Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मध्यम-थ्रूपुट पर तेजी से कम लागत luciferase assays प्रदर्शन करने के लिए एक इंसुलिन से जुड़े गौसिया luciferase बीटा कोशिकाओं से इंसुलिन स्राव के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में का उपयोग कर. परख सबसे luminescence प्लेट पाठकों और multichannel pipettes के साथ किया जा सकता है.
Abstract
स्रावित इंसुलिन के बाद नमूना संग्रह के लिए एंटीबॉडी आधारित परख प्रदर्शन आमतौर पर परख समय के एक दिन के लिए कुछ घंटे की आवश्यकता है और महंगा हो सकता है, विशिष्ट परख के आधार पर. गुप्त luciferase assays परिणाम ों में तेजी लाने और प्रति नमूना परख लागत काफी कम. यहाँ हम एक अपेक्षाकृत underused दृष्टिकोण प्रस्तुत करने के लिए अग्नाशय से इंसुलिन स्रावी गतिविधि गेज - कोशिकाओं Gassia luciferase आनुवंशिक रूप से सी-पेप्टाइड के भीतर डाला का उपयोग करके. प्रोइंसुलिन के प्रोटीओलिटिक प्रसंस्करण के दौरान, सी-पेप्टाइड को इंसुलिन सेक्रेटरी vesicle के भीतर ल्यूसिफरेज को रिहा किया जाता है जहां यह इंसुलिन के साथ सह-स्रावित होता है। परिणाम luciferase assays की गति की वजह से नमूना संग्रह के बाद मिनट के भीतर प्राप्त किया जा सकता है. परख की एक सीमा यह है कि यह इंसुलिन स्राव का एक रिश्तेदार माप है और एक निरपेक्ष परिमाणन नहीं है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल किफायती, स्केलेबल है, और सबसे मानक luminscence प्लेट पाठकों का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है. एनालॉग और डिजिटल मल्टीचैनल पिपेट परख के कई चरणों को सुविधाजनक बनाते हैं। कई अलग अलग प्रयोगात्मक विविधताओं एक साथ परीक्षण किया जा सकता है. एक बार शर्तों का एक केंद्रित सेट पर फैसला कर रहे हैं, इंसुलिन सांद्रता सीधे मानक घटता के साथ एंटीबॉडी आधारित परख का उपयोग कर ल्यूसिफेरेस परख परिणाम की पुष्टि करने के लिए मापा जाना चाहिए.
Introduction
यहाँ प्रस्तुत विधि एक आनुवंशिक रूप से संशोधित बीटा सेल लाइन से इंसुलिन स्राव की अनुमति देता है तेजी से परख और affordably में 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप. इस प्रोटोकॉल के लिए कुंजी स्वाभाविक रूप से गुप्त गौसिया luciferase के साथ इंसुलिन का एक संशोधित संस्करण है (GLuc, $ 18 kDa) डाला (चित्रा 1देखें) सी-पेप्टाइड में इंसुलिन-गौसिया उत्पन्न करने के लिए (InsGLuc)1,2. अन्य बड़े प्रोटीन, जैसे GFP ($25 kDa), सफलतापूर्वक इंसुलिन के सी-पेप्टाइड में डाला गया है और इंसुलिन और GFP-सी-पेप्टाइड के लिए प्रोइन्सुलिन-जीएफपी से अपेक्षित पोस्ट-ट्रांसलेशनल प्रोसेसिंग का प्रदर्शन किया गयाहै 3,4. इस प्रोटोकॉल में परख के लिए, GLuc स्तनधारी अभिव्यक्ति के लिए codon अनुकूलित किया गयाहै और दो उत्परिवर्तनों चमक की तरह गतिज 5,6को बढ़ाने के लिए पेश किया गया है. एकाधिक संयोजन और उपचार की स्थिति की प्रतिकृति आसानी से 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में परीक्षण किया जा सकता है और स्राव परिणाम तुरंत प्रयोग के बाद प्राप्त किया जा सकता है.
