Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur einfachen Isolierung bestimmter Gruppen lebender neuronaler Zellen vor, die grünes fluoreszierendes Protein aus transgenen Caenorhabditis elegans-Linien exdrücken. Diese Methode ermöglicht eine Vielzahl von Ex-vivo-Studien, die sich auf bestimmte Neuronen konzentrieren und hat die Fähigkeit, Zellen für eine weitere kurzfristige Kultivierung zu isolieren.
Abstract
Während des Alterungsprozesses akkumulieren viele Zellen hohe Schadensraten, die zu zellulärer Dysfunktion führen, die vielen geriatrischen und pathologischen Bedingungen zugrunde liegt. Postmitotische Neuronen stellen einen großen Zelltyp dar, der vom Altern betroffen ist. Obwohl mehrere Säugetiermodelle der neuronalen Alterung existieren, sind sie anspruchsvoll und teuer zu etablieren. Der Rundwurm Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modell zur Untersuchung der neuronalen Alterung, da diese Tiere eine kurze Lebensdauer, eine verfügbare robuste genetische Werkzeugkiste und ein gut katalogisiertes Nervensystem haben. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht eine nahtlose Isolierung bestimmter Zellen auf der Grundlage der Expression eines transgenen grünen Fluoreszenzproteins (GFP). Transgene Tierlinien, die GFP unter unterschiedlichen, zelltypspezifischen Promotoren exzessiieren, werden verdaut, um die äußere Nagelhaut zu entfernen, und sanft mechanisch gestört, um Gülle zu produzieren, die verschiedene Zelltypen enthält. Die von Interesse geprägten Zellen werden dann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder durch anti-GFP-gekoppelte magnetische Perlen von Nicht-Zielzellen getrennt. Die isolierten Zellen können dann für eine begrenzte Zeit kultiviert oder sofort für zellspezifische Ex-vivo-Analysen wie Transkriptionsanalysen durch quantitative PCR in Echtzeit verwendet werden. Somit ermöglicht dieses Protokoll eine schnelle und robuste Analyse zellspezifischer Reaktionen innerhalb verschiedener neuronaler Populationen in C. elegans.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten war der metazoische Modellorganismus Caenorhabditis elegans ein enormer Vorteil bei der Untersuchung von Neuronen, neuronalen Schaltkreisen und seiner Rolle bei physiologischen und Verhaltensreaktionen sowie alterungsassoziierten neurodegenerativen Krankheiten. Ein einzigartiges Merkmal von C. elegans ist, dass die Tiere transparent sind, so dass die Abstammung aller erwachsenen somatischen Zellen abgebildet werden kann1. C. elegans beherbergt auch überschaubare Menge an Neuronen, was dazu führt, dass die Morphologie und Konnektivität des Nervensystems gut verstanden wird2. Die invariante Zellabstammung, die kurze Lebensdauer und die Fülle der genetischen Werkzeuge mit hohem Durchsatz, die für C. elegans zur Verfügung stehen, machen es zu einem idealen Modellorganismus für die Untersuchung des Alterns in verschiedenen neuronalen Populationen.
Alterung von Neuronen und neurodegenerative Störungen sind komplex, und jede Störung hat einzigartige pathologische Signaturen damit verbunden. Jedoch, für viele dieser Erkrankungen, wie Parkinson und Alzheimer-Krankheit, ein gemeinsames Merkmal ist die fortschreitende Last von falsch gefalteten Proteinen3,4,5. Bei beiden Krankheiten verrenken sich Proteine und aggregieren innerhalb der Zelle, um Toxizität zu verursachen, was letztlich zum Zelltod4,5führt. Für die richtige Alterung der Neuronen ist die Homöostase der Mitochondrien, genauer gesagt Proteinhomöostase, wichtig, da Störungen und Dyshomöostase zu Neurodegeneration6,7,8führen können. Die Zellen sind mit verschiedenen Mechanismen zur Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase ausgestattet, wobei einer die entfaltete Proteinantwort (UPR) ist – ein klassischer Signalweg, bei dem Signale von endoplasmatischem Retikulum (ER) intrazelluläre Signalkaskaden aktivieren, was zu einer transkriptionellen Antwort9. Ähnlich wie dieser UPRERzeigen Metazoen eine ähnliche Reaktion auf den Verlust der mitochondrialen Proteinhomöostase, der sogenannten mitochondrialen UPR (UPRmt)7,8. C. elegans scheint der basalste Organismus zu sein, der einen bestätigten und genau definierten UPR mt-Signalweghat 7.
