Summary
इस पांडुलिपि चूहे hepatocytes की बड़ी मात्रा के लिए एक बर्फ मुक्त cryopservation विधि का वर्णन है जिससे प्राथमिक कोशिकाओं को एक कम एकाग्रता पर क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंटों के साथ पूर्व इनक्यूबेट कर रहे हैं और बड़ी बूंदों में vitrified.
Abstract
Vitrification क्लासिक धीमी गति से फ्रीजिंग के लिए एक आशाजनक बर्फ मुक्त विकल्प है (लगभग 1 डिग्री सेल्सियस /मिनट पर) जैविक नमूनों के cryopservation. Vitrification बहुत तेजी से ठंडा दरों की आवश्यकता है कांच चरण में पानी के संक्रमण को प्राप्त करने के लिए, जबकि हानिकारक बर्फ गठन से परहेज. हालांकि क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंटों (सीपीए) के साथ पूर्व ऊष्मायन जैविक नमूनों की महत्वपूर्ण शीतलन दर को कम कर सकते हैं, उच्च सांद्रता आम तौर पर vitrification द्वारा बर्फ मुक्त cryopservation सक्षम करने के लिए आवश्यक हैं। एक परिणाम के रूप में, vitrification सीपीए विषाक्तता से बाधित है और छोटे नमूने है कि तेजी से ठंडा किया जा सकता करने के लिए प्रतिबंधित. यह हाल ही में दिखा दिया गया था कि इन निहित सीमाओं थोक छोटी बूंद vitrification द्वारा दूर किया जा सकता है. इस उपन्यास विधि का उपयोग करना, कोशिकाओं को पहले एक कम intracellular सीपीए एकाग्रता के साथ पूर्व incubated हैं. तेजी से परासरणी निर्जलीकरण का लाभ उठाते हुए, इंट्रासेल्यूलर सीपीए सीधे vitrification से आगे केंद्रित है, पूरी तरह से विषाक्त सीपीए सांद्रता को बराबर करने की आवश्यकता के बिना। सेलुलर निर्जलीकरण एक तरल डिवाइस में किया जाता है और तरल नाइट्रोजन में काटी हुई बड़ी आकार की बूंदों के निरंतर उच्च थ्रूपुट पीढ़ी के साथ एकीकृत किया जाता है। कम से कम सीपीए विषाक्तता के साथ इस बर्फ मुक्त cryopservation विधि बड़ी सेल मात्रा के लिए उपयुक्त है और शास्त्रीय धीमी गति से फ्रीजिंग cryopservation की तुलना में वृद्धि हुई hepatocyte व्यवहार्यता और चयापचय समारोह में परिणाम. इस पांडुलिपि में सफल थोक छोटी बूंद vitrification के लिए तरीकों का विस्तार से वर्णन करता है.
Introduction
hepatocytes के क्रायोपोसाइटेस के क्रायोपोकेशनके बाद कोशिका व्यवहार्यता और चयापचय समारोह की हानि अभी भी एक प्रमुख मुद्दा है जो नैदानिक अनुप्रयोगोंकोसीमित करता है 1 ,2,3. हेपेटोसाइट क्रायोपोकेंसी की बेंचमार्क विधि धीमी गति से फ्रीजिंग है, जो सीपीए (डिमेथिल सल्फाइड [डीएमएसओ], ग्लूकोज, और एल्बुमिन) और बाद में नियंत्रित दर ठंड (लगभग 1 डिग्री सेल्सियस/मिनट पर) के साथ हेपेटोसाइट्स को पूर्व-इनक्यूबेट करके किया जाता है। क्राइरोजेनिक तापमान4,5. कई सूचित अनुकूलन के बावजूद, सीपीए विषाक्तता ठंड और बर्फ के गठन के यांत्रिक तनाव के दौरान हानिकारक परासरणी असंतुलन के साथ एक साथ धीमी गति से फ्रीजिंग6,7के मौलिक कमियां बनी हुई है।
विट्रीकरण बर्फ के गठन के कारण धीमी गति से ठंड पर एक लाभ प्रदान करता है कि कांच राज्य6में पानी के एक सीधा चरण संक्रमण से पूरी तरह से बचा जाता है। हालांकि, शुद्ध पानी (-137 डिग्री सेल्सियस) के कांच संक्रमण तापमान तक पहुंचने के लिए, पानी को कांच के संक्रमण तापमान 8 के ऊपर बर्फ के गठन से बचने के लिए प्रति सेकंड एक मिलियन डिग्री सेल्सियस (यानी, महत्वपूर्ण शीतलन दर) के क्रम में दरों पर ठंडा किया जाना चाहिए . सीपीए के अलावा महत्वपूर्ण शीतलन दर को कम कर सकते हैं और जलीय समाधान9के कांच संक्रमण तापमान में वृद्धि कर सकते हैं। हालांकि, यहां तक कि उच्च सीपीए सांद्रता के साथ (उदाहरण के लिए, 40% v/v DMSO या अधिक) तेजी से ठंडा दर फिर भी सफल vitrification के लिए आवश्यक हैं8,9.
