Summary
本手稿描述了一种用于大量大鼠肝细胞的无冰冷冻保存方法，即原生细胞以低浓度的预孵化，并在大液滴中进行玻璃化。
Abstract
硝化是一种有前途的无冰替代品，适用于生物样品的经典慢冷冻（约1°C/min）冷冻保存。玻璃化需要极快的冷却速率，以实现水向玻璃相的过渡，同时避免有害的冰层形成。虽然使用冷冻保护剂（CPA）预孵育可以降低生物样品的关键冷却速率，但通常需要高浓度，通过保鲜法实现无冰冷冻保存。因此，由于CPA毒性，硝化受到阻碍，并仅限于可快速冷却的小样品。最近证明，这些固有的局限性可以通过散装滴滴的体积化来克服。使用这种新方法，细胞首先以低细胞内CPA浓度预育。利用快速渗透脱水，细胞内CPA直接集中在化化之前，无需完全平衡有毒CPA浓度。细胞脱水在流体装置中进行，并与连续高通量生成大尺寸液滴集成，这些液氮被玻璃化。这种无冰冷冻保存方法，与传统的慢冷冻冷冻保存相比，适用于大细胞数量，可增强肝细胞活力和代谢功能。本手稿详细介绍了成功散装滴滴滴化的方法。
Introduction
肝细胞冷冻保存后细胞活力和代谢功能丧失仍然是限制临床应用1、2、3的主要问题。肝细胞冷冻保存的基准方法是缓慢冷冻，通过用CPA（二甲基磺胺[DMSO]、葡萄糖和白蛋白）和随后控制速率冷冻（约1°C/min）预育肝细胞来执行低温4，5。尽管许多报告优化，CPA毒性加上有害的渗透不平衡在冻结和机械应力的结冰形成仍然是缓慢冻结6，7的基本缺点。
与缓慢冻结一个优势，因为水直接相向玻璃状态6完全避免了由于结冰造成的伤害。然而，要达到纯水的玻璃过渡温度（-137 °C），水必须以每秒100万摄氏度（即临界冷却速率）的速度冷却，以避免冰形成高于玻璃过渡温度8.添加 CPA 可以降低临界冷却速率，提高水溶液 9 的玻璃过渡温度。然而，即使注册会计师的浓度很高（例如，40%v/v DMSO 或更高），快速冷却速率仍需要快速冷却率才能成功进行硝化8、9。
所需的冷却速率和高 CPA 浓度导致两个主要的 Vitit 化缺点。首先，要实现快速冷却，样品必须具有较低的热质量。其次，为了达到高CPA浓度，同时避免渗透伤害，CPA必须缓慢引入，并在细胞内和细胞外隔间6之间完全平衡。这增加了细胞接触有毒注册会计师的时间。总之，这使得硝化成为一个繁琐的过程，一次只能有几个小样本（微升）。滴滴五硝化已被提出作为这些限制的潜在解决方案。通过将小细胞含量液滴（纳米升）暴露于液氮中，冷却率显著提高，从而使CPA浓度显著降低10、11、12，13，14.虽然多个高频滴产生喷嘴可能同时使用，但极小的滴大小将吞吐量限制在每分钟10微升，从而排除了大电池的有效玻璃化以每分钟毫升为单位的处理速率较高。
最近证明，这些固有的局限性的五化可以通过散装滴硝化15克服。这种新方法利用快速渗透脱水来浓缩细胞内CPA浓度为7.5%v/v乙二醇和DMSO，紧接在硝化之前，无需完全平衡有毒CPA浓度。细胞脱水在流体设备中通过肝细胞短暂接触高细胞外CPA浓度进行。虽然这种暴露会导致快速渗透脱水，但高CPA浓度太短，无法扩散到细胞中。脱水后，细胞立即被装在液氮直接玻璃化的液滴中。该方法消除了在细胞内完全接受高CPA浓度的需要，而高细胞外CPA浓度使大尺寸液滴的硝化成为可能化，从而以最小的CPA毒性产生高通量。
滴滴玻璃化提高保存后的直接和长期生存能力，以及原发性大鼠肝细胞的形态和代谢功能，而传统的冷冻保存慢冷冻15。本手稿提供了原发性大鼠肝细胞大体积滴滴化的方法细节。
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Protocol
该协议的主要肝细胞分离由美国马萨诸塞州波士顿马萨诸塞总医院的细胞资源核心 （CRC） 执行。动物协议（#2011N000111）得到了马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 散装滴滴滴化
- 准备点光化解决方案。
- 将40毫克牛血清白蛋白（BSA）加入威斯康星大学溶液（UW）的17.0 mL，使硝化溶液1（V1）。使用 0.22 μm 过滤器对 V1 溶液进行无菌过滤，并储存在 4°C 下。