Die Funktion/Dysfunktion bestimmter neuronaler Populationen innerhalb eines größeren Netzwerks kann aufgrund ihrer intrinsischen Konnektivität und Komplexität schwierig zu beurteilen sein3. Jedoch, Es besteht oft die Notwendigkeit, verschiedene neuronale Populationen aufgrund von Zelltyp-spezifischen Erkrankungen mit komplexen Pathologien zu studieren, wie diejenigen, die mit beeinträchtigten zellulären Protein Homöostase verbunden. In C. eleganskönnen spezifische neuronale Populationen genetisch manipuliert werden, was eine einfache Beobachtung in vivo ermöglicht. Das Nervensystem von C. elegans besteht in erster Linie aus Neuronen, mit einem kleinen Prozentsatz von Gliazellen. Bei erwachsenen Hermaphroditwürmern gibt es etwa 302 Neuronen, unterteiltin über 100 verschiedene Klassen 2,10. Neuronen wie cholinerge Neuronen überwiegen in neuromuskulären Knoten, während dopaminerge Neuronen sind in erster Linie in Sensationbeteiligt 10,11. Da sowohl die motorische Aktivität als auch die sensorischen Fähigkeiten mit dem Alter abnehmen, ist es wichtig, mechanistische Erkenntnisse über Defekte in diesen einzelnen Neuronen11,12zu beschreiben. Daher ist eine einfache und robuste Methode erforderlich, um intakte Zellen von Interesse für nachfolgende Ex-vivo-Studien zu isolieren.
Hier beschreiben wir eine optimierte effektive Methode zur schnellen Isolierung bestimmter neuronaler Zellen, die grünes fluoreszierendes Protein (GFP) aus C. elegans exdrücken. Diese Isolationsmethode kann bei Larven-, Jung- oder Erwachsenenwürmern durchgeführt werden. Die Isolierung von Zellen aus Larvenwürmern wurde zuvor von Zhang et al.13 veröffentlicht und wird hier nicht diskutiert. Ein wichtiger Hinweis hier ist, dass alle Würmer im gleichen Lebensstadium sein müssen, um eine Überverdauung des Tieres oder eine Kontamination durch Tiere in verschiedenen Lebensstadien zu verhindern. Durch enzymatische und mechanische Störung der Nematodenhaut, eines kollagenreichen Exoskeletts und anderer struktureller Proteine kann eine Vielzahl von Zellen isoliert werden13,14. Zellen können dann über Durchflusszytometrie oder Antikörper mit magnetischen Perlen isoliert werden. Typischerweise wird RNA über eine Phenol- und Guanidin-Isothiocyanat-Methode isoliert, um die Anreicherung der gewünschten Zellpopulation15zu gewährleisten. Mit viel Sorgfalt können diese isolierten Zellen in einem Kulturkolben oder Multi-Well-Gericht gepflegt werden. Diese Methode stellt ein einzigartiges und leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung bestimmter Neuronen dar und hat die Fähigkeit, lebende und funktionelle Zellen für die weitere Kultivierung zu isolieren.
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Protocol
1. Vorbereitung und Sammlung von gealterten Würmern zur Zellisolierung
HINWEIS: Im Folgenden wird die Isolierung von cholinergen Neuronen aus dem transgenen Unc-17::GFP-Stamm (OH13083) aus dem Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Stammlager der University of Minnesota erklärt. Es ist zwingend notwendig, sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, um eine Kontamination durch Pilze oder Bakterien zu verhindern.