एक प्रमुख लाभ, जैसा कि पहले उल्लेखकिया 2, इस luciferase आधारित स्राव माप की कम लागत है (और $lt; $0.01/well) जो इसे अपेक्षाकृत उच्च लागत और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट assays (ELISAs) के तकनीकी पहलुओं से differentiates ( और समरूप समय-समाधानित फ्लोरोसेंट (एचटीआरएफ) या अन्य एफजेडर्स्टर अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (FRET)-आधारित एंटीबॉडी (gt; $1/well) परासरण। इन एंटीबॉडी आधारित परख की तुलना में, जो एक मानक वक्र को संदर्भित करके इंसुलिन की एकाग्रता को मापने, InsGLuc परख थाली पर कुओं को नियंत्रित करने के लिए एक रिश्तेदार तुलना के रूप में स्रावी गतिविधि के उपाय. इस कारण से, हर प्रयोग के लिए उचित नियंत्रण शामिल करने की आवश्यकता होती है। यह भेद एक व्यापार बंद करने के लिए तेजी से और सस्ती माप की अनुमति है. तथापि, इन्सजीलुक स्राव को एलिसा1,2द्वारा मापे गए इंसुलिन स्राव से अत्यधिक सहसंबद्ध होने के लिए प्रदशत किया गया है। इस प्रौद्योगिकी को उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग1,2,7 के लिए बढ़ाया गया है और एक वोल्टेज-गेटेड पोटेशियम चैनल अवरोध कनेर7 सहित इंसुलिन स्राव के उपन्यास न्यूनाधिक की पहचान करने के लिए प्रेरित किया गया है साथ ही $ सेल समारोह के एक प्राकृतिक उत्पाद अवरोधक के रूप में, क्रोमोमाइसिन ए28. InsGLuc का उपयोग शोधकर्ताओं जो लगातार इंसुलिन स्राव पर उनके प्रभाव के लिए कई अलग अलग उपचार की स्थिति का परीक्षण करने की योजना के लिए सबसे उपयुक्त है. अनुवर्ती प्रयोगों में यह एक माता पिता की कोशिका लाइन में महत्वपूर्ण निष्कर्षों को दोहराने के लिए आवश्यक है, और बेहतर murine या मानव islets में, और एक एंटीबॉडी आधारित परख का उपयोग कर इंसुलिन स्राव को मापने.
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Protocol
1. अभिकर्मकों, मीडिया और बफ़र्स की तैयारी (तालिका 1)
- उच्च-ग्लूकोज (4.5 ग्राम/एल) Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) निम्नलिखित additives के साथ 500 एमएल में MIN6 पूरा मीडिया तैयार करें: 15% भ्रूण गोवाइन सीरम (FBS), 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, 100 डिग्री/ जेड-मेरकैप्टोथेनोल।
नोट: इस मामले में स्थिर सेल लाइन जी 418 एंटीबायोटिक के 250 डिग्री/ - 5 एमएम केसीएल, 120 एमएम नैकल, 15 एमएम हैप (पीएच 7.4), 24 एमएम नाहको 3, 1 एमएम एमजीसीएल2, 2 एमएमसीसीएल 2, और1 एमजीएल रेडियोमिनोमासे-ग्रेड बोविनी अल्बम (बीएसए) से युक्त एक समाधान बनाकर क्रेब-रिंगर बाइकार्बोनेट बफर (केआरबीएच) तैयार करें। ग्लूकोज जोड़ा जा करने के लिए है, जहां एक 2 एम स्टॉक से निर्दिष्ट.