आवश्यक ठंडा दरों और उच्च सीपीए सांद्रता vitrification के दो प्रमुख कमियों में परिणाम. सबसे पहले, तेजी से ठंडा सक्षम करने के लिए, नमूने एक कम थर्मल द्रव्यमान होना चाहिए. दूसरा, उच्च सीपीए सांद्रता तक पहुँचने के लिए, जबकि परासरणी चोट से बचने के लिए, CPA धीरे धीरे शुरू की और पूरी तरह से इंट्रा और extracellular डिब्बों के बीच समानीकृत किया जाना चाहिए6. यह विषाक्त CPAs के लिए कोशिकाओं के जोखिम समय बढ़ जाती है. साथ में, यह vitrification एक बोझिल प्रक्रिया है कि एक समय में कुछ छोटे आकार के नमूने (माइक्रोलीटर) तक सीमित है बनाता है. इन प्रतिबंधों के संभावित समाधान के रूप में ड्रॉपलेट विट्रेाइजेशन का प्रस्ताव किया गया है। नाइट्रोजन को तरल करने के लिए miniscule सेल से लदी बूंदों (nanoliters) को उजागर करके ठंडा दर काफी बढ़ जाती है, जिसके परिणामस्वरूप सीपीए एकाग्रता में काफी कमी की अनुमति देता है10,11,12 ,13,14. हालांकि कई उच्च आवृत्ति छोटी बूंद पैदा नलिका संभावित रूप से एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, अत्यंत छोटे छोटी बूंद आकार प्रति मिनट microliters के लिए थ्रूपुट सीमा10, जो बड़े सेल के कुशल vitrification precludes प्रति मिनट milliliters के आदेश पर परिमाण के साथ उच्च प्रसंस्करण दर के साथ संस्करणों.
हाल ही में यह प्रदर्शित किया गया था कि विरीकरण की इन अंतर्निहित सीमाओं को थोक बूंद विट्रीफिकेश15से दूर किया जा सकता है . इस उपन्यास विधि तेजी से osmotic निर्जलीकरण का लाभ उठाने के लिए एक intracellular सीपीए एकाग्रता ध्यान केंद्रित करने के लिए 7.5% v/v ethylene ग्लाइकोल और DMSO तुरंत पूर्ववर्ती vitrification, विषाक्त सीपीए सांद्रता के पूर्ण तुल्यता की आवश्यकता को नष्ट करने. सेलुलर निर्जलीकरण एक उच्च extracellular सीपीए एकाग्रता के लिए hepatocytes के एक संक्षिप्त जोखिम द्वारा एक fluidic डिवाइस में किया जाता है. हालांकि इस जोखिम तेजी से osmotic निर्जलीकरण का कारण बनता है, यह उच्च सीपीए एकाग्रता के लिए कोशिकाओं में फैलाना बहुत छोटा है. निर्जलीकरण के तुरंत बाद, कोशिकाओं को सीधे तरल नाइट्रोजन में काटी जाती हैं जो बूंदों में लोड होते हैं। इस विधि उच्च सीपीए सांद्रता के पूर्ण intracellular तेज की जरूरत समाप्त जबकि उच्च extracellular सीपीए एकाग्रता बड़े आकार की बूंदों के vitrification सक्षम बनाता है, कम से कम सीपीए विषाक्तता के साथ उच्च थ्रूपुट मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप.