- Vorbereiten und Synchronisieren von Würmern über die Bleichmethode, wie von T. Stiernagle16beschrieben. Für Alterungsexperimente, Plattenwürmer auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) Platten mit 25 M Wasserlösung von Fluorodeoxyuridin (FuDR) zur Verringerung der Eiproduktion und Abstecken von Eischraffur. Überprüfen Sie agar platten regelmäßig, um Kontamination oder Eibrühe zu verhindern, da dies zu unzuverlässigen Ergebnissen führt.
HINWEIS: Für unc-17::GFP-Zellen werden in der Regel drei 100 mm x 15 mm NGM-Platten verwendet, um eine ausreichende Menge an Voninteresse reichenden Zellen zu isolieren16. - Sammeln Sie Würmer und bereiten Sie Puffer für die Zellisolierung vor.
- Sammeln Sie Würmer in einem 15 ml konischen Rohr. Waschwürmer von Platte mit 1,5 ml M9 Puffer (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4-7H2O, 22 mM KH2PO, pH 7,0) und Zentrifuge für 5 min bei 1.600 x g. Überstand entsorgen und Würmer mit 1 ml M9-Puffer waschen. Zentrifugation wiederholen und insgesamt fünfmal waschen, um so viel E. coli-Kontamination wie möglich zu entfernen.
HINWEIS: Das Hinzufügen von Antibiotika (50 g/ml), wie Z. B. Ampicillin, kann in diesem Schritt dazu beitragen, die bakterielle Kontamination zu reduzieren. - Für zwei Proben 2 ml Natriumdodecylsulfat-Dithiothreitol (SDS-DTT) Lysepuffer vorbereiten: 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) und 3% (w/v) Saccharose.
- 15 ml Isolationspuffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES [pH 7.3]) vorbereiten und auf Eis lagern.
HINWEIS: Sowohl der SDS-DTT-Lysepuffer als auch der Isolationspuffer müssen vor jedem Experiment neu gemacht werden.
- Sammeln Sie Würmer in einem 15 ml konischen Rohr. Waschwürmer von Platte mit 1,5 ml M9 Puffer (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4-7H2O, 22 mM KH2PO, pH 7,0) und Zentrifuge für 5 min bei 1.600 x g. Überstand entsorgen und Würmer mit 1 ml M9-Puffer waschen. Zentrifugation wiederholen und insgesamt fünfmal waschen, um so viel E. coli-Kontamination wie möglich zu entfernen.
- Cuticle Disruption und Single-Cell-Isolation
- Zentrifugentiere, die in Schritt 1.2.1 für 5 min bei 1.600 x ggesammelt wurden. Entfernen Sie alle Überstand und hängen Würmer in 1 ml M9-Medien und übertragen Sie in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
- Pelletwürmer mit Zentrifugation bei 1.600 x g für 5 min.
- Fügen Sie den Würmern 200 L SDS-DTT-Lysepuffer hinzu und brüten Sie 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Würmer sollten am Körper "gezwwinket" erscheinen, wenn sie unter einem Lichtmikroskop betrachtet werden.
HINWEIS: Eine längere Exposition gegenüber SDS-DTT-Lysepufferkannen kann zum Tod von Würmern führen, die durch beobachtung von Würmern überwacht werden können. Würmer, die tot sind, werden sich verlängeren und nicht krümmen. - Fügen Sie 800 L eiskalten Isolationspuffer hinzu und mischen Sie, indem Sie das Rohr sanft flicken.
- Pelletwürmer für 1 min bei 13.000 x g bei 4 °C, Überstand entfernen und mit 1 ml Isolationspuffer waschen.
- Wiederholen Sie Schritt 1.3.5 insgesamt fünfmal, wobei Sie jedes Mal den Isolationspuffer sorgfältig entfernen.
- 100 L Protease-Mischung aus Streptomyces griseus (15 mg/ml) (Materialtabelle)im Isolationspuffer gelöst in das Pellet geben und bei RT für 10 bis 15 min inkubieren.