नोट: KRBH इंसुलिन और / या गौसिया luciferase स्राव का आकलन करने के लिए उत्तेजना के साथ और बिना कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। - coelenterazine (सीटीजेड) स्टॉक समाधान निम्नानुसार तैयार करें। संकेंद्रित एचसीएल के 106 डिग्री सेल्सियस को 10 एमएल मेथनॉल में जोड़कर अम्लीकृत मेथनॉल की तैयारी की। इसके बाद, अम्लीकृत मेथनॉल में lyophilized सीटीजेड को 1 मिलीग्राम/एमएल पर भंग करें और पेंच-कैप ट्यूबों में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: इन शेयरों नियमित luciferase assays में पर्याप्त गतिविधि बनाए रखने, यहां तक कि उचित भंडारण के 1 वर्ष के बाद. - साहित्य9 के साथ-साथ पेटेंट जानकारी10 पर आधारित गौसिया ल्यूसिफरेस (GLuc) परख बफर तैयार करें ताकि 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में गौसिया ल्यूसिफेरेज परख के आधे जीवन में सहायता की जा सके। सूत्र का उपयोग करें: 25 एमएम ट्रास पीएच 8, 1 एमएम एड्टा, 5% ग्लिसरॉल, 1 मिलीग्राम/एमएल ना2पीओ4, 300 एमएम सोडियम एसकॉर्बेट, 200 एमएम ना2SO3 पानी में। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक फ्रीज करें। थिंग के बाद बफर को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- गौसिया ल्यूसिफेज़ कार्य समाधान तैयार करने के लिए, GLuc परख बफर के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल (2.36 एमएम) सीटीजेड स्टॉक समाधान के 4.2 डिग्री एल/ यह एक 2x काम कर समाधान में परिणाम 10 [M सीटी ] जो परख में एक 5 डिग्री मीटर अंतिम एकाग्रता होगा.
2. InsGLuc MIN6 कोशिकाओं और स्राव परख के लिए बोने की संस्कृति
- संस्कृति MIN6 कोशिकाओं के लिए, trypsinize और मानक सेल संस्कृति तकनीक का उपयोग कर सप्ताह में एक बार कोशिकाओं बीज. कोशिकाओं पर मीडिया को हर दो से तीन दिन में बदलें. उचित चयन एंटीबायोटिक शामिल करें, जैसे कि मीडिया में G418 के 250 g/
- प्रयोगों के लिए साप्ताहिक कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या प्रदान करने के लिए, T75 फ्लास्क में कोशिकाओं को बनाए रखने. मीडिया के 10 एमएल में 6 x 106 कोशिकाओं प्रति T75 सीडिंग आम तौर पर 30 x 106 से 40 x 106 कोशिकाओं की कुल प्रति T75 7 दिनों के बाद की उपज होगी संस्कृति के 7 दिनों के बाद.
- 96-वेल प्लेट्स में चढ़ाना के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, दो बार पीबीएस के साथ InsGLuc MIN6 कोशिकाओं के एक confluent T75 धोने और trypsin के 2 एमएल जोड़ें. $ 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर या जब तक कोशिकाओं फ्लास्क से अलग इनक्यूबेट। प्रति मिलीलीटर कोशिका सांद्रता निर्धारित करें।
- एक 96-वेल प्लेट में 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के परिणामस्वरूप 1 x 105 कोशिकाओं में 100 डिग्री सेल्सियस प्रति अच्छी तरह से पूर्ण मीडिया में कोशिकाओं को पतला करें। कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से 3-4 दिनों के बाद परख के लिए अनुकूल होना चाहिए.
नोट: संस्कृति अवधि का विस्तार करने के लिए, आधा सेल एकाग्रता चढ़ाया जा सकता है. मीडिया परिवर्तन परख के दिन से पहले की आवश्यकता नहीं है जब तक कि कोशिकाओं को प्रयोगात्मक उपचार के अधीन किया जा रहे हैं.
- एक 96-वेल प्लेट में 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के परिणामस्वरूप 1 x 105 कोशिकाओं में 100 डिग्री सेल्सियस प्रति अच्छी तरह से पूर्ण मीडिया में कोशिकाओं को पतला करें। कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से 3-4 दिनों के बाद परख के लिए अनुकूल होना चाहिए.
3. ग्लूकोज उत्तेजित गौसिया luciferase स्राव परख
- परख के दिन प्रयोग के लिए पर्याप्त KRBH तैयार (चरण 1.2). प्रति 96-वेल प्लेट के0बीएच के 50 एमएल की आवश्यकता होती है, इसलिए प्रयोग के लिए पर्याप्त बफर सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 75 एमएल तैयार करें। अतिरिक्त बफर तैयार अगर दवा उपचार की स्थिति के विभिन्न संयोजनों कमजोर पड़ने के लिए KRBH की आवश्यकता होगी.
