Summary
Hier presenteren we een protocol voor eenvoudige isolatie van specifieke groepen van levende neuronale cellen die groen fluorescerende eiwitten uit transgene Caenorhabditis elegans lijnen uitdrukken. Deze methode maakt een verscheidenheid van ex vivo studies gericht op specifieke neuronen en heeft de capaciteit om cellen te isoleren voor verdere korte termijn culturing.
Abstract
Tijdens het verouderingsproces, veel cellen accumuleren hoge niveaus van schade die leidt tot cellulaire dysfunctie, die ten grondslag ligt aan vele geriatrische en pathologische omstandigheden. Post-mitotische neuronen vertegenwoordigen een belangrijk celtype beïnvloed door veroudering. Hoewel meerdere zoogdieren modellen van neuronale veroudering bestaan, ze zijn uitdagend en duur om vast te stellen. De rondworm Caenorhabditis elegans is een krachtig model om neuronale veroudering te bestuderen, omdat deze dieren een korte levensduur hebben, een beschikbare robuuste genetische Toolbox en goed gecatalogeerd zenuwstelsel. De hier gepresenteerde methode zorgt voor naadloze isolatie van specifieke cellen op basis van de uitdrukking van een transgene groene fluorescerende proteïne (GFP). Transgene dieren lijnen die GFP uitdrukken onder verschillende celtypespecifieke promotors worden verteerd om de buitenste cuticula te verwijderen en zachtjes mechanisch verstoord om slurry met verschillende celtypen te produceren. De cellen van belang worden vervolgens gescheiden van niet-doelcellen via fluorescentie-geactiveerde celsortering, of door anti-GFP-gekoppelde magnetische kralen. De geïsoleerde cellen kunnen vervolgens voor een beperkte tijd worden gekweekt of onmiddellijk worden gebruikt voor cel-specifieke ex vivo-analyses, zoals transcriptionele analyse door real-time kwantitatieve PCR. Dit protocol zorgt dus voor een snelle en robuuste analyse van celspecifieke reacties binnen verschillende neuronale populaties in C. elegans.
Introduction
In de afgelopen decennia, het metazoan modelorganisme Caenorhabditis elegans is een enorme troef in de studie van neuronen, neuronale circuits en haar rol in fysiologische en gedragsmatige reacties, en veroudering-geassocieerde neurodegeneratieve Ziekten. Een unieke eigenschap van C. elegans is dat de dieren transparant zijn, waardoor de afstamming van alle volwassen somatische cellen in kaart kan worden gebracht1. C. elegans herbergt ook beheersbare hoeveelheid neuronen, wat leidt tot de morfologie en connectiviteit van het zenuwstelsel wordt goed begrepen2. De invariante celafstamming, korte levensduur en overvloed aan genetische hulpmiddelen met hoge doorvoer die beschikbaar zijn voor C. elegans maken het een ideaal modelorganisme voor de studie van veroudering binnen verschillende neuronale populaties.
Veroudering van neuronen en neurodegeneratieve aandoeningen zijn complex, en elke stoornis heeft unieke pathologische handtekeningen die ermee verbonden zijn. Echter, voor veel van deze aandoeningen, zoals de ziekte van Parkinson en Alzheimer, een gemeenschappelijk kenmerk is de progressieve belasting van verkeerd gevouwen eiwitten3,4,5. In beide van deze ziekten, eiwitten misvouwen en aggregaat binnen de cel om toxiciteit te veroorzaken, uiteindelijk leiden tot celdood4,5. Voor de juiste veroudering van neuronen, de homeostase van de mitochondriën, meer specifiek eiwit homeostase, is belangrijk, als verstoringen en dyshomeostase kan leiden tot neurodegeneratie6,7,8. Cellen zijn uitgerust met verschillende mechanismen om eiwit homeostase te handhaven, één is de ongevouwen eiwit respons (UPR) ― een klassieke route waarbij signalen van endoplasmisch reticulum (ER) intracellulaire signaal Cascades activeren, wat leidt tot een transcriptionele Response9. Verwant aan deze UPRer, figuur vertonen een soortgelijke reactie op het verlies van mitochondriale eiwit homeostase, de zogenaamde mitochondriale UPR (UPRMT)7,8. C. elegans lijkt het meest basale organisme te zijn dat een bevestigde en goed gedefinieerde UPRMT traject7heeft.