HINWEIS: Wie beim SDS-DTT-Lysepuffer kann die erweiterte Proteaseverdauung zu einer übermäßigen Spaltung der Proteine entlang der Plasmamembran führen und die Isolierung von exponiertem GFP-Oberflächenmittel über magnetische Perlen verhindern. - Während der Inkubation mit Protease-Gemisch, mechanische Störungen durch Pipettieren von Proben nach oben und unten gegen den Boden des 1,5 ml Mikrozentrifugenrohrs mit einer 200-L-Mikropipette-Spitze für 60-70-mal. Halten Sie die Pipettenspitze an der Wand des Mikrozentrifugenrohrs mit konstantem Druck, um Zellen richtig zu trennen.
- Um das Stadium der Verdauung zu bestimmen, entfernen Sie ein kleines Volumen (ca. 1,5 l) des Verdauungsgemisches, lassen Sie es auf einem Glasschlitten fallen und inspizieren Sie es mit einem Gewebekulturmikroskop. Nach 5-7 min Inkubation sollten Wurmfragmente sichtbar reduzierte Nagelhaut haben und eine Gülle von Zellen gut sichtbar sein.
- Haltereaktion mit 900 l handelsüblichen kalten Leibovitz-Mediums L-15, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration bei 50 U/ml Penicillin und 50 g/ml Streptomycin).
- Pellet isolierte Fragmente und Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 10.000 x g bei 4 °C. Waschen Sie die pelletierten Zellen mit 1 ml kalten L-15-ergänzten Medien zweimal mehr, um sicherzustellen, dass überschüssiger Schmutz und Nagelhaut entfernt werden.
- Pelletzellen in 1 ml L-15-ergänzungen Medien wieder aufsetzen und 30 min auf Demeis lassen. Nehmen Sie die oberste Schicht, ca. 700 x 800 L, in ein Mikrozentrifugenrohr. Diese Schicht enthält Zellen ohne Zellabfall und wird bei der anschließenden Isolierung von Interessenszellen verwendet.
- Verwenden Sie nach den Anweisungen des Herstellers einen automatisierten Zellzähler oder ein Hämozytometer, um die Zelldichte von isolierten Zellen von 10 bis 25 L zu messen.
2. Isolierung von GFP-positiven Zellen über Durchflusszytometrie oder Anti-GFP-Magnetperlen
HINWEIS: Es gibt zwei Methoden, die bereitgestellt werden können, um bestimmte Zelltypen zu isolieren. Die erste Methode ist die Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS), während die zweite Methode antikörperkonjugierte magnetische Perlen verwendet, um Zellen zu bündeln, die unterschiedliche Plasmamembran-lokalisierte Proteine exezieren. Letzteremethode erfordert die Lokalisierung von GFP in die Plasmamembran und steht somit für die Wechselwirkung mit der antikörpergekoppelten Magnetperle zur Verfügung.
- Isolierung von GFP-positiven Zellen durch Durchflusszytometrie
- Aus isolierter Zellsuspension, die in Schritt 1.3.12 gesammelt wird, Zentrifugenzellen für 5 min bei 10.000 x g bei 4 °C. Verwerfen Sie Überstand und suspendieren Sie Pelletzellen in L-15-ergänztem Medium auf eine Zelldichte von nicht mehr als 6 x 106 Zellen/ml, um eine Überlastung des Durchflusszytometers zu vermeiden.
- Sortieren Sie Zellen nach GFP-positiver Expression mit einem Durchflusszytometer, das Proben sortieren kann. GFP-negative Zellen können als Steuerelement für die typspezifische Analyse ohne Zellen verwendet werden.
HINWEIS: Wie bereits erwähnt, kann ein alternativer Ansatz zur Isolierung von GFP-positiven Zellen verwendet werden, wenn das GFP-markierte Protein von Interesse auf die Plasmamembran der Zellen lokalisiert wird. In diesem Fall kann das in Abschnitt 2.2 beschriebene Protokoll verwendet werden.