- ग्लूकोज मुक्त KRBH के साथ एक जलाशय तैयार करें. जल्दी से एक प्रयोगशाला सिंक पर प्लेट उलटा और फिर अतिरिक्त माध्यम को दूर करने के लिए कागज तौलिए के ढेर पर मजबूती से धब्बा द्वारा 96-अच्छी प्लेट (ओं) से माध्यम को हटा दें।
- या तो एक इलेक्ट्रॉनिक या मैनुअल 8 चैनल pipette का उपयोग करना, pipette 100 $L / अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से प्लेट (ओं) भर में जलाशय से KRBH. दो washes की कुल के लिए दोहराएँ.
- (तीव्र यौगिक उपचार के वैकल्पिक कदम) यदि दवा उपचार प्रदर्शन नहीं कर रहा है, कदम के साथ आगे बढ़ना 3.5 और 3.6 संशोधन के बिना. इंसुलिन स्राव पर छोटे अणुओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, यौगिकों preincubation अवधि के दौरान कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है, उत्तेजना अवधि, या दोनों.
- एक तकनीक 1.5 एमएल ट्यूबों में KRBH करने के लिए बैच में यौगिकों जोड़ने के लिए और 96 अच्छी तरह से प्लेटों में कोशिकाओं के लिए ट्यूबों से दवा KRBH हस्तांतरण करने के लिए एक समायोज्य 8 चैनल डिजिटल पिपेट का उपयोग करने के लिए है।
नोट: यदि एक समायोज्य पिपेट उपलब्ध नहीं है, तो एक प्रतिकृति 96-वेल प्लेट की दवा KRBH बनाया जा सकता है और एक मानक 8 चैनल pippette बफर हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उपचार प्रतिमान के लिए आगे संशोधन के लिए मीडिया में 24 एच के लिए कोशिकाओं के इलाज के लिए किया जा सकता है परख से पहले, जैसा कि पहले वर्णित1,8.
- एक तकनीक 1.5 एमएल ट्यूबों में KRBH करने के लिए बैच में यौगिकों जोड़ने के लिए और 96 अच्छी तरह से प्लेटों में कोशिकाओं के लिए ट्यूबों से दवा KRBH हस्तांतरण करने के लिए एक समायोज्य 8 चैनल डिजिटल पिपेट का उपयोग करने के लिए है।
- ग्लूकोज या यौगिकों की वांछित एकाग्रता युक्त KRBH के 100 डिग्री एल जोड़ें और 1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पकवान जगह है।
नोट: प्रयोगात्मक लेआउट पर निर्भर करता है, यह एक इलेक्ट्रॉनिक multichannel pipette है कि आठ 1.5-एमएल ट्यूबों के एक स्तंभ से चैनल दूरी संक्रमण एक 96 अच्छी तरह से प्लेट की 8 पंक्तियों के लिए अनुमति देता है करने के लिए अत्यंत उपयोगी है. - 1 ज प्रीइनक्यूबेशन के बाद, बफर को सिंक में बंद करें और कागज तौलिया पर मजबूती से दागें। गौसिया ल्यूसीफेरेज़ की संचित पृष्ठभूमि को धोने के लिए 100 $L ग्लूकोज-मुक्त केआरबीएच को अच्छी तरह से जोड़ें। प्लेट को फिर से छान लें और प्लेट में नियंत्रण और उत्तेजक स्थितियां जोड़ें 100 डिग्री सेल्सियस प्रति अच्छी तरह से। 1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पकवान रखें।
- ध्यान से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर supernatant के 50 डिग्री सेल्सियस इकट्ठा, आवश्यक के रूप में उपचार की स्थिति के बीच युक्तियाँ बदल रहा है, और एक साफ अपारदर्शी सफेद 96 अच्छी तरह से परख प्लेट के लिए supernatant हस्तांतरण।
नोट: सफेद दीवारों स्पष्ट नीचे प्लेटें यदि आवश्यक हो, इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि luciferase संकेत का एक महत्वपूर्ण राशि खो जाएगा. - केआरबीएच सुपरनेंट के 50 जेडएल के संग्रह के बाद, नमूने को तुरंत परख की जा सकती है। यदि आवश्यक हो, सील और कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने की दुकान (GLucगतिविधि आधा जीवन [6 दिन) या एक महीने 11,12तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस .
4. गुप्त गौसिया ल्यूसिफरेस परख
- GLuc परख काम कर समाधान तैयार करने के लिए, GLuc परख बफर में सीटीजेड स्टॉक समाधान (4.2 $L/mL) की आवश्यक राशि pippette। सीटीजेड को गर्म करने से रोकने के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में सीटीजेड को जल्दी से पिपेट करें या ट्यूब को सूखी बर्फ पर रखें।
- एक इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, जल्दी से एकत्र KRBH supernatants युक्त 96 अच्छी तरह से पकवान भर में अच्छी तरह से काम कर समाधान परख के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. यदि किसी भी कुएं के किनारे पर कोई बूंदें हों, तो प्लेट को टेबल-टॉप स्विंग-बकेट सेंट्रीफ्यूज में संक्षेप में स्पिन करें।
- कुछ ही मिनटों के भीतर एक उपयुक्त प्लेट रीडर में संदीप्ति पढ़ें और एक 0.1 s एकीकरण समय के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से पढ़ें.
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Representative Results
नियंत्रण शर्तों के तहत परख के प्रदर्शन को मापने के लिए, एक सरल ग्लूकोज खुराक प्रतिक्रिया वक्र या diazoxide प्रतिमान का उपयोग कर एक उत्तेजना पूरा किया जा सकता है. पूर्व के मामले में, ग्लूकोज मुक्त स्थितियों में 1 एच के लिए कोशिकाओं को पूर्व-इनक्यूबेट करना जिसके बाद ग्लूकोज सांद्रता में वृद्धि के साथ 1 एच के लिए इलाज किया जाना चाहिए, इसके परिणामस्वरूप 5 एमएम से नीचे और नीचे बहुत कम स्रावक गतिविधि होनी चाहिए, जबकि वृद्धि स्राव 8 से ऊपर देखा गया है एमएम ग्लूकोज (चित्र 2)। उत्तेजना के साथ 35 एम एम KCl भी प्रेरित स्राव के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. उत्तेजना अवधि के दौरान स्राव-मॉडुलन औषधियों को शामिल करने से स्रावित ग्लूस क्रियाकलाप की अपेक्षित निषेध अथवा प्रबलता होनी चाहिए (चित्र 3)। उदाहरण के लिए, diazoxide KATP चैनल बांधता है और यह वृद्धि पर बंद करने से रोकता है [ATP/ADP] अनुपात, झिल्ली depolarization अवरुद्ध और स्राव13को रोकने. Phorbol एस्टर जैसे पैरा-मेथॉक्सीएम्पेथामाइन (पीएमए) प्रोटीन kinase सी (PKC) को सक्रिय और इंसुलिन स्राव के एम्पलीफायरों जाना जाता है14. अंत में, उत्तेजना के साथ 1 $M epinephrine सक्रिय करता है -2A-adrenergic रिसेप्टर्स जो बारी में विषमत्रीय जी प्रोटीन जटिल जी सक्रिय, झिल्ली depolarization और इंसुलिन स्राव15बाधा . यह समझना महत्वपूर्ण है कि जब कि MIN6 कोशिकाएं एक अमर कोशिका रेखा हैं, तो वे16तक विस्तारित पासिंग के बाद उचित ग्लूकोज-प्रेरित इंसुलिन स्राव प्रतिक्रियाओं (जैसे प्रतिक्रिया वक्र के बाएं स्थानांतरण) को खोना शुरू कर ते हैं। इस कारण से, यह अच्छा अभ्यास के लिए आठ सप्ताह के लिए सभी MIN6 सेल लाइनों संस्कृति (प्रति सप्ताह एक बार विभाजन) तरल नाइट्रोजन स्टॉक से अधिक शुरू करने से पहले है.
