Isolering av specifika neuron populationer från spolmask Caenorhabditis elegans

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för enkel isolering av specifika grupper av levande neuronala celler som uttrycker grönt fluorescerande protein från transgena Caenorhabditis elegans linjer. Denna metod möjliggör en mängd olika ex vivo studier fokuserade på specifika nervceller och har kapacitet att isolera celler för ytterligare kortsiktig odling.

Abstract

Under åldrandet, många celler ackumuleras höga nivåer av skador som leder till cellulära dysfunktion, som ligger bakom många geriatriska och patologiska tillstånd. Post-mitotiska neuroner representerar en stor celltyp påverkas av åldrande. Även om flera däggdjurs modeller av neuronala åldrande finns, de är utmanande och dyra att etablera. Spolmasken Caenorhabditis elegans är en kraftfull modell för att studera neuronala åldrande, eftersom dessa djur har kort livslängd, en tillgänglig robust genetisk verktygslåda, och väl katalogiserade nervsystemet. Den metod som presenteras häri möjliggör sömlös isolering av specifika celler baserat på uttrycket av en transgen grönt fluorescerande protein (GFP). Transgena djurlinjer som uttrycker GFP under distinkta, celltyp-specifika initiativtagare bryts ned för att avlägsna den yttre nagelbanden och försiktigt mekaniskt störs för att producera flytgödsel som innehåller olika celltyper. Cellerna av intresse separeras sedan från icke-målceller genom fluorescensaktiverad cell sortering, eller av anti-GFP-kopplade magnetiska pärlor. De isolerade cellerna kan sedan odlas under en begränsad tid eller omedelbart användas för cellspecifika ex vivo-analyser såsom transkriptionell analys av kvantitativ PCR i realtid. Därmed möjliggör detta protokoll en snabb och robust analys av cellspecifika reaktioner inom olika neuronala populationer i C. elegans.

Introduction

Under de senaste decennierna, den metazoan modellorganism Caenorhabditis elegans har varit en enorm tillgång i studien av nervceller, neuronala kretsar och dess roll i fysiologiska och beteendemässiga svar, och åldrande-associerade neurodegenerativa Sjukdomar. En unik egenskap hos C. elegans är att djuren är transparenta, så att härstamning av alla vuxna somatiska celler mappas¹. C. elegans hamnar också hanterbar mängd av nervceller, vilket leder till morfologi och konnektivitet av nervsystemet är väl förstått². Den invariant cell härstamning, kort livslängd, och överflöd av hög genomströmning genetiska verktyg tillgängliga för C. elegans gör det till en idealisk modell organism för studiet av åldrande inom olika neuronala populationer.

Åldrande av nervceller och neurodegenerativa sjukdomar är komplexa, och varje störning har unika patologiska signaturer i samband med det. Men för många av dessa sjukdomar, såsom Parkinsons och Alzheimers sjukdom, en gemensam funktion är den progressiva belastningen av felvikt proteiner^3,4,5. I båda dessa sjukdomar, proteiner misfold och aggregera inom cellen att orsaka toxicitet, i slutändan leder till celldöd^4,5. För korrekt åldrande av nervceller, homeostasen av mitokonen, mer specifikt protein homeostas, är viktigt, eftersom störningar och dyshomeostasis kan leda till neurodegeneration^6,7,8. Celler är utrustade med olika mekanismer för att upprätthålla protein homeostas, en är den ovikt protein svar (UPR) ― en klassisk väg där signaler från endoplasmatiska Retikulum (ER) Aktivera intracellulära signal kaskader, vilket leder till en transkriptionell svar⁹. Besläktad med denna UPR^er, metazoer uppvisar ett liknande svar på förlust av mitokondriellt protein homeostas, den så kallade mitokondrie UPR (UPR^MT)^7,8. C. elegans verkar vara den mest basala organismen för att ha en bekräftad och VÄLDEFINIERAD UPR^MT -väg⁷.