De functie/disfunctie van specifieke neuronale populaties binnen een groter netwerk kan moeilijk te beoordelen zijn vanwege hun intrinsieke connectiviteit en complexiteit3. Echter, er is vaak een behoefte om te bestuderen van verschillende neuronale populaties als gevolg van celtypespecifieke ziekten met complexe pathologieën, zoals die in verband met verminderde cellulaire eiwit homeostase. In C. eleganskunnen specifieke neuronale populaties genetisch gemanipuleerd worden, waardoor faciele observatie in vivo mogelijk is. Het zenuwstelsel van C. elegans bestaat voornamelijk uit neuronen, met een klein percentage gliacellen. Bij volwassen hermafrodiet wormen zijn er ongeveer 302 neuronen, onderverdeeld in meer dan 100 verschillende klassen2,10. Neuronen zoals cholinerge neuronen overheersingen in neuromusculaire knooppunten, terwijl Dopaminerge neuronen voornamelijk betrokken zijn bij sensatie10,11. Aangezien zowel motorische activiteit als zintuiglijke vaardigheden afnemen met de leeftijd, is het belangrijk om mechanistische inzichten over defecten in deze individuele neuronen te detail te bekijken11,12. Als zodanig is er behoefte aan een eenvoudige en robuuste methode om intacte cellen van belang te isoleren voor latere ex vivo-studies.
Hier beschrijven we een geoptimaliseerde effectieve methode voor de snelle isolatie van specifieke neuronale cellen die groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken uit C. elegans. Deze isolatiemethode kan worden uitgevoerd op larvale, juveniele of volwassen wormen. Isolatie van cellen van larvale Worms werd eerder gepubliceerd door Zhang et al.13 en zal hier niet worden besproken. Een belangrijke opmerking hier is dat alle wormen in dezelfde levensfase moeten zijn om overmatige vertering van het dier of besmetting van dieren in verschillende levensstadia te voorkomen. Door zowel enzymatische als mechanische verstoring van de nematode cuticula, een exoskelet hoog in collageen en andere structurele eiwitten, kan een grote verscheidenheid aan cellen worden geïsoleerd13,14. Cellen kunnen vervolgens worden geïsoleerd via Flowcytometrie of antilichaam gelabelde magnetische kralen. Typisch, RNA is geïsoleerd via een fenol en guanidine isothiocyanaat methode om te zorgen voor de verrijking van de gewenste celpopulatie15. Met veel zorg kunnen deze geïsoleerde cellen worden gehandhaafd in een kweek kolf of multi-well gerecht. Deze methode vertegenwoordigt een unieke en krachtige tool in de studie van specifieke neuronen en heeft de capaciteit om te isoleren van levende en functionele cellen voor verdere culturing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding en verzameling van oude wormen voor celisolatie
Opmerking: hieronder wordt uitgelegd is de isolatie van cholinerge neuronen van de transgene UNC-17:: GFP stam (OH13083) verkregen uit de Caenorhabditis genetica Center (CGC) stam repository aan de Universiteit van Minnesota. Het is noodzakelijk om steriele omstandigheden te handhaven om besmetting van schimmels of bacteriën te voorkomen.
- Bereid en synchroniseer wormen via de bleken methode zoals beschreven door T. stiernagle16. Voor verouderings experimenten, plaat wormen op nematode groeimedium (NGM) platen met 25 μM wateroplossing van fluorodeoxyuridine (FuDR) om de eierproductie te verminderen en het broedeieren te arresteren. Inspecteer de agar-platen regelmatig om verontreiniging of Eier eitjes te voorkomen, omdat dit onbetrouwbare resultaten zal opleveren.
Opmerking: voor UNC-17:: GFP-cellen, meestal 3 100 mm x 15 mm NGM-platen worden gebruikt om een voldoende hoeveelheid cellen van belang te isoleren16. - Verzamel wormen en bereid buffers voor voor celisolatie.
- Verzamel wormen in een conische buis van 15 mL. Was wormen van plaat met 1,5 mL M9 buffer (1 mM MgSO4, 85 mm nacl, 42 mm na2HPO4· 7H2O, 22 mm KH2po, pH 7,0) en Centrifugeer gedurende 5 min bij 1.600 x g. Gooi supernatant weg en was wormen met 1 mL M9-buffer. Herhaal centrifugeren en was voor een totaal van vijf keer om zo veel mogelijk E. coli besmetting te verwijderen.