Droplet vitrification संरक्षण के बाद प्रत्यक्ष और दीर्घकालिक व्यवहार्यता में सुधार, साथ ही साथ आकृति विज्ञान और प्राथमिक चूहे hepatocytes के चयापचय समारोह के रूप में धीमी गति से फ्रीजिंग15द्वारा शास्त्रीय cryopservation की तुलना में. इस पांडुलिपि प्राथमिक चूहे hepatocytes के थोक छोटी बूंद vitrification के लिए methodological विवरण प्रदान करता है.
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Protocol
इस प्रोटोकॉल के लिए प्राथमिक hepatocyte अलगाव मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल, बोस्टन, मैसाचुसेट्स, संयुक्त राज्य अमेरिका में सेल संसाधन कोर (सीआरसी) द्वारा प्रदर्शन किया गया. पशु प्रोटोकॉल (#2011N000111) मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था.
1. थोक बूंद vitrification
- विप्रीकरण समाधान तैयार करें।
- जोड़ें 40 गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) के 17.0 एमएल करने के लिए विस्कॉन्सिन समाधान के विश्वविद्यालय (UW) vitrification समाधान 1 (V1) बनाने के लिए. बाँझ एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर का उपयोग कर V1 समाधान फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
नोट: UW एक आमतौर पर इस्तेमाल किया अंग संरक्षण समाधान है. इसमें 50 ग्राम/एल हाइड्रॉक्सीएथिल स्टार्च होता है, 35.83 g/L लैक्टोबायोनिक एसिड, 3.4 g/L पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक, 1.23 ग्राम/लग्नेशियम सल्फेट हेप्टाहाइड्रेट, 17.83 g/L रैफिनोस पेंटाहाइड्रेट, 1.34 g/Ladenosine, 0.136 g/L allopurinol, 0.992 g/all glutone. 5g/ /L पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड, और सोडियम हाइड्रॉक्साइड पीएच को 7.4 करने के लिए समायोजित करने के लिए। - यूडब्ल्यू के 7.0 एमएल, डीएमएसओ के 6.5 एमएल, एथिलीन ग्लाइकोल (ईजी), 40 मिलीग्राम बीएसए, और 5.48 ग्राम सुक्रोज का मिश्रण करने के लिए vitrification समाधान 2 (V2). स्टरल एक 0.22 डिग्री डिग्री फिल्टर का उपयोग कर V2 समाधान फिल्टर। 3 एमएल सिरिंज में 3.5 एमएल बंधी हुई V2 समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: CPAs भंग करने की सुविधा के लिए, समाधान की आवश्यकता से बड़ी मात्रा में तैयार कर रहे हैं.
- जोड़ें 40 गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) के 17.0 एमएल करने के लिए विस्कॉन्सिन समाधान के विश्वविद्यालय (UW) vitrification समाधान 1 (V1) बनाने के लिए. बाँझ एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर का उपयोग कर V1 समाधान फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- थोक छोटी-छोटी विचालकउपकरण तैयार की।
- मिश्रण सुई तैयार करने के लिए, पहले मिश्रण सुई के बाहरी ग्रे आस्तीन के एक तरफ कटौती, और फिर मिश्रण सुई से इसे हटाने के लिए खुला आस्तीन मोड़।
- मिश्रण सुई के इनलेट्स पर दो 25 मिमी सिलिकॉन ट्यूबिंग अनुभागों को स्लाइड करें और गोंद के साथ अपनी स्थिति को सुरक्षित करें (चित्र 1ए)।
- चित्र 1कमें दर्शाए अनुसार सुई को 20 उउ (अर्थात् आंतरिक मिश्रण हेलिक्स की लंबाई) की लंबाई में काट ें।
नोट: मिश्रण सुई लंबाई सुई के अंदर मात्रा के लिए आनुपातिक है और इसलिए उच्च सीपीए एकाग्रता समाधान करने के लिए hepatocytes के जोखिम समय को नियंत्रित करने के लिए बदला जा सकता है। - मिश्रण सुई के कटऑफ आउटलेट को 20 जी इंजेक्शन सुई में सम्मिलित करें (चित्र 1ख)।