- Isolierung von GFP-positiven Zellen durch Anti-GFP-Magnetperlen
- Aus isolierter Zellsuspension, die in Schritt 1.3.12 gesammelt wird, Zentrifugenzellen für 5 min bei 10.000 x g bei 4 °C. Überstand verwerfen und Zellen in 485 L L L-ergänzungsmedium aussetzen. Fügen Sie der Lösung 15 L ddH2O vorgewaschene, gfP-Antikörper-gekoppelte Magnetperlen hinzu.
- Inkubieren Sie Zellen mit der magnetischen Perlenschlämme bei 4 °C für 1 h mit sehr sanftem Drehen. Übermäßiges Drehen wird die Zellen beschädigen.
- Nach der Inkubation Zentrifugenprobe für 5 min bei 10.000 x g bei 4 °C, dann Pellet 2x mit 1 ml L-15-ergänztem Medium waschen, um GFP-negative Zellen zu entfernen.
- Kultivierung isolierter Zellen
- Platten isolierte Zellen in eine sterile 6-Well-Multi-Well-Platte.
HINWEIS: Diese Platten können mit Erdnusslectin beschichtet werden, um die Zellanhaftung zu erhöhen; Wenn Zellen jedoch sofort verwendet werden sollen, kann dieser Schritt ignoriert werden. - Legen Sie die Platte in einen Kunststoffbehälter und brüten Sie Zellen bei 20 °C mit einem feuchten Wisch- oder Weichteilpapier (50 g/ml Ampicillin zu ddH2O hinzufügen, um kein Bakterienwachstum auf dem Abwischen zu gewährleisten), um den Zellen Feuchtigkeit hinzuzufügen. In einem CO2-Inkubator nicht inkubieren, da erhöhte CO2-Werte die Zellen schädigen können.
- Platten isolierte Zellen in eine sterile 6-Well-Multi-Well-Platte.
3. Fluoreszierende Bildgebung isolierter GFP-positiver Zellen
- Schalten Sie die Leuchtstofflampe eines invertierten Mikroskops mit Fluoreszenzaufsatz ein und lassen Sie sie sich ca. 10 min aufwärmen.
- Entfernen Sie die Zellkultur aus dem Inkubator und setzen Sie auf die Bühne des invertierten Mikroskops mit Blütenszenzanhaftung. Schieben Sie den GFP-Filter in die Rillen unter der Bühne des Mikroskops.
- Sehen Sie sich die Zellen mit einer Vergrößerung von 50x an. Erfolgreich isolierte GFP-positive Zellen sind gut sichtbar. Nehmen Sie Fotos mit dem Kameraaufsatz am Mikroskop auf.
4. Extraktion von RNA aus isolierten Zellen
HINWEIS: Die Extraktion von RNA sollte unmittelbar nach der Zellisolierung durchgeführt werden, um eine hohe Materialqualität zu gewährleisten. Isolierte RNA kann verwendet werden, um cDNA und anschließende Messung der Transkriptionswerte durch quantitative PCR (qPCR) zu erzeugen. Alle Röhren, Spitzen und Reagenzien sollten RNase-frei sein, und der Arbeitsplatz sollte vor der RNA-Extraktion mit Ethanol gewaschen werden.
- Aus isolierten Zellen, die bei Schritt 2.1.2 gesammelt werden, Zentrifugenzellen in einem 1,5 ml sterilen, RNase-freien Mikrozentrifugenrohr für 5 min bei 10.000 x g bei 4 °C. Wenn Zellen über magnetische Perlen isoliert werden, folgen Sie der oben genannten Zellentnahme.
- Mit einer Mikropipette, entfernen Sie Überstand aus zentrifugierten Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie 100 L M9 Medium, um L-15-ergänzung Medium zu waschen. Zentrifugenzellen 5 min bei 10.000 x g bei 4 °C und Entfernen von Überstand. Um sicherzustellen, dass alle Medien entfernt werden, wiederholen Sie für insgesamt drei Waschungen sorgfältig Entfernen Überstand jedes Mal.
- Fügen Sie 1 ml Phenol und Guanidin Isothiocyanat-Lösung (Tabelle der Materialien) zu den Zellen und Pipette die Suspension nach oben und unten sorgfältig. Inkubieren Sie die Mischung bei RT für 5 min.