चित्र 1: InsGLuc रिपोर्टर का विवरण. (ए) सबसे पहले, एक स्थिर जेड सेल लाइन (इस मामले में MIN6 कोशिकाओं) चूहे इंसुलिन प्रमोटर से इंसुलिन-गौसिया ट्रांसजीन व्यक्त उत्पन्न किया गया था. (बी) पूर्ण प्रोटीन संश्लेषित और अंतर्जात इंसुलिन के साथ इंसुलिन granules में पैक किया जाता है. Prohormone convertases पेप्टाइड को छोड़, तारांकन द्वारा संकेत दिया. (ग) प्रसंस्कृत इंसुलिन और गौसिया सह-गुप्त होते हैं और एटीपी-स्वतंत्र, ऑक्सीजन-निर्भर अभिक्रिया में सीटीजेड के अतिरिक्त द्वारा ल्यूसिफरेस गतिविधि का पता लगाया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: InsGLuc रिपोर्टर MIN6 बीटा कोशिकाओं से इंसुलिन स्राव का एक वफादार प्रॉक्सी है. (ए) ग्लौसिया ल्यूसिफेज़ स्राव के साथ ग्लूकोज सांद्रता और केसीएल (35 एम) को बढ़ाने के लिए MIN6 InsGLuc कोशिकाओं की प्रतिक्रिया। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए 0 एमएम ग्लूकोज की स्थिति की तुलना में मतलब गुना ल्यूसिफरेस गतिविधि हैं । *, पी एंड एलटी; 0.05. यह आंकड़ा कलवत एट अल एसीएस सेंसर 20161से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। © 2016 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। (बी) MIN6 कोशिकाओं में InsGLuc रिपोर्टर diazoxide (Dz) प्रतिमान जहां 250 डिग्री एम डीz उपचार Kएटीपी चैनल खुला रखती है, झिल्ली depolarization अवरुद्ध जब तक extracellular KCl (35 एम एम) प्रदान की जाती है की उम्मीद स्रावी प्रतिक्रिया दर्शाती है ताकि 'ट्रिगरिंग' कैल्शियम का प्रवाह हो सके। Dz + KCl हालत के तहत ग्लूकोज (20 एमएम) के अलावा कैल्शियम प्रवाह में आगे बढ़ जाती है के बिना होता है कि स्राव के चयापचय प्रवर्धन का पता चलता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: ग्लूकोज-उत्तेजित InsGLuc स्राव के दौरान स्राव-मॉडुलन यौगिकों का समावेश। InsGLuc MIN6 कोशिकाओं 96 अच्छी तरह से प्रारूप में चढ़ाया के रूप में वर्णित ग्लूकोज मुक्त KRBH में preincubated थे 1 एच. कोशिकाओं तो के साथ या बिना 20 एम ग्लूकोज के साथ dimethyl sulfoxide (DMSO) (0.1%), केसीएल (35 एमएम), diazoxide (250 $M), PMA (100 एनएम), या 1 ज बार ग्राफ के लिए एपिनेफ्रिन (1 डिग्री सेल्सियस) कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य एसई का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| क्रेब्स-रिंगर बाइकार्बोनेट बफर (KRBH) | |||
| स्टॉक समाधान या पाउडर | भंडार | अंतिम एकाग्रता | 100 एमएल |
| केसीएल | 0.25 एम | 5 एम.एम. | 2 मिलीलीटर |
| Nacl | 4 एम | 120 एमएम | 3 मिलीलीटर |
| हेप्स, पीएच 7.4 | 1 एम | 15 एमएम | 1.5 मिलीलीटर |
| नाHको3 | 0.5 एम | 24 एमएम | 4.8 मिलीलीटर |
| एमजीसीएल2 | 1 एम | 1 एम.एम. | 0.1 मिलीलीटर |
| CaCl2 | 1 एम | 2 एम.एम. | 0.2 मिलीलीटर |
| पानी | H2O | 88.4 मिलीलीटर | |
| रिया ग्रेड बीएसए | पाउडर | 1 मिलीग्राम/एमएल | 100 मिलीग्राम |
| प्रयोग के दिन ताजा करें। | |||
| गौसिया परख बफर* | |||
| स्टॉक समाधान या पाउडर | भंडार | अंतिम एकाग्रता | 50 एमएल |
| डाइसोडियम फॉस्फेट | पाउडर | 0.1% (1 मिलीग्राम/ | 50 मिलीग्राम |