नोट: इंजेक्शन सुई आकार छोटी बूंद आकार को प्रभावित करती है। - स्वावण्ण द्वारा मिश्रण सुई विधानसभा स्टरलाइज़ करें।
- तरल नाइट्रोजन के साथ एक बाँझ देवर भरें. एक बाँझ लेमिनर प्रवाह सेल संस्कृति हुड में देवर रखने से पहले आइसोप्रोपेनॉल के साथ देवर के बाहर बाँझ।
नोट: संदूषण तरल नाइट्रोजन के लिए बूंदों के प्रत्यक्ष जोखिम के दौरान एक महत्वपूर्ण विचार है। हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल में गैर बाँझ तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर कोई संदूषण नहीं था, तरल नाइट्रोजन फ़िल्टर किया जा सकता है या विकिरण ित किया जा सकता है अगर जरूरत16बाँझपन को आश्वस्त करने के लिए . - एक कीप को तरल नाइट्रोजन देवर के आंतरिक व्यास के रूप में एक ही बाहरी व्यास के साथ एक 50 एमएल शंकु नली में सम्मिलित करें ताकि छोटी बूंद संग्रह युक्ति (चित्र 1ैे े) बनाया जा सके ।
- बड़े संदबे का उपयोग करके धीरे-धीरे इसे अपने अंतिम ऊर्ध्वाधर स्थिति में दबाकर तरल नाइट्रोजन में छोटी बूंद संग्रह युक्ति को जलमग्न कर दें। यह सुनिश्चित करना कि शंकु नलिका देवर के तल पर ऊर्ध्वाधर स्थिति में स्थित हो (चित्र 1ड ़ई) ।
नोट: कीप में डाला और शंकु ट्यूब पर आराम रहना चाहिए. द्रव नाइट्रोजन स्तर कीप की इनलेट ऊंचाई से 1 बउ नीचे होना चाहिए, जैसा कि चित्र 1D में दर्शाया गयाहै। - सेल संस्कृति हुड की दीवार पर एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में एक सिरिंज पंप माउंट सेल संस्कृति हुड दीवार से बाहर निकल शिकंजा करने के लिए सिरिंज पंप के पैरों से एक स्ट्रिंग बांधने के द्वारा।
- तरल नाइट्रोजन देवर को लंबवत घुड़सवार सिरिंज पंप के नीचे छोटी बूंद संग्रह उपकरण के साथ रखें (चित्र 1ई)।
- CPAs के साथ पूर्व इनक्यूबेट.
- ताजा अलग चूहा hepatocytes प्राप्त करने के बाद, ट्रिपन नीले बहिष्कार द्वारा शेयर एकाग्रता गिनती और 40 लाख व्यवहार्य hepatocytes ले लो.
नोट: निलंबन में hepatocytes की कोमल हैंडलिंग सेल मौत को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. - ब्रेक के बिना 5 मिनट के लिए 50 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
- अधिनान्त को प्रेरित करें और वी 1 विलयन के 3.4 एमएल में हेपेटोसाइट्स को पुन: स्फूंश करें।
- 3 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
- डी एम एस ओ के 150 डिग्री सेल्सियस और हेपाटोसाइट्स में ईजी का 150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और धीरे से मिलाएं।
- 3 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
- फिर, DMSO के 150 $L और hepatocytes के लिए ईजी के 150 डिग्री एल जोड़ें और धीरे से मिश्रण.
- एक 3 एमएल सिरिंज में 3.5 एमएल लोड करें।
- ताजा अलग चूहा hepatocytes प्राप्त करने के बाद, ट्रिपन नीले बहिष्कार द्वारा शेयर एकाग्रता गिनती और 40 लाख व्यवहार्य hepatocytes ले लो.
- विट्रीफिकेस करें।
- पूर्व इनक्यूबेट्ड हेपाटोसाइट्स और वी 2 समाधान सिरिंज के साथ सिरिंज पंप एडाप्टर में सिरिंज डालें।
- दो महिला Luer ताला नली कंटीब एडेप्टर सिरिंजों के लिए संलग्न करें और कंटीली फिटिंग पर मिश्रण सुई विधानसभा के सिलिकॉन ट्यूबिंग स्लाइड (चित्र 1एफ) .