Opmerking: het toevoegen van antibiotica (50 μg/mL), zoals ampicilin, bij deze stap kan helpen bij het verminderen van bacteriële besmetting. - Voor twee monsters, bereid 2 mL natriumdodecylsulfaat-dithiothreitol (SDS-DTT) lysisbuffer: 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) en 3% (w/v) sucrose.
- Bereid 15 mL isolatie buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mm MgCl2, 25 mm hepes [pH 7,3]) en bewaar het op ijs.
NB: zowel de SDS-DTT lysis buffer als de isolatie buffer moeten vóór elk experiment vers worden gemaakt.
- Verzamel wormen in een conische buis van 15 mL. Was wormen van plaat met 1,5 mL M9 buffer (1 mM MgSO4, 85 mm nacl, 42 mm na2HPO4· 7H2O, 22 mm KH2po, pH 7,0) en Centrifugeer gedurende 5 min bij 1.600 x g. Gooi supernatant weg en was wormen met 1 mL M9-buffer. Herhaal centrifugeren en was voor een totaal van vijf keer om zo veel mogelijk E. coli besmetting te verwijderen.
- Verstoring van de cuticula en eencellige isolatie
- Centrifuge dieren verzameld in stap 1.2.1 gedurende 5 min bij 1.600 x g. Verwijder alle supernatant-en onderbreek wormen in 1 mL M9-media en breng deze over naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
- Pelletwormen met centrifugeren bij 1.600 x g gedurende 5 min.
- Voeg 200 μL SDS-DTT lysisbuffer toe aan wormen en inincuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Wormen moeten lijken te zijn "winkled" langs het lichaam als bekeken onder een lichte Microscoop.
Opmerking: langdurige blootstelling aan SDS-DTT lysisbuffer kan resulteren in de dood van wormen, die kunnen worden bewaakt door het observeren van wormen. Wormen die dood zijn, zullen worden gerekt en zullen niet krullen. - Voeg 800 μL ijskoude isolatie buffer toe en meng door zachtjes met de buis te flikken.
- Pelletwormen gedurende 1 minuut bij 13.000 x g bij 4 °c, verwijder supernatant en was met 1 ml isolatie buffer.
- Herhaal stap 1.3.5 voor een totaal van vijf keer, elke keer dat u de isolatie buffer zorgvuldig verwijdert.
- Voeg 100 μL protease mengsel toe van Streptomyces griseus (15 mg/ml) (tabel van de materialen) opgelost in isolatie buffer tot de pellet en inincuberen gedurende 10 − 15 min bij RT.
Opmerking: net als bij de SDS-DTT lysisbuffer kan de verlengde vertering van protease resulteren in een overmatige decolleté van eiwitten langs het plasma membraan, waardoor isolatie van oppervlak blootgestelde GFP via magnetische kralen wordt voorkomen. - Tijdens incubatie met protease mengsel, mechanische verstoring toepassen door Pipetteer monsters op en neer tegen de onderkant van de 1,5 mL micro centrifugebuis met een 200 μL micropipet punt voor ~ 60 − 70 keer. Houd de pipetpunt tegen de wand van de microcentrifuge buis met constante druk om cellen correct te ontkoppelen.
- Om het stadium van de spijsvertering te bepalen, verwijdert u een klein volume (~ 1 − 5 μL) van het verterings mengsel, laat u het op een glazen glijbaan vallen en inspecteert u het met behulp van een weefselkweek Microscoop. Na 5 − 7 minuten incubatie moeten worm fragmenten zichtbaar gereduceerde cuticula hebben en een slurrie van cellen zal gemakkelijk zichtbaar zijn.
- Stop reactie met 900 μL commercieel verkrijgbare koude Leibovita's L-15 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en penicillaire-streptomycine (eindconcentratie bij 50 U/mL penicillaire en 50 μg/mL streptomycine).
- Pellet geïsoleerde fragmenten en cellen door centrifugeren gedurende 5 min bij 10.000 x g bij 4 °c. Was de gepileerde cellen twee keer meer dan 1 ml koude L-15-aangevuld media om ervoor te zorgen dat overtollig vuil en schubben worden verwijderd.