注：UW是一种常用的器官保存解决方案。它含有50克/L羟基淀粉， 35.83 g/L 乳酸，3.4 g/L 磷酸钾单基，1.23 g/L 硫酸镁七分水合物，17.83 克/L 五氟化水合物，1.34 克/升腺苷，0.136 g/L 异丙醇，0.992 g/L 总谷胱甘肽，5.61 克/L 氢氧化钾和氢氧化钠，将pHH调整为7.4。 - 结合7.0 mL的UW、6.5 mL的DMSO、6.5 mL的乙二醇（EG）、40毫克的BSA和5.48克蔗糖，制成葡萄糖化溶液2（V2）。使用 0.22 μm 过滤器对 V2 溶液进行无菌过滤。在 3 mL 注射器中装载 3.5 mL 无菌过滤 V2 溶液，并储存在 4°C 下。
注：为便于解散《全面和平协定》，准备了数量超过所需数量的解决方案。
- 将40毫克牛血清白蛋白（BSA）加入威斯康星大学溶液（UW）的17.0 mL，使硝化溶液1（V1）。使用 0.22 μm 过滤器对 V1 溶液进行无菌过滤，并储存在 4°C 下。
- 准备散装滴滴滴化装置。
- 要准备混合针，首先沿混合针的外灰色套筒的一侧切割，然后弯曲套筒以将其从混合针中取出。
- 将两个 25 mm 硅胶管部分滑到混合针的入口上，用胶水固定其位置（图 1A）。
- 将针切割至 20 mm 的长度（即内混合螺旋的长度），如图1A所示。
注：混合针的长度与针内的体积成正比，因此可以改变，以控制肝细胞对高CPA浓度溶液的暴露时间。 - 将混合针的切断出口插入 20 G 注射针中（图 1B）。
注： 注射针尺寸影响液滴大小。 - 通过高压灭菌对混合针组件进行消毒。
- 用液氮填充无菌的德瓦尔。在将德瓦尔置于无菌层流细胞培养罩之前，用异丙醇对德瓦尔的外侧进行消毒。
注：在液滴直接暴露于液氮时，污染是一个重要的考虑因素。虽然现行协议中没有使用非消毒液氮的污染，但液氮可以过滤或辐照，以确保不育（ - 将外径与液氮Dewar内径相同的漏斗插入50 mL锥形管中，以创建液滴收集装置（图1C=E）。
- 将液氮液滴收集装置浸入液氮中，使用大钳子将其压到其最终的垂直位置。确保锥形管位于 Dewar 底部的垂直位置（图 1D+E）。
注：漏斗应插入并放在圆锥管上。液氮水平应比漏斗入口高度低 1 厘米，如图1D所示。 - 将注射器泵从注射器泵支脚的一根绳绑在从细胞培养罩壁伸出的螺钉上，将注射器泵安装在细胞培养罩壁上的垂直位置。
- 将液氮 Dewar 与液滴收集装置放在垂直安装的注射器泵下（图 1E）。
- 与注册会计师进行预孵育。
- 获得新鲜分离的大鼠肝细胞后，通过Trypan蓝色排除计算库存浓度，并服用4000万活肝细胞。
注：在悬浮液中温和处理肝细胞对于防止细胞死亡至关重要。 - 在 50 x g下离心 5 分钟，无需踩刹车。
- 在V1溶液的3.4 mL中吸气上清液并重新悬浮肝细胞。
- 在冰上孵育3分钟。
- 在肝细胞中加入150μL的DMSO和150μL的EG，轻轻混合。
- 在冰上孵育3分钟。
- 再次，在肝细胞中加入150μL的DMSO和150μL的EG，然后轻轻混合。
- 在 3 mL 注射器中加载 3.5 mL。
- 获得新鲜分离的大鼠肝细胞后，通过Trypan蓝色排除计算库存浓度，并服用4000万活肝细胞。
- 执行点化。
- 将带有预孵育肝细胞和 V2 溶液注射器的注射器插入注射器泵适配器。
- 将两个母 Luer 锁紧软管棒适配器连接到注射器上，并将混合针组件的硅胶管滑到棒接头上（图 1F）。
- 将整个组件放入注射器泵（图1E）。
- 上次向肝细胞中添加 DMSO 和 EG 后三分钟，以 2 mL/min 的速度启动泵。
- 将所有肝细胞添加到液氮中后，停止泵。
2. 低温储存
- 使用 20 G 针在 50 mL 锥形管的盖子上穿刺 10 个小孔，并用柔性薄膜包裹盖子外侧，如图1B所示。这创造了一个阀门，使蒸发的剩液氮逃脱。
- 要收集玻璃化肝细胞液滴，首先从液氮德瓦中取出漏斗。接下来，使用长钳将含有液氮液滴的锥形管从液氮中倒入，然后从锥形管中缓慢倒出多余的液氮。