- सीरिंज पंप में पूरी विधानसभा रखें (चित्र 1ई)।
- DMSO और hepatocytes के लिए ईजी के अंतिम जोड़ने के बाद तीन मिनट, 2 एमएल /
- सभी hepatocytes तरल नाइट्रोजन के लिए जोड़ा गया है के बाद पंप बंद करो.
2. क्रायोजेनिक भंडारण
- 20 ग्राम सुई का उपयोग करके 50 एमएल शंकु नली के ढक्कन में 10 छोटे छिद्रों को पंचर करें और ढक्कन के बाहर को लचीली फिल्म के साथ लपेट दें, जैसा कि चित्र 1खमें दर्शायागया है। यह एक वाल्व है कि बचे हुए तरल नाइट्रोजन वाष्पीकरण के भागने में सक्षम बनाता है बनाता है.
- काचाभ हेपेटोसाइट बूंदों को इकट्ठा करने के लिए, पहले तरल नाइट्रोजन देवर से कीप को हटा दें। इसके बाद, शंकु ट्यूब लेने के लिए लंबे बलकाउपयोग करें जिसमें तरल नाइट्रोजन से बाहर बूंदें होती हैं और धीरे-धीरे शंकु नली से अतिरिक्त द्रव नाइट्रोजन डालदेती हैं।
- पंचर ढक्कन के साथ शंकु ट्यूब को बंद करें और तरल नाइट्रोजन देवर में वापस कोटि के हेपेटोसाइट बूंदों के साथ बंद शंकु ट्यूब को सीधे रखें।
- शंकु नली को द्रव नाइट्रोजन से द्रव नाइट्रोजन वाष्प क्रायोटैंक में स्थानांतरित कर सकते हैं।
3. काचित हेपाटासाइट बूंदों का पुनरुत्रोण
-
पुन: आरोही समाधान तैयार करें।
- DMEM hepatocyte संस्कृति मीडिया के 100 एमएल में 17.13 ग्राम sucrose भंग rewarming समाधान बनाने के लिए. बाँझ एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर का उपयोग कर rewarming समाधान फिल्टर और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म.
-
हेप्टोसाइट्स को फिर से तैयार करें।
- क्रायोटैंक से कोटि के हेपटोसाइट्स के साथ शंकु ट्यूब को लें और इसे तरल नाइट्रोजन देवर में कोशिका संस्कृति हुड में ले जाएं।
- टोपी को हल्का ढीला करें और शंकु ट्यूब को तरल नाइट्रोजन में वापस डाल दें।
- एक खाली बीकर में काचाभ हेपेटोसाइट बूंदों को जोड़ें, तुरंत गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) rewarming समाधान जोड़ें, और तुरंत 10 s के लिए हलचल।
नोट: यह rewarming के दौरान ठंड से बचने के लिए जल्दी से काम करने के लिए महत्वपूर्णहै। अध्ययन आवश्यकताओं के आधार पर, कुछ से सभी कोटिदार बूंदों को एक ही बार में rewarmed किया जा सकता है।
-
पुन: आरही समाधान अनलोड करें.
- दो 50 एमएल शंकु ट्यूबों पर hepatocytes के साथ rewarming समाधान विभाजित करें।
- ब्रेक के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 100 x g पर 2 मिनट के लिए दो शंकु ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
- एक संदर्भ के रूप में शंकु ट्यूब के स्नातक चिह्न का उपयोग कर 12.5 एमएल की कुल मात्रा छोड़ने के लिए supernatant प्रेरित और शंकु ट्यूब प्रति बर्फ ठंड DMEM के 12.5 एमएल जोड़ने के लिए 50% के लिए rewarming समाधान को पतला.
- हेपटोसाइट्स को फिर से निलंबित करें और 3 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
- 25% के लिए rewarming समाधान को पतला करने के लिए शंकु ट्यूब प्रति बर्फ ठंडा DMEM के 25 एमएल जोड़ें।
- ब्रेक के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
- अधिनांत को प्रेरित करें और उपयोग के लिए वांछित संस्कृति माध्यम के 2 एमएल में हेपटोसाइट्स को पुन: स्फूंश करें।
नोट: घनत्व ढाल centrifugation कोशिका निलंबन से मृत hepatocytes को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर वांछित.