Funktionen/dysfunktion av specifika neuronala populationer inom ett större nätverk kan vara svårt att bedöma på grund av deras inneboende anslutning och komplexitet³. Emellertid, det finns ofta ett behov av att studera distinkta neuronala populationer på grund av celltyp-specifika sjukdomar med komplexa patologier, såsom de associerade med nedsatt cellulära protein homeostas. I C. eleganskan specifika neuronala populationer vara genetiskt manipulerade vilket möjliggör facile observation in vivo. Nervsystemet i C. elegans består främst av nervceller, med en liten andel av gliaceller. I vuxna hermafrodit maskar, det finns cirka 302 neuroner, indelade i över 100 olika klasser^2,10. Nervceller såsom kolinerga neuroner dominerar i neuromuskulära korsningar, medan dopaminerga neuroner är främst involverade i sensation^10,11. Eftersom både motorisk aktivitet och sensoriska förmågor avtar med åldern, är det viktigt att detaljera mekanistiska insikter om defekter i dessa enskilda nervceller^11,12. Som sådan, det finns ett behov av en enkel och robust metod för att isolera intakt celler av intresse för efterföljande ex vivo studier.

Här beskriver vi en optimerad effektiv metod för snabb isolering av specifika neuronala celler som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) från C. elegans. Denna isoleringsmetod kan utföras på larver, juvenila eller vuxna maskar. Isolering av celler från larv maskar har tidigare publicerats av Zhang et al.¹³ och kommer inte att diskuteras här. En viktig anmärkning här är att alla maskar måste vara på samma livsskede för att förhindra övernedbrytning av djuret eller kontaminering från djur i olika livsskeden. Genom både enzymatiska och mekaniska störningar av nematodnagelbanden, ett exoskelett högt i kollagen och andra strukturella proteiner, kan en mängd olika celler isoleras^13,14. Celler kan sedan isoleras via flödescytometri eller antikropp märkta magnetiska pärlor. Typiskt, RNA isoleras via en fenol och guanidin isotiocyanate metod för att säkerställa berikning av önskad cellpopulation¹⁵. Med mycket omsorg dessa isolerade celler kan upprätthållas i en kulturkolv eller multi-well skålen. Denna metod är ett unikt och kraftfullt verktyg i studiet av specifika nervceller och har kapacitet att isolera levande och funktionella celler för vidare odling.

Protocol

1. beredning och insamling av åldrade maskar för cell isolering

Obs: förklaras nedan är isoleringen av kolinerga neuroner från transgena UNC-17:: GFP stam (OH13083) erhålls från Caenorhabditis Genetics Center (CGC) stam förvaret vid University of Minnesota. Det är absolut nödvändigt att bibehålla sterila förhållanden för att förhindra kontaminering från svampar eller bakterier.