| ग्लिसरोल | 40% | 5% | 6.25 एमएल |
| सोडियम ब्रोमाइड | पाउडर | 150 एमएम | 772 मिलीग्राम |
| EDTA पीएच 8 | 0.5 एम | 1 एम.एम. | 100 $L |
| Tris-HCl पीएच 8 | 1M | 25 एमएम | 1.25 एमएल |
| एस्कॉर्बिक एसिड* | पाउडर | 300mm | 2.64 ग्राम |
| ना2सो3** | पाउडर | 200 एमएम | 1.26 ग्राम |
| पानी | 50एमएल तक | ||
| -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट में स्टोर करें, एक समय में एक को थपथपाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। | |||
| * Luft एट अल बीएमसी बायोकेमिस्ट्री 2014, 15:14 से संशोधित नुस्खा। | |||
| अम्लीकृत MeOH | |||
| स्टॉक समाधान या पाउडर | भंडार | अंतिम एकाग्रता | 10 एमएल |
| मेथनॉल | 100% | 10 एमएल | |
| Hcl | 11.65 एम | 1.06% | 0.106 एमएल |
| Coelenterazine समाधान | |||
| स्टॉक समाधान या पाउडर | भंडार | अंतिम एकाग्रता | 1 एमएल |
| कोएलेन्टेराज़ीन | पाउडर | 1 मिलीग्राम/एमएल (2.36 एम एम) | 1 मिलीग्राम |
| अम्लीकृत मेथेनोल | 1 एमएल | ||
| 4ण्2 $ल स्टॉक प्रति 1 एमएल गाऊसिया परख बफर के परिणाम में 10 डिग्री सेल्सियस सीटीजेड को 2x कार्य समाधान के रूप में उपयोग किया जाएगा। | |||
| उदाहरण के लिए, स्रावित गौसिया युक्त KRBH नमूने के 50 डिग्री सेल्सियस के लिए 2x कार्य समाधान के 50 डिग्री एल जोड़ें। | |||
तालिका 1: बफर और स्टॉक समाधान व्यंजनों प्रस्तुत assays प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया.
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Discussion
इसमें हम MIN6 से ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव प्रतिक्रियाओं का तेजी से मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। परख में सबसे अच्छा प्रतिक्रियाओं के लिए यह उचित घनत्व पर MIN6 कोशिकाओं बीज और उन्हें 85-95% confluent बनने के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है. यह बेहतर सेल-सेल संपर्कों और तुल्यकालन के कारण ग्लूकोज के लिए कक्ष प्रतिक्रियाओं में सुधार करता है, जो प्राथमिक आइलेट्स17,18,19,20,21 और साथ ही MIN6 दोनों में होता है कोशिकाओं16,18. ग्लूकोज उत्तेजना के लिए स्रावी प्रतिक्रिया में नुकसान को रोकने के लिए, यह संभव के रूप में एक मार्ग के रूप में कम पर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है और संस्कृति केवल 6-8 सप्ताह के लिए कोशिकाओं तरल नाइट्रोजन स्टॉक से एक नई शीशी thawing से पहले. संशोधन आवश्यक के रूप में उपलब्ध उपकरणों के लिए अनुकूल करने के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग 2 में चढ़ाना रणनीति के लिए किया जा सकता है। स्राव परख के लिए 96-वेल प्लेटों में चढ़ाना InsGLuc MIN6 कोशिकाओं प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए कुओं की एक बड़ी संख्या affords (प्रतिकृति सहित) के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक सामान्य प्रयोगशाला सेटिंग में चढ़ाना की सटीकता को बनाए रखने, उच्च अच्छी तरह से साथ व्यंजन में चढ़ाना के रूप में संख्या अक्सर विशेष उपकरण आमतौर पर उच्च throughput स्क्रीनिंग कोर में उपलब्ध की आवश्यकता है.
