een ouderlijke β cel lijn, en optimaal in muizen of menselijke eilandjes te herhalen, en insulineafscheiding te meten gebruikend een op antilichaam-gebaseerde analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van reagentia, media en buffers (tabel 1)
- Bereid MIN6 complete media in 500 mL van hoge-glucose (4,5 g/L) Dulbecco gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met de volgende additieven: 15% foetale boviene serum (FBS), 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 292 μg/mL L-glutamine, en 50 μM β-mercaptoethanol.
Nota: de stabiele cel lijn in dit geval wordt gehandhaafd in 250 µ g/mL van G418 antibioticum. - Bereid Krebs-ring bicarbonaat buffer (KRBH) voor door een oplossing te maken met 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO3, 1 mm MgCl2, 2 mm CaCl2, en 1 mg/ml radioimmuunbepaling-grade boviene serum albumine (BSA). Glucose wordt toegevoegd wanneer gespecificeerd van een 2 M voorraad.
Opmerking: KRBH wordt gebruikt om de cellen te bebroeden met en zonder stimulatie om insuline en/of Gaussia Luciferase secretie te beoordelen. - Bereid coelenterazine (CTZ) voorraad oplossing als volgt. Bereid aangezuurde methanol door toevoeging van 106 µ L van geconcentreerde HCl tot 10 mL methanol. Vervolgens los gelyofiliseerde CTZ in aangezuurde methanol op 1 mg/mL en op te slaan bij-80 ° c in schroef-Cap buizen.
Nota: deze voorraden behouden voldoende activiteit in routine Luciferase analyses, zelfs na 1 jaar van juiste opslag. - Bereid Gaussia Luciferase (GLuc) assay buffer op basis van de literatuur9 en octrooi-informatie10 tot steun in Half-Life van de Gaussia Luciferase assay in 96 goed plaat formaat. Gebruik de formule: 25 mM tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1 mg/mL na2po4, 300 mm natrium ascorbaat, 200 mm na2so3 in water. Bevriezen voorraden bij-20 °C. Bewaar de buffer na het ontdooien bij 4 °C.
- Ter voorbereiding van Gaussia Luciferase werkoplossing, Voeg 4,2 µ L/mL van de 1 mg/mL (2,36 mM) CTZ voorraad oplossing voor GLuc assay buffer. Dit resulteert in een 2x werkende oplossing van 10 µ M CTZ die een 5 µ M uiteindelijke concentratie in de analyse zal hebben.
2. cultuur van InsGLuc MIN6 cellen en zaaien voor secretie assays
- Aan cultuur MIN6 cellen, trypsinize en zaad de cellen eens per week gebruikend de standaard technieken van de cultuur van de cel. Verander de media op de cellen om de twee tot drie dagen. Neem de juiste selectie van antibiotica, zoals 250 µ g/mL G418 in de media.
- Om een voldoende aantal cellen wekelijks voor experimenten te verstrekken, handhaaf de cellen in T75 kolven. Zaaien 6 x 106 cellen per T75 in 10 ml van de media zal typisch rendement 30 x 106 tot 40 x 106 cellen in totaal per T75 na 7 dagen van de cultuur.
- Om cellen voor te bereiden voor plating in 96-goed platen, was een Confluent T75 van InsGLuc MIN6 cellen tweemaal met PBS en voeg 2 mL trypsine. Incubeer bij 37 °C voor ~ 5 min of tot de cellen van de kolf scheiden. Bepaal de cel concentratie per milliliter.
- Verdun de cellen in complete media tot 1 x 106 cellen/ml om te resulteren in 1 x 105 cellen in 100 µ l per put in een 96-well plaat. De cellen moeten voldoende worden beheerst voor de assay na 3 – 4 dagen.
Nota: om de cultuurperiode uit te breiden, kan de helft van de cel concentratie worden geplateerd. De veranderingen van de media zijn niet vereist voorafgaand aan de dag van de analyse tenzij de cellen aan experimentele behandelingen moeten worden onderworpen.
- Verdun de cellen in complete media tot 1 x 106 cellen/ml om te resulteren in 1 x 105 cellen in 100 µ l per put in een 96-well plaat. De cellen moeten voldoende worden beheerst voor de assay na 3 – 4 dagen.