1. Förbered och synkronisera maskar via blekning metod som beskrivs av T. Stiernagle¹⁶. För åldrande experiment, plattmaskar på Nematoden Growth medium (NGM) plattor som innehåller 25 μM vattenlösning av fluorodeoxyuridine (FuDR) för att minska äggproduktion och gripande äggkläckning. Inspektera agar plattor regelbundet för att förhindra kontaminering eller äggkläckning eftersom detta kommer att orsaka otillförlitliga resultat.
   Anmärkning: för UNC-17:: GFP celler, typiskt 3 100 mm x 15 mm NGM plattor används för att isolera en tillräcklig mängd av celler av intresse¹⁶.
2. Samla in maskar och Förbered buffertar för cell isolering.
   1. Samla in maskar i ett 15 mL koniskt rör. Tvätta maskar från plattan med 1,5 mL M9 buffert (1 mM MgSO₄, 85 mm NaCl, 42 mm na₂HPO₄· 7H₂O, 22 mm KH₂Po, pH 7,0) och Centrifugera i 5 min vid 1 600 x g. Kassera supernatanten och tvätta maskar med 1 mL M9-buffert. Upprepa centrifugering och tvätta i totalt fem gånger för att avlägsna så mycket E. coli -kontaminering som möjligt.
      Anmärkning: lägga till antibiotika (50 μg/mL), såsom ampicillin, i detta steg kan bidra till att minska bakteriell kontaminering.
   2. För två prover, Bered 2 mL natriumdodecylsulfat-ditiothreitol (SDS-DTT) lyseringsbuffert: 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) och 3% (vikt/volym) sackaros.
   3. Förbered 15 mL isoleringsbuffert (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mm mgcl₂, 25 mm hepes [pH 7,3]) och förvara den på is.
      Anmärkning: både SDS-DTT lysis buffert och isolationbuffert måste göras färskt före varje experiment.
3. Nagelbandsstörning och enstaka cell isolering
   1. Centrifugera djur som samlats in i steg 1.2.1 för 5 min vid 1 600 x g. Ta bort alla supernatanten och suspendera maskar i 1 mL M9-media och överför till 1,5 mL microcentrifugetub.
   2. Pellets maskar med centrifugering vid 1 600 x g i 5 min.
   3. Tillsätt 200 μL av SDS-DTT lysis buffert till maskar och inkubera i 5 min vid rumstemperatur (RT). Maskar bör verkar vara "winkled" längs kroppen om de ses under ett ljusmikroskop.
      Obs: långvarig exponering för SDS-DTT lysis buffert kan resultera i döden av maskar, som kan övervakas genom att observera maskar. Maskar som är döda kommer elongate och kommer inte att krypa.
   4. Tillsätt 800 μL iskall isoleringsbuffert och blanda genom att försiktigt snärta röret.
   5. Pellets maskar i 1 min vid 13 000 x g vid 4 ° c, ta bort supernatanten och tvätta med 1 ml isolationbuffert.
   6. Upprepa steg 1.3.5 för totalt fem gånger och ta försiktigt bort isoleringsbufferten varje gång.
   7. Tillsätt 100 μL proteasblandning från Streptomyces griseus (15 mg/ml) (tabell över material) upplöst i isoleringsbufferten till pelleten och inkubera i 10 − 15 min vid RT.
      Anmärkning: som med SDS-DTT lysis buffert, den utökade proteas matsmältningen kan resultera i överdriven klyvning av proteiner längs plasmamembranet, förhindra isolering av ytan exponerade GFP via magnetiska pärlor.
   8. Vid inkubering med proteasblandning, applicera mekaniska störningar genom att Pipettera prover upp och ner mot botten av 1,5 mL microcentrifugetub med en 200 μL micropipett spets för ~ 60 − 70 gånger. Håll pipettspetsen mot väggen i microcentrifugeröret med konstant tryck för att korrekt disassociera celler.
   9. För att bestämma stadium av matsmältningen, ta bort en liten volym (~ 1 − 5 μL) av rötnings blandningen, släpp den på en glasfiber Slide och inspektera den med hjälp av en vävnad kultur Mikroskop. Efter 5 − 7 min av inkubering bör mask fragment ha synbart reducerad nagelband och en uppslamning av celler kommer att vara lätt synlig.
   10. Halt reaktion med 900 μL av kommersiellt tillgängliga kallt Leibovitz s L-15 medium kompletteras med 10% foster bovint serum (FBS) och penicillin-streptomycin (slutlig koncentration på 50 U/mL penicillin och 50 μg/mL streptomycin).
   11. Pelletisolerade fragment och celler genom centrifugering i 5 minuter vid 10 000 x g vid 4 ° c. Tvätta pelleterade celler med 1 mL kallt L-15-kompletterat Media två gånger för att säkerställa att överflödigt skräp och nagelbanden avlägsnas.
   12. Omsuspendera pelleterade celler i 1 mL L-15-kompletterat material och låt verka på is i 30 min. Ta det översta lagret, cirka 700 − 800 μL, till ett microcentrifugerör. Detta skikt innehåller celler utan cellfragment och kommer att användas i den efterföljande isoleringen av celler av intresse.
   13. Efter tillverkarens anvisningar, Använd en automatiserad cell räknare eller hemocytometern för att mäta CELLTÄTHETEN av 10 − 25 μL isolerade celler.