इंसुलिन स्राव के लिए वर्तमान परख, अप्रत्यक्ष luciferase परख के अलावा यहाँ वर्णित, शामिल हैं: ELISAs कि colorimetric readouts (प्रत्यक्ष परख), radioimmunoassays (प्रतियोगिता परख) जो रेडियोधर्मी readouts का उपयोग करें, FRET-आधारित एंटीबॉडी प्रतियोगिता परख22 और HTRF23 जो डाई से जुड़े एंटीबॉडी के बीच FRET का उपयोग करता है इंसुलिन सीधे मापने के लिए, और डीएनए aptamers24. इन तरीकों में से प्रत्येक के अपने फायदे हैं, लेकिन आम तौर पर वे और अधिक महंगे हैं और / InsGLuc परख की एक प्रमुख सीमा तथ्य यह है कि सह-गुप्त luciferase के luminescent गतिविधि केवल वास्तविक इंसुलिन स्राव के लिए एक प्रॉक्सी है. इसके अतिरिक्त, वहाँ अपने एन पर सी-पेप्टाइड के टुकड़े के साथ गॉसिया के बीच luciferase गतिविधि में कोई अपेक्षित अंतर नहीं है- और सी-टर्मिनी या गौसिया proinsulin प्रोटीन के भीतर, के रूप में गौसिया luciferase सफलतापूर्वक एक टैग के रूप में इस्तेमाल किया गया है के स्राव को मापने के लिए अन्य प्रोटीन25| यह परख है कि संसाधित इंसुलिन विशेष रूप से उपाय का उपयोग कर पुष्टि अध्ययन की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया. इंसुलिन स्राव के प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष माप के लिए विकल्प भी $ सेल समारोह का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऑप्टिकल पत्रकारों की एक किस्म एटीपी सहित readouts के लिए मौजूद: एडीपी अनुपात, कैल्शियम प्रवाह, NAD+/ NADH अनुपात, extracellular संकेत विनियमित kinases (ERK) सक्रियण, या चक्रीय एडेनोसाइन मोनोफॉस्फेट (सीएएमपी) स्तर26.
विशेष रूप से InsGLuc के भविष्य के आवेदन उच्च throughput स्क्रीनिंग में दिखाई देते हैं. इस परख पहले से ही प्रकाशित छोटेपरदे 1,2 और अप्रकाशित बड़ी स्क्रीन या तो पूरा कर रहे हैं7 या चल रहे एक मुट्ठी भर में इस्तेमाल किया गया है. इस प्रौद्योगिकी के अन्य पुनरावृत्तियों के विकास में लूसीफेरेज़ के साथ अन्य स्रावित islet हार्मोन की टैगिंग शामिल हो सकती है ताकि तेजी से माप की सुविधा मिल सके, जैसे ग्लूकागन या सोमेटोस्टेटिन के लिए। संशोधन किसी भी मामले में किया जा सकता है जहां सेल लाइन CRISPR/Cas9, lentivirus, या किसी भी उपयुक्त बीटा सेल लाइन में transposase-मध्यस्थ प्रविष्टि सहित वैकल्पिक दृष्टिकोण का उपयोग कर निर्मित है. मूल रिपोर्टर के लिए अतिरिक्त संभव संशोधनों में गौसिया के लिए वैकल्पिक स्रावित luciferases प्रतिस्थापन या एक multiplexed परख के लिए विभिन्न हार्मोन से जुड़े कई अलग अलग स्रावित luciferases के संयोजन शामिल हो सकते हैं. सेल संस्कृति के अलावा, CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी एक माउस मॉडल पैदा करने की संभावना प्रस्तुत करता है जहां एक उपयुक्त luciferase जीनोम में Ins2 के सी-पेप्टाइड कोडिंग क्षेत्र में खटखटाया है. इस तरह के एक माउस को देखते हुए संभव हो जाएगा कि ट्रांसजेनिक चूहों GFP के साथ बनाया गया है एक ही सी-पेप्टाइड साइट में खटखटाया27 और अंतर्जात की माप की अनुमति होगी - सेल समारोह में एक luciferase परख के साथ vivo या पूर्व vivo.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखक मूल्यवान काम और विचार विमर्श के लिए Cobb प्रयोगशाला के सभी वर्तमान और पूर्व सदस्यों को धन्यवाद, और प्रशासनिक सहायता के लिए Dionne वेयर. माइकल Kalwat एक किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन SRA-2019-702-Q-आर द्वारा समर्थित है. यह काम NIH R37 DK34128 और वेल्च फाउंडेशन अनुदान I1243 Melanie Cobb के माध्यम से संभव बनाया गया था. इस काम के प्रारंभिक भागों में भी माइकल Kalwat के लिए एक NIH F32 DK100113 द्वारा समर्थित थे.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
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