- Nach der Inkubation 250 Phenol- und Guanidinisothiocyanat-Lösung hinzufügen
- Zentrifugieren Sie die Lösung für 5 min bei 10.000 x g bei 25 °C.
- Entfernen Sie vorsichtig so viel wie möglich von der oberen wässrigen Schicht mit einer Mikropipette, ohne die unteren organischen Schichten zu stören, und übertragen Sie die untere Schicht in ein neues 1,5 ml RNase-freies Mikrozentrifugenrohr. Zum neuen Rohr 500 l Isopropanol hinzufügen und mischen, indem Sie das Rohr invertieren. Inkubieren Sie diese Lösung bei RT für 5 min.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 14.000 x g für 20 min bei 25 °C.
- Während Sie die Proben auf Eis halten, entfernen Sie so viel Isopropanol wie möglich mit einer Mikropipette und fügen Sie dem Rand vorsichtig 1 ml 70% (v/v) Ethanol in RNase-freies ddH2O hinzu. Achten Sie darauf, die Lösung nicht direkt auf den Boden des Rohres zu werfen; Ethanol/Wasser-Gemisch auf die Seite des Rohres auftragen.
- Zentrifuge bei 10.000 x g für 5 min bei 25 °C.
- Entfernen Sie den größten Teil des Ethanols und Luft trocken auf Eis für 3-5 min.
HINWEIS: Ethanol sollte nach diesem Schritt entfernt werden; eine sorgfältige Inspektion des Rohrbodens ist jedoch wichtig, um sicherzustellen, dass kein Ethanol mehr übrig bleibt. - Nachdem die Röhre luftgetrocknet ist, fügen Sie 15 x 20 l RNase-freies ddH2O hinzu und messen Sie die RNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Spektralphotometer bei 260 nm Wellenlänge. Die Reinheit der Probe sollte als 260 nm/280 nm Verhältnis gemessen werden. Dieses Verhältnis sollte ungefähr >2 betragen.
HINWEIS: Isolierte RNA kann bei -20 °C eingefroren und gespeichert werden. Es ist jedoch sehr bevorzugt, so schnell wie möglich ein cDNA-Synthesekit zu verwenden, um eine qualitativ hochwertige cDNA-Produktion zu gewährleisten. Quantitative PCR können mit den Anweisungen des Herstellers des Thermocyclers im Labor zur Verfügung gestellt folgen.
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Representative Results
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine spezifische Isolierung von unc-17::GFP-positive cholinerge Neuronen aus dem Rundwurm C. elegans für nachfolgende Ex-vivo-Studien wie zelltypspezifischeS Genexpressionsprofiling und kurzfristige Kultivierung für Patch-Clamp-Elektrophysiologiemessungen.
Abbildung 1 zeigt unc-17::GFP-positive cholinerge Neuronen in ihrer normalen Einstellung. Das Unc-17-Gen wird im gesamten C. elegans Körper und Codes für einen vesikulären Acetylcholin-Transmembrantransporter17exprimiert. Die Expression dieses Gens kann in Kopf-, Mittelkörper- und Schwanzneuronen und Neuronen-Projektionen beobachtet werden.
Abbildung 2A zeigt einen bildlichen Überblick über das neuronische Isolationsverfahren, das im Abschnitt Methoden beschrieben wird. Schritt eins besteht darin, die Würmer zu synchronisieren und zu kulturieren. Zusätzlich zeigt Abbildung 2B repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Mikroskope von Unc-17::GFP-positive Neuronen nach Isolation sowie die entsprechende Negativkontrolle von unveränderten N2-Wildtiertieren. Isolierte Zellen können bis zu 3 Tage am Leben bleiben, wenn sie mit Leibovitz Es L-15 Medium und 10% FBS ergänzt werden.