3. glucose-gestimuleerd Gaussia Luciferase secretie assay
- Op de dag van de analyse bereid genoeg KRBH voor het experiment voor (stap 1,2). Een minimum van 50 mL KRBH per 96-goed plaat is nodig, dus bereiden ten minste 75 mL om voldoende buffer voor het experiment te waarborgen. Bereid extra buffer als verschillende combinaties van medicamenteuze behandeling voorwaarden zal vereisen KRBH voor verdunning.
- Bereid een reservoir met glucose vrije KRBH. Decanteer het medium van 96-well plate (s) door snel het omkeren van de plaat over een laboratorium gootsteen en vervolgens Blot stevig op een stapel papieren handdoeken om overtollig medium te verwijderen.
- Pipetteer 100 µ L/well KRBH van het reservoir over de 96-well-plaat (en) met behulp van een elektronische of handmatige 8-kanaals pipet. Herhaal dit voor een totaal van twee wasbeurten.
- (Facultatieve stap van scherpe samenstellings behandelingen) Als niet het uitvoeren van medicamenteuze behandelingen, te gaan met stappen 3,5 en 3,6 zonder wijziging. Voor het testen van de effecten van kleine moleculen op insuline secretie, kunnen verbindingen worden toegevoegd aan de cellen tijdens de preincubatie periode, stimulatie periode, of beide.
- Een techniek is om verbindingen toe te voegen in batch aan de KRBH in 1,5 mL buizen en gebruik een verstelbare 8-kanaals digitale pipet om de drug-KRBH overdracht van de buizen naar cellen in 96-goed platen.
Opmerking: als een verstelbare pipet niet beschikbaar is, kan een replica 96-well plaat van KRBH worden gemaakt en kan een standaard 8-kanaals pipet worden gebruikt voor de overdracht van buffer. Verdere wijzigingen aan de behandeling paradigma kan worden gemaakt om cellen te behandelen voor 24 uur in de media voorafgaand aan de Assay, zoals eerder beschreven1,8.
- Een techniek is om verbindingen toe te voegen in batch aan de KRBH in 1,5 mL buizen en gebruik een verstelbare 8-kanaals digitale pipet om de drug-KRBH overdracht van de buizen naar cellen in 96-goed platen.
- Voeg 100 µ L van KRBH met de gewenste concentratie van glucose of verbindingen en plaats de schotel in de 37 ° c incubator voor 1 uur.
Nota: afhankelijk van de experimentele lay-out, is het uiterst nuttig om een elektronische multichannel pipet te hebben die de overgang van de kanaal afstanden van een kolom van acht 1,5-mL buizen aan de 8 rijen van een 96-goed plaat toestaat. - Na de 1 h van preincubatie, decant de buffer in de gootsteen en DEP stevig op papieren handdoek. Voeg 100 µ L van glucose-vrije KRBH per goed toe om geaccumuleerde achtergrond van Gaussia Luciferase weg te spoelen. Decanteer de plaat weer en voeg controle en stimulerend voorwaarden om de plaat op 100 µ L per put. Plaats de schotel in de incubator van 37 °C voor 1 uur.
- Verzamel zorgvuldig 50 µ L van bovendrijvende met behulp van een multichannel Pipet, het veranderen van tips tussen de behandeling voorwaarden als nodig is, en de overdracht van de bovendrijvende naar een schone ondoorzichtige witte 96-goed assay plaat.
Opmerking: wit-ommuurde helder-Bodemplaten kunnen worden gebruikt indien nodig, hoewel een aanzienlijke hoeveelheid Luciferase signaal zal worden verloren. - Na inzameling van 50 µ L van KRBH bovendrijvende, kan het monster onmiddellijk worden getest. Indien nodig, afdichting en op te slaan monsters bij 4 ° c voor een paar dagen (GLuc activiteit Half-Life ~ 6 dagen) of-20 ° c voor maximaal een maand11,12.
4. afgescheiden Gaussia Luciferase assay
- Ter voorbereiding van de GLuc assay werkoplossing, Pipetteer de vereiste hoeveelheid CTZ stockoplossing (4,2 µ L/mL) in GLuc assay buffer. Om het verwarmen van de CTZ te voorkomen, pipet u de CTZ snel bij de-80 °C vriezer of houdt u de buis op droog ijs.