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Representative Results
पांच अलग चूहे जिगर से ताजा अलग प्राथमिक hepatocytes क्लासिक cryopservation के लिए थोक बूंद vitrification की एक सीधी तुलना के लिए इस्तेमाल किया गया था preeminent धीमी गति से फ्रीजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग कर साहित्य4, 5. संक्षेप में, हेपाटोसाइट्स को बीएसए (2.2 मिलीग्राम/एमएल), ग्लूकोज (333 एम एम), और डी एम (10% v/v) के साथ UW पूरक में निलंबित कर दिया गया था और एक नियंत्रित दर फ्रीजर का उपयोग करजमेन्त किया गया था। -196 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के बाद, नमूने एक गर्म पानी के स्नान में thawed थे. सभी बर्फ पिघल के बाद, DMSO सीधे पतला था, जबकि ग्लूकोज एकाग्रता धीरे-धीरे कई चरणों के दौरान कम किया गया था परासरणी चोट को कम करने के लिए. सटीक प्रोटोकॉल कहीं और15विस्तार से पाया जा सकता है. संरक्षण अवधि 2 से 8 दिनों से अलग-अलग होती है और समान तुलना सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए थोक बूंद विरूपण और ठंड क्रायोपराक्षण के बीच मिलान किया गया। यद्यपि कम संरक्षण समय व्यावहारिक विचारों के लिए परीक्षण किया गया था, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्राथमिक hepatocytes व्यवहार्यता5के नुकसान के बिना साल के लिए -196 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
थोक बूंद vitrification एक प्रत्यक्ष पोस्ट संरक्षण hepatocyte 79% की व्यवहार्यता में परिणाम, Trypan नीले बहिष्करण परीक्षण द्वारा मापा, जो झिल्ली अखंडता निर्धारित करता है (चित्र 2ए). यह क्लासिक अनुकूलित cryopservation के बाद 68% व्यवहार्यता की तुलना में काफी अधिक है. थोक छोटी बूंद vitrification की उपज 56% है कि 10% अधिक है, और महत्वपूर्ण बात यह है कि अधिक सुसंगत, क्लासिक cryopservation की तुलना में (चित्र 2बी).
hepatocytes की चयापचय गतिविधि, लंबी अवधि के कोलेजन सैंडविच संस्कृतियों में एक प्रेस्टो ब्लू चयापचय निबंध का उपयोग कर मापा, काफी अधिक था थोक बूंद vitrification के बाद शास्त्रीय cryopservation के बाद. Albumin संश्लेषण, जो hepatocytes के सिंथेटिक समारोह का सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया पैरामीटर है, लगभग दो गुना से अधिक था थोक बूंद vitrification के बाद क्लासिक cryopservation की तुलना में (चित्र 3ए). यूरिया उत्पादन हेपाटोसाइट detoxification समारोह का सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया पैरामीटर है। एक सप्ताह की संस्कृति के बाद, थोक बूंद-गुणित हेपटोसाइट्स का यूरिया उत्पादन क्लासिक क्रायोप्रोमेंड हेपाटोसाइट्स की तुलना में काफी अधिक था (चित्र 3इ)।
संक्षेप में, थोक छोटी बूंद vitrification प्रत्यक्ष बाद संरक्षण व्यवहार्यता और कोलेजन सैंडविच संस्कृतियों में प्राथमिक चूहे hepatocytes के दीर्घकालिक चयापचय समारोह में सुधार, के रूप में धीमी गति से फ्रीजिंग द्वारा cryopservation की तुलना में.