2. isolering av GFP-positiva celler via flödescytometri eller anti-GFP magnetiska pärlor

Anmärkning: det finns två metoder som kan distribueras för att isolera specifika celltyper. Den första metoden är att använda fluorescensaktiverad cell sortering (FACS), medan den andra metoden använder antikroppskonjugerade magnetiska pärlor för att poolceller som uttrycker distinkta plasmamembran-lokaliserade proteiner. Den senare metoden kräver lokalisering av GFP till plasmamembranet, vilket är tillgänglig för interaktion med antikropp-kopplad magnetisk pärla.

1. Isolering av GFP-positiva celler med flödescytometri
   1. Från isolerad cellsuspension samlas i steg 1.3.12, Centrifugera celler för 5 min vid 10 000 x g vid 4 ° c. Kassera supernatanten och suspendera pelleterade celler i L-15-kompletterat medium till en celltäthet på högst 6 x 10⁶ celler/ml för att undvika överbelastning av flödescytometern.
   2. Sortera celler efter GFP-positivt uttryck med hjälp av en flödescytometer som kan sortera prover. GFP-negativa celler kan användas som en kontroll för icke-celltyp specifik analys.
      Anmärkning: som nämnts ovan, en alternativ metod för att isolera GFP-positiva celler kan användas om den GFP-märkta protein av intresse är lokaliserad till cellernas plasmamembran. I detta fall kan det protokoll som beskrivs i avsnitt 2,2 användas.
2. Isolering av GFP-positiva celler via anti-GFP magnetiska pärlor
   1. Från isolerad cellsuspension samlas i steg 1.3.12, Centrifugera celler för 5 min vid 10 000 x g vid 4 ° c. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i 485 μL L-15-kompletterat medium. Tillsätt 15 μL ddH₂O förtvättad α-GFP-antikroppskopplad magnet pärlor till lösningen.
   2. Inkubera celler med magnetisk pärla flytgödsel vid 4 ° c för 1 h med mycket skonsam svarvning. Överdriven svarvning kommer att skada cellerna.
   3. Efter inkubering, Centrifugera provet i 5 min vid 10 000 x g vid 4 ° c, tvätta sedan pelleten 2x med 1 ml L-15-kompletterat medium för att ta bort GFP-negativa celler.
3. Odling av isolerade celler
   1. Platta isolerade celler i en steril 6-brunn multi-well tallrik.
      Obs: dessa plattor kan vara belagda med jordnötter lektin att öka cell Attachment; men om cellerna ska användas omedelbart, kan detta steg ignoreras.
   2. Placera plattan i en plastbehållare och inkubera celler vid 20 ° c med en fuktig trasa eller mjuk pappers vävnad (tillsätt 50 μg/mL ampicillin till ddH₂O för att säkerställa ingen bakterietillväxt vid torka) för att tillföra fukt till cellerna. Inkubera inte i en CO₂ -inkubator, eftersom förhöjda Co₂ -nivåer kan skada cellerna.

3. fluorescerande avbildning av isolerade GFP-positiva celler

1. Slå på lysrörslampan i ett inverterat Mikroskop med fluorescensinfästning och låt den värmas upp i ca 10 min.
2. Ta bort cellkulturen från inkubatorn och Ställ på scenen av inverterad Mikroskop med fluorescensindikator attachment. Skjut GFP-filtret i spåren under mikroskopet.
3. Visa cellerna med en förstoring på 50x. Framgångsrikt isolerade GFP-positiva celler kommer att vara lätt synlig. Ta bilder med hjälp av kamera tillbehöret på mikroskopet.