- Met behulp van een elektronische multichannel Pipet, snel toe te voegen 50 µ L van de GLuc assay werkoplossing per goed over de 96-well schotel met de verzamelde KRBH supernatants. Als er druppels aan de zijkanten van een putjes, kort spin de plaat in een tabel-Top Swing-Bucket centrifuge.
- Lees de luminescentie in een geschikte plaat lezer binnen een paar minuten en Lees elk goed met een 0,1 s integratietijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de prestaties van de test onder controle omstandigheden te meten, kan een eenvoudige glucose dosis-reactiekromme of een stimulatie gebruikend het diazoxide paradigma worden voltooid. In het geval van de voormalige, pre-incubatie van de cellen voor 1 h in glucose-vrije omstandigheden, gevolgd door de behandeling voor 1 h met toenemende glucose concentraties moet leiden tot zeer weinig secretoire activiteit op en onder de 5 mM, terwijl de toegenomen secretie wordt waargenomen boven de 8 mM glucose (Figuur 2). Stimulatie met 35 mM KCl fungeert ook als een positieve controle voor gestimuleerde secretie. De opneming van afscheidings-modulerende drugs tijdens de stimulatie periode zou de verwachte remming of potentiëring van afgescheiden GLuc activiteit (Figuur 3) moeten geven. Bijvoorbeeld, diazoxide bindt de KATP kanaal en verhindert het sluiten op verhoogde [ATP/ADP] ratio, het blokkeren van membraan depolarisatie en het voorkomen van secretie13. Phorbol esters zoals para-methoxyamphetamine (PMA) activeren proteïne kinase C (PKC) en zijn bekende versterkers van insuline secretie14. Ten slotte, stimulatie met 1 µ M adrenaline activeert α2a-adrenerge receptoren die op zijn beurt het activeren van de heterotrimeric G-eiwit complex GI, remmen membraan depolarisatie en insuline secretie15. Het is belangrijk om te erkennen dat terwijl MIN6 cellen een onsterfelijke cel lijn zijn, zij beginnen om juiste glucose-veroorzaakte insuline afscheidings Reacties (zoals het linker-verschuiven van de reactiekromme) na uitgebreide passaging16te verliezen. Om deze reden is het een goede gewoonte om routinematig cultuur alle MIN6 cel lijnen voor maximaal acht weken (splitsing eenmaal per week) voordat u begint over van vloeibare stikstof voorraden.
Figuur 1: beschrijving van de InsGLuc Reporter. (A) eerst, werd een stabiele β cel lijn (in dit geval MIN6 cellen) geproduceerd uitdrukkend het insuline-Gaussia transgene van de rat insuline promotor. (B) het volledige eiwit wordt gesynthetiseerd en verpakt in insuline korrels samen met endogene insuline. Prohormoon convertases splitsen de peptide, aangegeven door sterretjes. (C) de verwerkte insuline en Gaussia worden mede afgescheiden en de Luciferase activiteit wordt gedetecteerd door de toevoeging van CTZ in een ATP-onafhankelijke, zuurstof-afhankelijke reactie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: de InsGLuc reporter is een trouwe volmacht van insuline secretie van MIN6 beta cellen. (A) reactie van MIN6 InsGLuc cellen op toenemende glucose concentraties en KCl (35 mm) met Gaussia Luciferase secretie. Gegevens zijn de gemiddelde vouwen Luciferase activiteit ± SE ten opzichte van 0 mM glucose voorwaarden voor drie onafhankelijke experimenten. *, P < 0,05. De figuur is gewijzigd met toestemming van Kalwat et al. ACS sensoren 20161. © 2016 de Amerikaanse chemische maatschappij. (B) de InsGLuc reporter in MIN6 cellen vertoont de verwachte secretoire reactie op de diazoxide (DZ) paradigma waar 250 µ m dz behandeling houdt de KATP kanaal open, het blokkeren van membraan depolarisatie, tenzij extracellulaire KCl (35 mm) wordt verstrekt het uitlokken van de ' triggering ' calciumtoevloed. De verdere toevoeging van glucose (20 mM) onder dz + KCl