- Resubreng cellen in 1 mL L-15-aangevuld met media en laat 30 minuten op ijs. Neem de toplaag, ongeveer 700 − 800 μL, naar een micro centrifugebuis. Deze laag bevat cellen zonder celpuin en zal worden gebruikt in de daaropvolgende isolatie van cellen van belang.
- Volg de instructies van de fabrikant en gebruik een geautomatiseerd cellenteller of hemocytometer om de celdichtheid van 10 − 25 μL geïsoleerde cellen te meten.
2. isolatie van GFP-positieve cellen via Flowcytometrie of anti-GFP magnetische kralen
Opmerking: er zijn twee methoden die kunnen worden geïmplementeerd om specifieke celtypen te isoleren. De eerste methode is het gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), terwijl de tweede methode antilichamen-geconjugeerde magnetische kralen gebruikt om cellen te scheiden die afzonderlijke plasma membraan-gelokaliseerde eiwitten uitdrukken. De laatste methode vereist de lokalisatie van GFP aan het plasma membraan, dus beschikbaar voor interactie met de met antilichamen gekoppelde magnetische kraal.
- Isolatie van GFP-positieve cellen doorstroming cytometrie
- Van geïsoleerde celsuspensie verzameld in stap 1.3.12, centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 10.000 x g bij 4 °c. Gooi supernatant weg en onderbreek cellen in L-15-aangevuld medium tot een celdichtheid van niet meer dan 6 x 106 cellen/ml om overbelasting van de flow cytometer te voorkomen.
- Sorteer cellen op GFP-positieve expressie met behulp van een flow-cytometer die monsters kan sorteren. GFP-negatieve cellen kunnen worden gebruikt als besturingselement voor specifieke analyse van niet-celtype.
Opmerking: zoals hierboven vermeld, kan een alternatieve benadering voor het isoleren van GFP-positieve cellen worden gebruikt als de GFP-gelabelde proteïne van belang is gelokaliseerd in het plasma membraan van de cellen. In dit geval kan het in paragraaf 2,2 beschreven protocol worden gebruikt.
- Isolatie van GFP-positieve cellen via anti-GFP magnetische kralen
- Van geïsoleerde celsuspensie verzameld in stap 1.3.12, centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 10.000 x g bij 4 °c. Gooi de supernatant weg en onderbreek de cellen in 485 μL L-15-aangevuld medium. Voeg 15 μL ddH2O voorgewassen α-GFP-antilichamen-gekoppelde magnetische parels toe aan de oplossing.
- Incuberen cellen met de magnetische kraal slurry bij 4 °C gedurende 1 uur met zeer zacht draaien. Overmatig draaien zal de cellen beschadigen.
- Na incubatie, centrifugeer monster gedurende 5 minuten bij 10.000 x g bij 4 °c, vervolgens was pellet 2x met 1 ml L-15-aangevuld medium om GFP-negatieve cellen te verwijderen.
- Culturing van geïsoleerde cellen
- Plaat geïsoleerde cellen in een steriele 6-well multi-well plaat.
Opmerking: deze platen kunnen worden gecoat met pinda-lectine om de celhechting te verhogen; Als cellen echter onmiddellijk moeten worden gebruikt, kan deze stap worden genegeerd. - Plaats de plaat in een plastic bakje en inbroed de cellen bij 20 °C met een vochtig doekje of weke delen (Voeg 50 μg/mL ampicillaire toe aan ddH2O om te zorgen voor geen bacteriële groei bij het afvegen) om vocht aan cellen toe te voegen. Niet incueren in een CO2 -incubator, omdat verhoogde co2 -niveaus de cellen kunnen beschadigen.
- Plaat geïsoleerde cellen in een steriele 6-well multi-well plaat.
3. fluorescerende beeldvorming van geïsoleerde GFP-positieve cellen
- Zet de TL-lamp van een omgekeerde Microscoop met fluorescentie bevestiging aan en laat het ongeveer 10 minuten opwarmen.
- Verwijder celkweek uit de incubator en zet op het podium van omgekeerde Microscoop met florescentie gehechtheid. Schuif het GFP-filter in de groeven onder het podium van de Microscoop.