4. extraktion av RNA från isolerade celler

Anmärkning: extraktion av RNA ska utföras omedelbart efter cell isolering för att säkerställa hög kvalitet på materialet. Isolerat RNA kan användas för att producera cDNA och efterföljande mätning av avskrift nivåer av kvantitativ PCR (qPCR). Alla rör, tips och reagenser bör vara RNase-fri, och arbetsytan bör etanol-tvättas före RNA utvinning.

1. Från isolerade celler som samlats in i steg 2.1.2, Centrifugera celler i en 1,5 mL steril, RNase-fri microcentrifug tubefor 5 min vid 10 000 x g vid 4 ° c. Om cellerna isoleras via magnetiska pärlor, följ cellinsamling som anges ovan.
2. Använd en mikropipett, avlägsna supernatanten från centrifugerade microcentrifugeröret och tillsätt 100 μL M9-medium för att tvätta bort L-15-kompletterat medium. Centrifugera celler 5 min vid 10 000 x g vid 4 ° c och avlägsna supernatanten. För att säkerställa att alla medier avlägsnas, upprepa för totalt tre tvättar försiktigt bort supernatanten varje gång.
3. Tillsätt 1 mL fenol-och guanidinisotiocyanatlösning (tabell över material) till cellerna och Pipettera suspensionen upp och ner försiktigt. Inkubera blandningen vid RT i 5 minuter.
4. Tillsätt 250 fenol-och guanidinisotiocyanatlösning efter inkubering
5. Centrifugera lösningen i 5 minuter vid 10 000 x g vid 25 ° c.
6. Ta försiktigt bort så mycket av det översta vattenskiktet med en mikropipett som möjligt, utan att störa botten organiska skikt, och överföra bottenlagret till en ny 1,5 mL RNase-fri microcentrifug Tube. Till det nya röret, tillsätt 500 μL isopropanol och blanda genom att invertera röret. Inkubera denna lösning vid RT i 5 minuter.
7. Centrifugera röret vid 14 000 x g i 20 min vid 25 ° c.
8. Medan proverna hålls på is, avlägsna så mycket isopropanol som möjligt med en mikropipett och tillsätt försiktigt 1 mL 70% (volymprocent) etanol i RNase-fritt ddH₂O till röret. Var noga med att inte mata ut lösningen direkt på undersidan av röret; Applicera etanol/vatten blandningen på sidan av röret.
9. Centrifugera vid 10 000 x g i 5 min vid 25 ° c.
10. Ta bort de flesta av etanol och lufttorka på is för 3 − 5 min.
    Anmärkning: etanol bör avlägsnas efter detta steg; men noggrann inspektion av botten av röret är viktigt att se till att ingen etanol lämnas.
11. Efter röret är lufttorkad, tillsätt 15 − 20 μL av RNase-fri ddH₂O och mäta RNA koncentration och renhet med hjälp av en spektrofotometer vid 260 Nm våglängd. Provets renhet bör mätas som ett 260 Nm/280 nm-förhållande. Detta förhållande bör vara ungefär > 2.
    Obs: isolerat RNA kan frysas och förvaras vid-20 ° c. Det är dock mycket förmånligt att använda en cDNA-syntes Kit så snart som möjligt för att säkerställa högkvalitativ cDNA-produktion. Kvantitativ PCR kan följa instruktionerna från tillverkaren av termocyklern som används i laboratoriet.

Representative Results

Det protokoll som beskrivs här tillåter specifik isolering av UNC-17:: GFP-positiva kolinerga neuroner från spolmasken C. elegans för efterföljande ex vivo-studier som celltypspecifik gen uttrycks profilering och eventuell kortsiktig kulturering för mätningar med patch-Clamp elektrofysiologi.