चित्र ााा्व1: थोक छोटी बूंद विरिकेश प्रयोगात्मक सेटअप।
(क)मिश्रण की सुई तैयार करने और मिश्रण सुई के इनलेट्स में दो सिलिकॉन ट्यूबिंग खंडों को संलग्न करने के तरीके का चित्रण। (ख)मिश्रण सुई असेंबली को पूरा करने के लिए इंजेक्शन सुई में कट मिश्रण सुई की प्रविष्टि का चित्रण। (ग)कीप और 50 एमएल शंकु नली का चित्रण जो छोटी बूंद संग्रह युक्ति का गठन करता है। (छ)देवर में शंकु नली, कीप तथा द्रव नाइट्रोजन स्तर की स्थिति दर्शाने वाला स्केच। (ई) नीचे से ऊपर तक पूर्ण प्रयोगात्मक थोक छोटी बूंद विरिफिकेश सेटअप का प्रतिनिधित्व: तरल नाइट्रोजन देवर (ग्रे); तरल नाइट्रोजन देवर (स्पष्ट) के अंदर रखा गया है कि छोटी बूंद संग्रह डिवाइस; सीरिंज पंप (लाल) में रखे गए सिरिंजों से जुड़ी मिश्रण सुई विधानसभा (स्पष्ट-पीला)। (च)सीरिंज और मिश्रण सुई विधानसभा का चित्रण। दो 3 एमएल सिरिंज सिरिंज पंप एडाप्टर (नीले) में clamped हैं; एक सिरिंज को वी 1 समाधान में पूर्व-इनक्यूबेट्ड हेपाटोसाइट्स और अन्य उच्च सीपीए एकाग्रता समाधान (V2 समाधान) के साथ भरा जाना चाहिए। मिश्रण सुई विधानसभा दो महिला Luer ताला नली कंटक एडाप्टर द्वारा सिरिंजों से जुड़ा हुआ है. (छ)क्रायोजेनिक भंडारण के लिए शंकु नली ढक्कन का निर्माण कैसे किया जाए, जिससे बचे हुए द्रव नाइट्रोजन को काचित हेपेटोसाइट बूंदों के भंडारण के दौरान शंकु नली से बचने में सक्षम बनाया जा सके। ऊपर: पंचर छेद के साथ ढक्कन। नीचे: पंचर ढक्कन लचीला फिल्म के साथ लिपटे. स्केल बार्स: 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: संरक्षण के बाद हेपाटोसाइट व्यवहार्यता और उपज।
(ए) ताजा (ग्रे), क्रायोप्रेंडे (नीला) और बल्क ड्रॉपलेट काष्ठ (हरा) हेपेटोसाइट्स की व्यवहार्यता। (ख) क्रायोपआरक्षित और बल्क ड्रॉपलेट काचित हेप्टोसाइट्स का संरक्षण उपज। सितारे: p;lt; 0.05 (विलकॉक्सन मिलान-युग्मों पर हस्ताक्षर किए रैंक परीक्षण). whiskers: अधिकतम करने के लिए मिनट. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: लंबी अवधि के कोलेजन सैंडविच संस्कृतियों में चयापचय गतिविधि.
(ए) संस्कृति के दिनों में ताजा (ग्रे), क्रायोप्रेंडे (नीला), और थोक छोटी बूंद का काष्ठ (हरा) हेपाटासाइट्स का अल्बुमिन संश्लेषण 3, 5, और 7। (ख)ताजा, क्रायोप्रोप्रोमेंट और बल्क ड्रॉपलेट का यूरिया उत्पादन। सितारे: p और lt; 0.05 (एक तरह से एक तरह से ANOVA कई परीक्षण के लिए Tukey सुधार के बाद) युग्मित. त्रुटि पट्टियाँ: मानक विचलन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
कम व्यवहार्यता और चयापचय समारोह में धीमी गति से ठंड परिणाम द्वारा hepatocytes के Cryopservation. Vitrification क्लासिक cryopservation के लिए एक आशाजनक विकल्प प्रदान करता है, के रूप में ठंड चोट पूरी तरह से बचा है9. हालांकि, सीपीए के साथ पूर्व इनक्यूबेशन महत्वपूर्ण शीतलन दर8को कम करने के लिए आवश्यक है। नतीजतन, vitrification सीपीए विषाक्तता17 और छोटे नमूना मात्रा तक सीमित द्वारा बाधित है. इन सीमाओं को दूर करने के प्रयासों में इस पांडुलिपि में प्रस्तुत थोक बूंद विट्रीफिकेश विधि को कम पूर्व इनक्यूबेट्ड सीपीए सांद्रता15का उपयोग करते समय बड़ी मात्रा में कोशिकाओं के विचालकीकरण को सक्षम करने के लिए विकसित किया गया था। इस थोक बूंद vitrification साहित्य में सबसे इष्टतम धीमी गति से फ्रीजिंग cryopservation विधि की तुलना में वृद्धि हुई hepatocyte व्यवहार्यता और चयापचय समारोह की ओर जाता है. यहाँ, थोक छोटी बूंद vitrification और प्रक्रियाओं के व्यावहारिक पहलुओं में विस्तृत अंतर्दृष्टि के व्यापक तरीकों प्रदान की जाती हैं.