- Bekijk de cellen met een vergroting van 50x. Met succes geïsoleerde GFP-positieve cellen zullen gemakkelijk zichtbaar zijn. Maak Foto's met de camerabevestiging op de Microscoop.
4. extractie van RNA uit geïsoleerde cellen
Opmerking: extractie van RNA moet onmiddellijk na celisolatie worden uitgevoerd om een hoge kwaliteit van het materiaal te garanderen. Geïsoleerd RNA kan worden gebruikt voor de productie van cDNA en de daaropvolgende meting van transcript niveaus door kwantitatieve PCR (qPCR). Alle buisjes, tips en reagentia moeten RNase-vrij zijn en de werkruimte moet ethanol-gewassen zijn voorafgaand aan RNA-extractie.
- Van geïsoleerde cellen die in stap 2.1.2 zijn verzameld, centrifugeer cellen in een 1,5 mL steriele, RNase vrije microcentrifuge tube gedurende 5 min bij 10.000 x g bij 4 °c. Als cellen worden geïsoleerd via magnetische kralen, volg celverzameling zoals hierboven vermeld.
- Verwijder met behulp van een micro pipet supernatant uit gecentrifugeerde microcentrifuge buis en voeg 100 μL M9 medium toe om L-15-aangevuld medium weg te spoelen. Centrifugeer cellen 5 min bij 10.000 x g bij 4 °c en verwijder supernatant. Om er zeker van te zijn dat alle media worden verwijderd, herhaalt u voor een totaal van drie wasgoed elke keer dat u supernatant zorgvuldig verwijdert.
- Voeg 1 mL fenol-en guanidine-isothiocyanaatoplossing (tabel met materialen) toe aan cellen en Pipetteer de suspensie voorzichtig op en neer. Inbroed het mengsel bij RT gedurende 5 min.
- Voeg na incubatie 250 fenol en guanidine isothiocyanaatoplossing toe
- Centrifugeer de oplossing gedurende 5 minuten bij 10.000 x g bij 25 °c.
- Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk van de bovenste waterige laag met een micropipet, zonder de onderste organische lagen te verstoren, en breng de onderste laag over naar een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL RNase. Voeg aan de nieuwe buis 500 μL isopropanol toe en meng door de buis te inverteren. Inincuberen deze oplossing bij RT gedurende 5 min.
- Centrifugeer de buis bij 14.000 x g gedurende 20 minuten bij 25 °c.
- Terwijl u de monsters op ijs houdt, verwijdert u zoveel mogelijk isopropanol met een micro pipet en voegt u voorzichtig 1 mL ethanol 70% (v/v) in RNase-Free ddH2O toe aan de buis. Zorg ervoor dat u de oplossing niet direct op de bodem van de buis uitwerpt; Breng ethanol/water mengsel aan de zijkant van de buis.
- Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 25 °c.
- Verwijder de meeste ethanol en lucht drogen op ijs voor 3 − 5 min.
Opmerking: ethanol moet na deze stap worden verwijderd; een zorgvuldige inspectie van de bodem van de buis is echter belangrijk om er zeker van te zijn dat er geen ethanol overblijft. - Nadat de buis lucht gedroogd is, voeg dan 15 − 20 μL RNase-vrij ddH2O toe en meet de RNA-concentratie en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer bij een golflengte van 260 nm. De zuiverheid van het monster moet worden gemeten als een verhouding van 260 nm/280 nm. Deze verhouding moet ongeveer > 2.
Opmerking: geïsoleerd RNA kan worden bevroren en opgeslagen bij-20 °C. Het is echter zeer preferentieel om een cDNA-synthese pakket zo snel mogelijk te gebruiken om de productie van cDNA van hoge kwaliteit te garanderen. Kwantitatieve PCR kan volgen met instructies van de fabrikant van de Thermocycler die in het laboratorium wordt gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier beschreven protocol zorgt voor specifieke isolatie van UNC-17:: GFP-positieve cholinerge neuronen van de rondworm C. elegans voor latere ex vivo studies zoals celtypespecifieke genexpressie profilering en uiteindelijke kortdurende kweek voor Patch-clamp elektrofysiologie metingen.
Figuur 1 toont UNC-17:: GFP-positieve cholinerge neuronen in hun normale instelling. Het UNC-17- gen wordt uitgedrukt in de C. elegans body en codes voor een vesiculaire acetylcholine transmembraan Transporter17. De uitdrukking van dit gen kan worden waargenomen in hoofd-, middenlichaam-en staart neuronen en neuron projecties.