- 用穿刺盖合上锥形管，将封闭的锥形管与玻璃化肝细胞液滴直接放回液氮解毒液中。
- 将锥形管从液氮转移到液氮蒸汽冷冻罐中。
3. 玻璃化肝细胞滴的再加热
-
准备重新加热的解决方案。
- 在100 mL的DMEM肝细胞培养基中溶解17.13克蔗糖，使再加热溶液。使用 0.22 μm 过滤器对再加热溶液进行无菌过滤，并加热至 37°C。
-
重新加热肝细胞。
- 取用玻璃化肝细胞从冷冻罐中加入锥形管，并将其用液氮Dewar输送到细胞培养罩。
- 轻轻松开盖子，将锥形管放回液氮中。
- 将玻璃化肝细胞液滴加入空烧杯，瞬间加入温暖（37°C）再加热溶液，并立即搅拌10s。
注意：快速工作，以避免在重新加热期间结冰，这一点至关重要。根据研究要求，一些到所有玻璃化液滴可以一次重新加热。
-
卸载重新加热的解决方案。
- 用两个 50 mL 锥形管上的肝细胞将再加热溶液分开。
- 在 4°C 下，在 100 x g下将两个锥形管离心 2 分钟，无需踩刹车。
- 利用锥形管的刻度线作为参考，吸出上清液，使总体积为12.5 mL，并加入每锥形管12.5 mL的冰冷DMEM，将再加热溶液稀释至50%。
- 重新悬浮肝细胞，在冰上孵育3分钟。
- 每锥形管加入25 mL的冰冷DMEM，将再加热溶液稀释至25%。
- 在 4°C 下在 50 x g下离心 5 分钟，无需踩刹车。
- 吸出上清液，将肝细胞重新悬浮在所需培养基的2 mL中，供使用。
注：如果需要，密度梯度离心可用于去除细胞悬浮液中的死肝细胞。
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Representative Results
从五个不同的大鼠肝脏中分离出的新鲜原发性肝细胞，使用文献4中报道的卓越的慢冷冻方案，将散装滴滴滴化直接与经典冷冻保存进行比较。 5.简而言之，肝细胞悬浮在UW补充BSA（2.2毫克/升，葡萄糖（333 mM）和DMSO（10%v/v），并使用受控速率冷冻冷冻。在-196°C储存后，样品在温水浴中解冻。所有冰融化后，DMSO被直接稀释，同时葡萄糖浓度在多次降低渗透损伤过程中逐渐降低。确切的协议可以在其他部分找到。保存期从2天到8天不等，在散装滴滴的滴化和冷冻冷冻保存之间进行匹配，以确保平等比较。虽然出于实际考虑，对较短的保存时间进行了测试，但应该注意的是，原发性肝细胞可以在-196°C下储存多年，而不会失去生存能力5。
散装滴玻璃化可直接使肝细胞保存后存活率为79%，通过Trypan蓝色排除测试进行测量，从而确定膜完整性（图2A）。这明显高于经典优化冷冻保存后的 68% 的生存能力。散装滴的硝化产量为56%，比经典冷冻保存高出10%，且更加一致（图2B）。
在长期胶原蛋白三明治培养中，使用Presto Blue代谢论文测量的肝细胞代谢活性在散装滴丁化后明显高于经典冷冻保存后。白蛋白合成是肝细胞合成功能应用最广泛的参数，与传统的冷冻保存相比，散装滴比化后增加了近两倍（图3A）。尿素生产是肝细胞解毒功能应用最广泛的参数。经过一周的培养后，散装滴玻璃化肝细胞的尿素产量明显高于经典冷冻肝细胞（图3B）。
总之，与低温冷冻相比，散装滴玻璃化提高了胶原大鼠三明治培养中原原大鼠肝细胞的直接保存后生存能力和长期代谢功能。
图1：散装滴滴滴化实验设置。
（A） 说明如何准备混合针，并将两个硅胶管部分连接到混合针的入入口。（B） 在注射针中插入切割混合针以完成混合针组件的插图。（C） 构成滴收集装置的漏斗和 50 mL 锥形管的插图。（D） 显示圆锥管、漏斗和德瓦液氮水平位置的草图。（E） 自下而上的完整实验散装液滴滴硝化设置：液氮德瓦尔（灰色）;放置在液氮德瓦（清除）内的液滴收集装置;连接到注射器泵（红色）的注射器上的混合针组件（透明黄色）。（F） 注射器和混合针组件的插图。将两个 3 mL 注射器夹在注射器泵适配器中（蓝色）;一个注射器应填充V1溶液中预孵化的肝细胞，另一个注射器应填充高CPA浓度溶液（V2溶液）。混合针组件由两个母 Luer 锁紧软管棒适配器连接到注射器上。（G） 说明如何为低温储存创建锥形管盖，使剩余蒸发的液氮在储存玻璃化肝细胞滴时从锥形管中逸出。顶部：带穿刺孔的盖子。下图：用柔性薄膜包裹的穿刺盖。比例尺：1厘米。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：肝细胞保存后的生存能力和产量。