प्रोटोकॉल में एकाधिक चरण महत्वपूर्ण हैं और अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता है। गैर बाँझ तरल नाइट्रोजन के साथ देवर भरने संभावित अर्द्ध बाँझ शर्तों की ओर जाता है. प्रोटोकॉल में समझाया सावधानियों का उपयोग करना, कोई संदूषण हमारे दीर्घकालिक कोलेजन सैंडविच संस्कृतियों के दौरान पता चला था. तथापि, यदि आवश्यक समझा जाए तो अतिरिक्त नसबंदी उपाय किए जा सकते हैं। तरल नाइट्रोजन विकिरण या छानने16 द्वारा बाँझ किया जा सकता है और प्रणाली पूरी तरह से मिश्रण सुई से जुड़े एक चिमनी के साथ तरल नाइट्रोजन देवर पर एक ढक्कन के साथ बंद किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, गैर संपर्क छोटी बूंद vitrification तरीकों का पता लगाया जा सकता है, हालांकि यह बड़ी मात्रा throughput14सीमा हो सकती है.
प्रोटोकॉल के अन्य आवश्यक भागों सीपीए पूर्व लोड हो रहा है और ऊष्मायन durations अनलोड कर रहे हैं। लंबी अवधि विषाक्त सीपीए चोट में परिणाम हो सकता है, जबकि कम durations परासरणी चोट का कारण बन सकता है. इसके अलावा, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि काचित हेपेटोसाइट बूंदें हमेशा कांच के संक्रमण के तापमान से नीचे रहती हैं क्योंकि उच्च तापमान पर अनियंत्रित मैक्रो और सूक्ष्म बर्फ नाभिक गंभीर हेपाटोसाइट चोट और कोशिका मृत्यु का कारण बनते हैं। एक व्यावहारिक परिप्रेक्ष्य से, थोक छोटी बूंद vitrification में सबसे महत्वपूर्ण कदम vitrified hepatocyte बूंदों के rewarming है. जब काचदारबूंदों को तरल नाइट्रोजन से हटा दिया जाता है तो वे सेकंड के भीतर जमा हो जाते हैं यदि तुरंत गर्म पुन: पढ़ने वाले समाधान को जोड़कर तेजी से rewarmed नहीं किया जाता है।
थोक छोटी बूंद vitrification के भविष्य अनुकूलन आगे इस तरह व्यवहार्यता, उपज, और चयापचय समारोह के रूप में संरक्षण परिणामों में सुधार कर सकता है। दोनों पारगम्य और गैर पारगम्य सीपीए vitrification से पहले परासरणी निर्जलीकरण का अनुकूलन करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है. यह निर्जलीकरण के दौरान परासरणी सदमे को कम कर सकता है और पूर्व इनक्यूबेट्ड सीपीए सांद्रता को कम करने की अनुमति भी दे सकता है। इसके अतिरिक्त, सतत fluidic, batchwise के बजाय, सीपीए पूर्व इनक्यूबेशन सैद्धांतिक रूप से असीमित सेल मात्रा के vitrification की अनुमति होगी. क्योंकि केवल सामान्य प्रयोगशाला उपकरण थोक छोटी बूंद vitrification के लिए आवश्यक है, यह एक सरल और लागत प्रभावी संरक्षण विधि है जो संभवतः अन्य सेल प्रकार के संरक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखक प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं। Drs. de Vries, Weng, Toner, Tessier, और Uygun इस अध्ययन के लिए प्रासंगिक अनंतिम पेटेंट आवेदन किया है. डॉ Uygun अंग समाधान, अंग संरक्षण प्रौद्योगिकी के विकास पर ध्यान केंद्रित एक कंपनी में एक वित्तीय रुचि है। सभी शोधकर्ता के हितों के हितों के अपने संघर्ष के अनुसार MGH और पार्टनर्स HealthCare द्वारा प्रबंधित कर रहे हैं.
Acknowledgments
अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से धन (R01DK096075, R01DK107875, और R01DK114506) और अमेरिकी रक्षा विभाग (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) बहुत स्वीकार किया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M - Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
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