Figuur 2a toont een picturaal overzicht van de neuron-isolatie procedure die wordt beschreven in de sectie methoden. Stap één is om de wormen te synchroniseren en te kweken. Daarnaast toont Figuur 2b representatieve fluorescentie micro foto's van UNC-17:: GFP-positieve neuronen na isolatie en respectieve negatieve controle van ongewijzigde N2 wild type dieren. Geïsoleerde cellen kunnen tot 3 dagen in leven blijven, wanneer aangevuld met Leibovita's L-15 medium en 10% FBS.
Figuur 3 toont representatieve gegevens van qPCR van GFP die cholinerge neuronen uitdrukken, evenals GFP-uitdrukken van spiercellen. Na succesvolle sortering van cellen door middel van een van beide methoden, RNA werd geïsoleerd via een fenol en guanidine isothiocyanaat methode waarna cDNA werd geproduceerd met behulp van een synthese Kit. Expressie van cholinerge neuron-specifieke genen, TPH-1 en SNB-1, een tryptofaan-hydroxylase en synaptische blaasje Transporter, respectievelijk, is verheven in UNC-17::GFP geïsoleerde cellen, maar is niet aanwezig in Myo-3::GFP geïsoleerde cellen. De inverse is waar met de uitdrukking van de spier-specifieke myosin zware keten transcriptie van Myo-2. De uitdrukking van het laatste gen is beperkt tot geïsoleerde spiercellen, maar niet de geïsoleerde cholinerge cellen.
Figuur 1: gereconstrueerd beeld van cholinerge neuronen in eendagoud wild type transgene dieren uitdrukken UNC-17:: GFP Reporter. Het beeld werd samengesteld uit vier afzonderlijke confocale fluorescentie beelden van dezelfde worm, die de lengte van het hele dier bedekt. De schaalbalk van elke afzonderlijke afbeelding is 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: workflow van celisolatie en representatieve GFP-uitdrukken van cellen geïsoleerd van UNC-17::GFP-stam. (A) Schematische weergave van de workflow voor de isolatie van specifieke celpopulaties verrijkt in UNC-17:: GFP-uitdrukken van cholinerge neuronen uit respectieve C. elegans transgene stammen. B) representatieve fluorescentie beelden die de aanwezigheid van het GFP-signaal in de geïsoleerde UNC-17:: GFP-positieve cellen aantonen. Merk op dat de afbeelding een enkel focal vlak toont. Schaalbalk = 10 μm. Figuur 2B wordt gereproduceerd met toestemming van het Journal of Cell Science en is gepubliceerd door Germany et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve qPCR-analyse van UNC-17-neuron specifieke markers(TPH-1, UNC-47 en SNB-1) in het geheel-dier versus UNC-17:: GFP reporter celisolaten ter bevestiging van specifieke verrijking van cholinerge neuronen van belang. Extra negatieve controles gebruikt hier waren Myo-3:: GFP reporter-uitdrukken van spiercellen, die was geïsoleerd volgens hetzelfde protocol. Gegevens tonen gemiddelde waarden ± SD (n = 3 biologische replicaten). * p < 0,05; * * p < 0,01; p < 0,001 door gepaarde t -toets. Dit cijfer is gewijzigd van Germany et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De rondworm C. elegans is een gevestigde en krachtige model voor het bestuderen van de neuronale gezondheid en ziekte2. Met ruime genetische hulpmiddelen om deze dieren te manipuleren en beheersbare hoeveelheid nauwkeurig in kaart gebrachte neuron types, kan een groot deel van de gegevens worden verzameld met een relatief kleine hoeveelheid materiaal. Hier schetsen we een geoptimaliseerde methode om verschillende neuronen van hele dieren te isoleren. Door de buitenste cuticula-eiwitten van de worm te verstoren, kan een slurry van verschillende celtypen worden geïsoleerd, inclusief neuronen en spiercellen5. Deze geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt in een veelheid van unieke experimenten. De mogelijkheid om ofwel celsortering te gebruiken door middel van Flowcytometrie of met antilichaam gelabelde magnetische parels maakt een adaptieve techniek afhankelijk van de parameters van een specifiek experiment. Het uitpakken van RNA van een specifieke C. elegans celtype maakt ook een meer grondig onderzoek en een mechanistisch begrip van verschillende cellulaire processen mogelijk.