（A） 新鲜（灰色）、冷冻（蓝色）和散装滴玻璃化（绿色）肝细胞的生存能力。（B） 冷冻保存和散装滴玻璃化肝细胞的保存产量。星形： p < 0.05 （威尔科森匹配对签名排名测试）。威士忌：最小到最大值请点击此处查看此图的较大版本。
图3：长期胶原蛋白三明治培养物中的代谢活性。
（A） 在培养日 3、5 和 7 上合成新鲜（灰色）、冷冻（蓝色）和散装滴玻璃化（绿色）肝细胞的白蛋白。（B） 尿素生产新鲜、冷冻保存和散装滴玻璃化肝细胞。星形：p < 0.05（配对单向方差分析，然后是图基校正，用于多个测试）。误差柱：标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
通过缓慢冷冻对肝细胞的冷冻保存会导致生存能力和代谢功能降低。冷冻为经典冷冻保存提供了一个有前途的替代方案，因为完全避免冷冻损伤9。然而，需要与注册会计师进行预孵化，以降低临界冷却率8。因此，由于CPA毒性17，硝化受到阻碍，且样本量很小。为了克服这些限制，本手稿中提出的散装滴滴滴化方法被开发，以便在使用低预孵化的CPA浓度15的同时，使大量细胞的白化。与文献中最优的慢冷冻冷冻保存方法相比，这种大体积滴玻璃化可增强肝细胞活力和代谢功能。这里提供了散装滴滴滴化的综合方法和对程序实际方面的详细见解。
协议中的多个步骤至关重要，需要额外关注。用非消毒液氮填充 Dewar 可能导致半无菌条件。使用协议中解释的预防措施，在我们的长期胶原蛋白三明治培养过程中，没有发现任何污染。但是，如果认为有必要，可以采取额外的灭菌措施。液氮可以通过辐射或过滤16进行灭菌，系统可以完全关闭，用盖子盖住液氮Dewar，烟囱连接到混合针。或者，可以探索非接触式滴滴vitit化方法，尽管这可能会限制更大的体积吞吐量14。
该协议的其他重要部分是 CPA 预加载和卸载孵化持续时间。较长的持续时间可能会导致有毒的 CPA 伤害，而较短的持续时间可能会导致渗透损伤。此外，必须确保玻璃化肝细胞液滴始终保持在玻璃过渡温度以下，因为在较高温度下不受控制的宏观和微观冰核化会导致严重的肝细胞损伤和细胞死亡。从实际角度来看，散装液滴玻璃化最关键的步骤是玻璃化肝细胞滴的再加热。当从液氮中去除玻璃化液滴时，如果不通过瞬间加入暖加热溶液迅速重新加热，它们可在数秒内冻结。
大体积滴玻璃化的未来优化可以进一步提高保存结果，如生存能力、产量和代谢功能。可渗透和不可渗透的注册会计师都可以进行测试，以优化渗透脱水在化之前。这可以减少脱水期间的渗透性休克，并可能允许降低预孵化的CPA浓度。此外，连续流质，而不是分批，CPA预孵育理论上将允许无限细胞数量的玻璃化。由于散装滴玻璃化只需要一般实验室设备，它是一种简单而经济高效的保存方法，可能用于保存其他细胞类型。
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Disclosures
作者宣布相互竞争的经济利益。德弗里斯博士、翁博士、托纳博士、泰西尔博士和尤伊贡博士拥有与本研究相关的临时专利申请。Uygun博士对器官解决方案公司有财务兴趣，该公司专注于开发器官保存技术。所有研究人员的利益都由 MGH 和合作伙伴医疗保健部根据其利益冲突政策进行管理。
Acknowledgments
美国国家卫生研究院（R01DK096075、R01DK107875和R01DK114506）和美国国防部（国防部）（DoD RTRP W81XWH-17-1-0680）的资助得到了极大的认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M - Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
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