voorwaarde openbaart de metabolische versterking van afscheiding die zonder verdere verhogingen van calciumtoevloed voorkomt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: opneming van secretie-modulerende verbindingen tijdens glucose-stimuleert InsGLuc secretie. InsGLuc MIN6 cellen geplateerd in 96-goed formaat zoals beschreven werden preincubatied in glucose-vrije KRBH voor 1 h. cellen werden vervolgens behandeld met of zonder 20 mM glucose in aanwezigheid van dimethyl sulfoxide (DMSO) (0,1%), KCl (35 mM), diazoxide (250 µ M), PMA (100 nM), of adrenaline (1 µ M) voor 1 h. staafdiagram vertegenwoordigen de gemiddelde ± SE van ten minste 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Krebs-ring bicarbonaat buffer (KRBH) | |||
| Stock oplossing of poeder | Voorraad | Eindconcentratie | 100 mL |
| Kcl | 0,25 M | 5 mM | 2 ml |
| Nacl | 4 M | 120 mM | 3 ml |
| HEPES, pH 7,4 | 1 M | 15 mM | 1,5 ml |
| NaHCO3 | 0,5 M | 24 mM | 4,8 ml |
| MgCl2 | 1 M | 1 mM | 0,1 ml |
| CaCl2 | 1 M | 2 mM | 0,2 ml |
| Water | H2O | 88,4 ml | |
| RIA-grade BSA | Poeder | 1 mg/mL | 100 mg |
| Maak vers op dag van experiment. | |||
| Gaussia assay buffer * | |||
| Stock oplossing of poeder | Voorraad | Eindconcentratie | 50 mL |
| Disodium fosfaat | Poeder | 0,1% (1 mg/mL) | 50 mg |
| Glycerol | 40% | 5 | 6,25 mL |
| Natrium bromide | Poeder | 150 mM | 772 mg |
| EDTA pH 8 | 0,5 m | 1 mM | 100 µ L |
| Tris-HCl pH 8 | 1M | 25 mM | 1,25 mL |
| Ascorbinezuur * | Poeder | 300 mM | 2,64 g |
| Na2SO3** | Poeder | 200 mM | 1,26 g |
| Water | tot 50mL | ||
| Opslag in fracties bij-20 °C, ontdooi één voor één en houd bij 4 °C. | |||
| * Gewijzigd recept van Luft et al. BMC biochemie 2014, 15:14. | |||
| Aangezuurde MeOH | |||
| Stock oplossing of poeder | Voorraad | Eindconcentratie | 10 mL |
| Methanol | 100% | 10 mL | |
| Hcl | 11,65 M | 1,06% | 0,106 mL |
| Coelenterazine oplossing | |||
| Stock oplossing of poeder | Voorraad | Eindconcentratie | 1 mL |
| Coelenterazine | Poeder | 1 mg/mL (2,36 mM) | 1 mg |
| Aangezuurde methanol | 1 mL | ||
| 4,2 µ L van voorraad per 1 mL van Gaussia assay buffer resulteert in 10 µ M CTZ om te worden gebruikt als een 2x werkende oplossing. | |||
| Bijvoorbeeld, toevoegen 50 µ L van 2x werking solutie voor 50 µ L van KRBH voorbeeld met uitgescheiden Gaussia. | |||
Tabel 1: buffer en Stock Solution recepten gebruikt om de gepresenteerde tests uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin presenteren we een methode om snel te beoordelen glucose-gestimuleerd insuline secretie reacties van MIN6 β cellen. Voor de beste reacties in de assay is het belangrijk om de MIN6 cellen zaad op de juiste dichtheid en hen in staat stellen te worden 85-95% Confluent. Dit verbetert β cel reacties op glucose wegens betere cel-cel contacten en synchronisatie, die zowel in primaire eilandjes17, 18,19,20,21 evenals MIN6 voorkomt cellen16,18. Om te voorkomen dat verliezen in secretoire reactie op glucose stimulatie, is het belangrijk om de cellen te handhaven zo laag van een passage mogelijk en de cultuur van de cellen voor slechts 6-8 weken voorafgaand aan het ontdooien van een nieuwe flacon uit vloeibare stikstof voorraden. Wijzigingen kunnen worden aangebracht in de plating strategie in Protocol sectie 2 aan te passen aan de beschikbare apparatuur indien nodig. Plating InsGLuc MIN6 cellen in 96-goed platen voor secretie assays biedt een groot aantal putten voor experimentele manipulaties (met inbegrip van repliceert), alsmede het behoud van de nauwkeurigheid van plating in een normale lab-instelling, zoals plating in gerechten met een hogere goed nummers vereisen vaak speciale apparatuur meestal beschikbaar in high-throughput screening cores.