Figur 1 visar UNC-17:: GFP-positiva kolinerga neuroner i sin normala inställning. Den UNC-17 genen uttrycks i hela C. elegans kroppen och koder för en vesikulär acetylkolin transmembrantransportör¹⁷. Uttrycket av denna gen kan observeras i huvud, Midbody, och svans nervceller och neuron prognoser.

Figur 2A visar en illustrerad översikt över neuron isolerings proceduren som beskrivs i avsnittet metoder. Steg ett är att synkronisera och kultur maskar. Dessutom visar figur 2b representativa fluorescensmikrografer av UNC-17:: GFP-positiva neuroner efter isolering samt respektive negativ kontroll av icke modifierade N2-vildtyp djur. Isolerade celler kan hålla sig vid liv upp till 3 dagar, när kompletteras med Leibovitz s L-15 medium och 10% FBS.

Figur 3 visar representativa data för qPCR från GFP uttrycker kolinerga neuroner samt GFP-uttrycker muskelceller. Efter lyckad sortering av celler med endera metod, RNA isolerades via en fenol och guanidin isotiocyanate metod varefter cDNA producerades med hjälp av en syntes kit. Uttryck för kolinerga neuron-specifika gener, TPH-1 och SNB-1, en tryptofan-hydroxylas och synaptisk vesikel transportör, respektive, är förhöjd i UNC-17::GFP isolerade celler men är inte närvarande i MYO-3::GFP isolerade celler. Inversen är sann med uttrycket av den muskelspecifika myosin tunga kedje utskriften av MYO-2. Uttrycket av den senare genen är begränsad till isolerade muskelceller men inte de isolerade kolinerga cellerna.

Figur 1: rekonstruerad bild av kolinerga neuroner i en dag gammal vild typ transgena djur som uttrycker UNC-17:: GFP reporter. Bilden är sammansatt av fyra separata konfokalfluorescensbilder av samma mask, som täcker hela djurets längd. Skalstapeln för varje enskild bild är 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: arbetsflöde för cell isolering och representativa GFP-uttryckande celler isolerade från UNC-17::GFP-stam. (A) Schematisk arbetsflödes avbildning för isolering av specifika cellpopulationer berikad i UNC-17:: GFP-uttryck för kolinerga neuroner från respektive C. elegans transgena stammar. Brepresentativa fluorescensbilder som visar förekomst av GFP-signal i de isolerade UNC-17:: GFP-positiva cellerna. Observera att bilden visar ett enda fokalplan. Skalstapel = 10 μm. Figur 2B återges med tillstånd från Journal of cell Science och har publicerats av Tyskland et al.¹². Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: representativ qPCR-analys av UNC-17-neuron specifika markörer(TPH-1, UNC-47 och SNB-1) i hela djur kontra UNC-17:: GFP reporter cells isolat som bekräftar specifik anrikning av kolinerga neuroner av intresse. Ytterligare negativa kontroller som används här var MYO-3:: GFP reporter-uttrycker muskelceller, som hade isolerats efter samma protokoll. Data visar medelvärden ± SD (n = 3 biologiska replikat). * p < 0,05; * * p < 0,01; p < 0,001 vid ihopparad t -test. Denna siffra har modifierats från Tyskland et al.¹². Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Rundmask C. elegans är en väletablerad och kraftfull modell för att studera neuronala hälsa och sjukdom². Med rikliga genetiska verktyg för att manipulera dessa djur och hanterbar mängd exakt kartlagt olika neuron typer, en hel del data kan samlas in med en relativt liten mängd material. Här skisserar vi en optimerad metod för att isolera distinkta neuroner från hela djur. Genom att störa maskens yttre nagelband proteiner, kan en flytgödsel av olika celltyper isoleras, inklusive nervceller och muskelceller⁵. Dessa isolerade celler kan användas i en mängd unika experiment. Förmågan att använda antingen cell sortering genom flödescytometri eller antikropp-märkta magnetiska pärlor möjliggör en adaptiv teknikberoende av parametrarna för specifika experiment. Extrahera RNA från en specifik C. elegans celltyp möjliggör också en mer grundlig undersökning och en mekanistisk förståelse av olika cellulära processer.