Abbildung 3 zeigt repräsentative Daten von qPCR aus GFP, die cholinerge Neuronen sowie GFP-exzessierende Muskelzellen exzessiieren. Nach erfolgreicher Sortierung der Zellen nach beiden Methoden wurde die RNA über ein Phenol- und Guanidin-Isothiocyanat-Verfahren isoliert, nach dem cDNA mit einem Synthesekit hergestellt wurde. Die Expression cholinergen neuronspezifischer Gene, tph-1 und snb-1, einer Tryptophan-Hydroxylase bzw. eines synaptischen Vesikeltransporters, ist in unc-17 erhöht::GFP-isolierte Zellen, aber nicht in myo-3::GFP isolierte Zellen. Das Gegenteil gilt für den Ausdruck der muskelspezifischen Myosin-Schweren Kettentranskriptvon myo-2. Die Expression des letztgenannten Gens ist auf isolierte Muskelzellen beschränkt, nicht aber auf die isolierten cholinergen Zellen.
Abbildung 1: Rekonstruiertes Bild von cholinergen Neuronen bei eintägigen transgenen Wildtieren, die unc-17exezieren::GFP-Reporter. Das Bild wurde aus vier separaten konfokalen Fluoreszenzbildern desselben Wurms zusammengestellt, die die Länge des gesamten Tieres abdecken. Der Maßstabsbalken jedes einzelnen Bildes beträgt 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Workflow der Zellisolation und repräsentative GFP-exzessizierende Zellen, die von unc-17isoliert sind:: GFP-Stamm. (A) Schematische Workflow-Darstellung zur Isolierung spezifischer Zellpopulationen, angereichert mit unc-17::GFP-exezisenden cholinergen Neuronen aus jeweiligen Transgenstämmen von C. elegans. (B) Repräsentative Fluoreszenzbilder, die das Vorhandensein von GFP-Signal in den isolierten unc-17zeigen ::GFP-positiven Zellen. Beachten Sie, dass das Bild eine einzelne Fokusebene zeigt. Skalenbalken = 10 m. Abbildung 2B wird mit Genehmigung des Journal of Cell Science reproduziert und ist von Germany et al.12veröffentlicht worden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative qPCR-Analyse von unc-17-neuronspezifischen Markern (tph-1, unc-47 und snb-1) bei Ganztier versus Unc-17::GFP-Reporterzellisolate, die eine spezifische Anreicherung cholinergen Neuronen von Interesse. Weitere negative Kontrollen, die hier verwendet wurden, waren myo-3::GFP Reporter-exsosende Muskelzellen, die nach demselben Protokoll isoliert worden waren. Die Daten zeigen Mittelwerte bei SD (n = 3 biologische Replikationen). *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001 durch gepaarten t-Test. Diese Zahl wurde von Deutschland et al.12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Der Rundwurm C. elegans ist ein etabliertes und leistungsfähiges Modell zur Untersuchung der neuronalen Gesundheit und Krankheit2. Mit reichlich genetischen Werkzeugen, um diese Tiere zu manipulieren und einer überschaubaren Menge genau kartierter verschiedener Neuronentypen können mit einer relativ geringen Menge Material viele Daten gesammelt werden. Hier skizzieren wir eine optimierte Methode, um verschiedene Neuronen von ganzen Tieren zu isolieren. Durch die Störung der äußeren Nagelhautproteine des Wurms kann eine Gülle verschiedener Zelltypen isoliert werden, einschließlich Neuronen und Muskelzellen5. Diese isolierten Zellen können in einer Vielzahl einzigartiger Experimente eingesetzt werden. Die Möglichkeit, entweder die Zellsortierung durch Durchflusszytometrie oder antikörperbeschriftete Magnetperlen zu verwenden, ermöglicht eine adaptive Technik, die von den Parametern bestimmter Experimente abhängt. Die Extraktion von RNA aus einem bestimmten C. elegans Zelltyp ermöglicht auch eine gründlichere Untersuchung und ein mechanistisches Verständnis verschiedener zellulärer Prozesse.