De huidige analyses voor insulineafscheiding, buiten de indirecte Luciferase hier beschreven analyse, omvatten: ELISAs die colorimetrische uitlezingen (directe analyse), radioimmunoanalyses (de test van de concurrentie) gebruiken die radioactieve uitlezingen, FRET-gebaseerd antilichaam gebruiken de test van de concurrentie22 en HTRF23 die fret tussen kleurstof-verbonden antilichamen gebruikt om insuline direct te meten, en DNA aptameren24. Elk van deze methoden heeft zijn eigen voordelen, maar in het algemeen zijn ze duurder en/of tijdrovender dan een Luciferase assay. Een belangrijke beperking van de InsGLuc assay is het feit dat lichtgevende activiteit van de co-afgescheiden Luciferase is slechts een proxy voor de werkelijke insuline secretie. Bovendien, is er geen verwacht verschil in Luciferase activiteit tussen Gaussia met fragmenten van C-peptide op zijn N-en C-Termini of Gaussia binnen de proinsuline proteïne, aangezien Gaussia Luciferase met succes als markering is gebruikt om de afscheiding van te meten andere proteïnen25. Dit benadrukt de eis van de bevestiging van studies met behulp van tests die maatregel verwerkt insuline specifiek. Alternatieven voor directe en indirecte metingen van insuline secretie kunnen ook gebruikt worden om de β cel functie te beoordelen. Een verscheidenheid van optische reporters er bestaan voor uitlezingen met inbegrip van ATP: ADP verhouding, de toevloed van het calcium, NAD+/NADH verhouding, extracellulaire signaal-geregelde KINASES (ERK) activering, of cyclische adenosine monofosfaat (kamp) niveaus26.
De toekomstige toepassingen van InsGLuc in het bijzonder lijken te zijn in high-throughput screening. Deze test is al gebruikt in een handvol van de gepubliceerde kleine schermen1,2 en ongepubliceerde grotere schermen zijn ofwel voltooid7 of onderweg. Ontwikkeling van andere iteraties van deze technologie kan inhouden tagging van andere afgescheiden eilandje hormonen met luciferases om snelle metingen te vergemakkelijken, zoals voor glucagon of Somatostatin. Wijzigingen kunnen worden aangebracht in ieder geval waar de cel lijn wordt herschapen met behulp van alternatieve benaderingen met inbegrip van SCHERPEr/Cas9, lentivirus, of transposase-gemedieerde insertie in een geschikte Beta Cell line. De extra mogelijke wijzigingen aan de originele verslaggever kunnen omvatten vervangend afwisselende afgescheiden luciferases voor Gaussia of het combineren van veelvoudige verschillende afgescheiden luciferases verbonden met verschillende hormonen voor een samengestelde analyse. Beyond Cell cultuur, CRISPer/Cas9 technologie presenteert de mogelijkheid van het genereren van een muismodel waar een geschikte Luciferase is geklopt in de C-peptide codering regio van Ins2 in het genoom. Een dergelijke muis zou haalbaar zijn, gezien het dat transgene muizen zijn gemaakt met GFP klopte in op dezelfde C-peptide site27 en zou de meting van de endogene β cel functie met een Luciferase assay in vivo of ex vivo mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken alle huidige en voormalige leden van het Cobb Laboratory voor waardevolle werk en discussies, en Dionne ware voor administratieve bijstand. Michael Kalwat wordt ondersteund door een juveniele diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Dit werk werd mogelijk gemaakt door NIH R37 DK34128 en Welch Foundation Grant I1243 aan Melanie Cobb. De vroege delen van dit werk werden ook gesteund door een NIH F32 DK100113 aan Michael Kalwat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
- Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
- Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. , WO2018175324A1 (2018).
- Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
- Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
- Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
- Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
- Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
- Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
- Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
- Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
- Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
- Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
- Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
- Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
- Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