Det finns kritiska steg diskuteras här som måste följas noga: 1) åldrande och skörd välmatade maskar från 25 μM FuDR plattor; 2) tid i SDS-DTT inkubation eller behandling med proteasblandning; 3) val av GFP-positiva celler. Först, under åldrandet av maskar, är det absolut nödvändigt att vara flitig att se till att alla ägg som inte kläcks, eftersom detta kommer att orsaka ålder heterogenitet i de insamlade maskar, orsakar betydande variation i data. Tvätt stegen vid skörd av maskar för isolering är också nödvändiga för att se till att döda eller omogna djur inte samlas in. För det andra, överdriven inkubation av maskar i SDS-DTT buffert kan orsaka oönskad uppdelning av viktiga cellulära komponenter och toxicitet för maskar, förhindra isolering av mål celltyper. Att bibehålla cellernas lönsamhet är viktigt för lyckad RNA-extraktion från eller ytterligare kortsiktig odling av isolerade celler. Eftersom majoriteten av neuronala celler är känsliga, alltför hård behandling under antingen SDS-DTT buffert eller proteas blandning behandling kan resultera i massiva skador på dessa celler. Om en stress reaktionsväg är målet för experimentet, kan förhållandena för inkuberingar ändras något eftersom den mycket reduktiva effekten av DTT kan orsaka ökat uttryck av vissa stressresponsgener. I detta fall är det viktigt att framgångsrikt tvätta cell pellets med L-15-kompletteras medium för att stoppa reaktionen och snabbt åter förse cellerna med näringsämnen. Slutligen, noggrant välja vilket urvals steg som är lämpligast för celltypen av intresse kommer att möjliggöra maximal återhämtning av dessa celler. Likaså, med tanke på cellulära lokalisering av celltyp-specifika markörer kan hjälpa forskarna att välja den mest optimala cell beriknings metod. Använda flödescytometri kommer att ge en mer homogen och livskraftig cellkultur, medan använda anti-GFP magnetiska pärlor är mindre tidskrävande och arbetsintensiva.

Det är viktigt att notera att den metod som beskrivs här har vissa begränsningar. För det första bör robust uttryck av GFP i önskade celltyper verifieras för att säkerställa lämplig isolering av FACS eller antikropp-kopplade magnetiska pärlor. Andra, även milda nagelband störningar kan leda till en dålig avkastning eller till och med förlust av vissa organ vägg celler, eller andra låg-överflöd cellpopulationer såsom dat-1 dopaminerga neuroner. När du väljer celltyper kan den mer rikliga celltypen vanligtvis ge en mer lyckad avkastning. Ändå, denna metod kan användas för isolering av mindre riklig celltyp populationer också.

Sammanfattnings, det förfarande som diskuteras i denna artikel presenterar en effektiv metod för extraktion och isolering av enskilda celltyper från rundmask C. elegans. Metoden är tillräckligt robust för att möjliggöra utvinning av RNA, och efterföljande gen profilering, och tillräckligt känslig för att möjliggöra odling av de isolerade cellerna. Även om den exakta metoden som används för att isolera specifika grupper av celler kan variera mellan olika celltyper, är arbetsflödet som beskrivs i den här rapporten i allmänhet effektivt och kan tillämpas på praktiskt taget alla typer av mask celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Fisher Scientific	12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Chloroform	Sigma	496189
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
Ethanol	Decon Labs	2701
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
Isopropanol	VWR	BDH1133
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Kimwipes	Kimberly-Clark Professionals	7552
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
NaOH	Amresco	O583
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Peptone Y	USBiological	P3306
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit	ThermoFisher	12594025
TRIzol	Invitrogen	15596026	phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain	Invitrogen	T10Z82
α-GFP magnetic beads	MBL	D153-11