Hier werden kritische Schritte diskutiert, die genau verfolgt werden müssen: 1) Alterung und Ernte gut gefütterter Würmer aus 25 M FuDR-Platten; 2) Zeit in SDS-DTT-Inkubation oder Behandlung mit Protease-Mischung; 3) Auswahl von GFP-positiven Zellen. Erstens ist es während der Alterung der Würmer unerlässlich, sorgfältig sicherzustellen, dass die gelegten Eier nicht schlüpfen, da dies zu Altersheterogenität in den gesammelten Würmern führt, was zu erheblichen Schwankungen in den Daten führt. Die Waschschritte bei der Ernte von Würmern zur Isolierung sind auch notwendig, um sicherzustellen, dass tote oder unreife Tiere nicht gesammelt werden. Zweitens kann eine übermäßige Inkubation von Würmern im SDS-DTT-Puffer zu einem unerwünschten Abbau wichtiger zellulärer Komponenten und toxizitätfür die Würmer führen und die Isolierung von Zielzelltypen verhindern. Die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit ist für die erfolgreiche RNA-Extraktion aus oder die weitere kurzfristige Kultivierung isolierter Zellen unerlässlich. Da die Mehrheit der neuronalen Zellen empfindlich sind, kann eine zu harte Behandlung entweder während des SDS-DTT-Puffers oder der Protease-Mischungsbehandlung zu massiven Schäden an diesen Zellen führen. Wenn ein Stressreaktionsweg das Ziel des Experiments ist, können die Bedingungen der Inkubation leicht verändert werden, da die hochreduktive Kraft von DTT eine verbesserte Expression bestimmter Stressreaktionsgene verursachen kann. In diesem Fall ist es wichtig, Zellpellets mit L-15-ergänzungsmittel erfolgreich zu waschen, um die Reaktion zu stoppen und die Zellen schnell wieder mit Nährstoffen zu versorgen. Schließlich ermöglicht die sorgfältige Auswahl des Auswahlschritts, der für den Zelltyp des Interesses am besten geeignet ist, eine maximale Wiederherstellung dieser Zellen. Ebenso kann die Zelllokalisierung zelltypspezifischer Marker den Forschern helfen, den optimalen Zellanreicherungsansatz zu wählen. Die Verwendung von Durchflusszytometrie wird zu einer homogeneren und lebensfähigeren Zellkultur führen, während die Verwendung von Anti-GFP-Magnetperlen weniger zeitaufwändig und arbeitsintensiv ist.
Es ist wichtig zu beachten, dass die hier beschriebene Methode einige Einschränkungen aufweist. Zunächst sollte eine robuste Expression von GFP in gewünschten Zelltypen überprüft werden, um eine geeignete Isolierung durch FACS oder antikörpergekoppelte Magnetperlen zu gewährleisten. Zweitens, auch sanfte Nagelhaut Störung kann zu einer schlechten Ausbeute oder sogar Verlust bestimmter Körperwandzellen führen, oder andere Low-Abundance-Zell-Populationen wie dat-1 dopaminergen Neuronen. Bei der Auswahl von Zelltypen kann der reichlichere Zelltyp in der Regel eine erfolgreichere Ausbeute liefern. Dennoch kann diese Methode auch für die Isolierung weniger reichlich zelltypischer Populationen verwendet werden.
Zusammenfassend stellt das in diesem Artikel beschriebene Verfahren eine effektive Methode zur Extraktion und Isolierung einzelner Zelltypen aus dem Rundwurm C. elegansdar. Die Methode ist robust genug, um die Extraktion von RNA und nachfolgende Genprofilierung zu ermöglichen, und empfindlich genug, um die Kultivierung der isolierten Zellen zu ermöglichen. Obwohl die genaue Methode, die zum Isolieren bestimmter Zellgruppen verwendet wird, zwischen verschiedenen Zelltypen variieren kann, ist der in diesem Bericht beschriebene Workflow im Allgemeinen wirksam und kann auf praktisch alle Arten von Wurmzellen angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Jennifer Fox und den Mitgliedern des Khalimonchuk-Labors für aufschlussreiche Kommentare. Wir würdigen die Unterstützung der National Institutes of Health (R01 GM108975 an O.K. und T32 GM107001-01A1 an E.M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
References
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