Hier worden kritische stappen besproken die nauwlettend moeten worden gevolgd: 1) veroudering en goed gevoede wormen oogsten van 25 μM FuDR-platen; 2) tijd in SDS-DTT incubatie of behandeling met protease mengsel; 3) selectie van GFP-positieve cellen. Ten eerste, tijdens het verouderen van de wormen, is het noodzakelijk om ijverig te zijn om ervoor te zorgen dat alle eieren die worden gelegd niet uitkomen, omdat dit de leeftijd heterogeniteit in de verzamelde wormen zal veroorzaken, waardoor significante variabiliteit in gegevens ontstaat. De wasstappen bij het oogsten van wormen voor isolatie zijn ook noodzakelijk om ervoor te zorgen dat dode of onvolgroeide dieren niet worden opgevangen. Ten tweede kan overmatige incubatie van wormen in de SDS-DTT-buffer ongewenste afbraak van belangrijke cellulaire componenten en toxiciteit voor de wormen veroorzaken, waardoor isolatie van doelceltypen wordt voorkomen. Het behoud van de levensvatbaarheid van de cel is essentieel voor een succesvolle RNA-extractie van of verdere kweek van geïsoleerde cellen op korte termijn. Omdat de meeste neuronale cellen delicaat zijn, kan een te zware behandeling tijdens de SDS-DTT-buffer of de behandeling met protease mengsels resulteren in massale schade aan deze cellen. Als een stress response traject het doelwit van het experiment is, kunnen de omstandigheden van incubaties enigszins worden gewijzigd omdat de sterk reducerende kracht van DTT een verbeterde expressie van bepaalde stressrespons genen kan veroorzaken. In dit geval is het belangrijk om met succes celpellets met L-15-aangevuld medium te wassen om de reactie te stoppen en de cellen snel opnieuw te leveren met voedingsstoffen. Ten slotte, zorgvuldig kiezen welke selectie stap is het meest geschikt is voor het type cel van belang zal toestaan voor maximale herstel van deze cellen. Evenzo, gezien cellulaire lokalisatie van celtypespecifieke markers kunnen onderzoekers helpen bij het kiezen van de meest optimale celverrijking aanpak. Het gebruik van flow cytometrie zal een meer homogene en levensvatbare celcultuur opleveren, terwijl het gebruik van anti-GFP magnetische kralen minder tijdrovend en arbeidsintensief is.
Het is belangrijk op te merken dat de hier beschreven methode heeft enkele beperkingen. Ten eerste moet de robuuste expressie van GFP in de gewenste celtypen worden geverifieerd om te zorgen voor een geschikte isolatie door FACS of met antilichamen gekoppelde magnetische parels. Ten tweede, zelfs zachte cuticula verstoring kan leiden tot een slechte opbrengst of zelfs verlies van bepaalde lichaamscellen, of andere laag-abundantie celpopulaties zoals dat-1 Dopaminerge neuronen. Bij het kiezen van celtypen kan het meer overvloedige celtype meestal een meer succesvolle opbrengst bieden. Niettemin, deze methode kan worden gebruikt voor de isolatie van minder overvloedige celtype populaties ook.
Kortom, de procedure die in dit artikel wordt beschreven, biedt een effectieve methode voor extractie en isolatie van afzonderlijke celtypen van de rondworm C. elegans. De methode is robuust genoeg om te zorgen voor de extractie van RNA, en latere gen profilering, en gevoelig genoeg om toe te staan voor de teelt van de geïsoleerde cellen. Hoewel de exacte methodologie die wordt gebruikt om specifieke groepen cellen te isoleren, kan variëren tussen verschillende celtypen, is de workflow die in dit rapport wordt beschreven over het algemeen effectief en kan deze worden toegepast op vrijwel alle soorten worm cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Dr. Jennifer Fox en de leden van het Khalimonchuk laboratorium voor inzichtelijke commentaren. We erkennen de steun van de National Institutes of Health (R01 GM108975 tot O.K. en T32 GM107001-01A1 tot E.M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
- Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
- Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
- Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
- Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
- Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2005).
- Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
- Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2007).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
- Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).
