Summary
تصف هذه المخطوطة طريقه الحفظ بالتبريد الخالية من الجليد للكميات الكبيرة من خلايا الكبد الفئران التي يتم فيها الاحتضان المسبق للخلايا الاوليه مع عوامل كريوبروتيكتيفي بتركيز منخفض والمزجج في قطرات كبيره.
Abstract
التزجيج هو بديل الجليد خاليه واعده لتجميد الكلاسيكية بطيئه (في حوالي 1 درجه مئوية/دقيقه) بالتبريد من العينات البيولوجية. ويتطلب التزجيج معدلات تبريد سريعة للغاية لتحقيق انتقال المياه إلى المرحلة الزجاجية مع تجنب تشكيل الجليد الضار. علي الرغم من ان مرحله ما قبل الحضانة مع وكلاء كريوبروتيكتيفي (CPA) يمكن ان تقلل من معدل التبريد الحرجة من العينات البيولوجية ، وهناك حاجه عموما إلى تركيزات عاليه لتمكين الجليد خاليه من البرد التجميد عن طريق التزجيج. ونتيجة لذلك ، فان التزجيج يعوقه التسمم ببموجب اتفاق السلام الشامل ويقتصر علي العينات الصغيرة التي يمكن تبريدها بسرعة. وقد تبين مؤخرا ان هذه القيود المتاصله يمكن التغلب عليها بواسطة التزجيج التجميعي السائب. باستخدام هذه الطريقة الجديدة ، يتم أولا احتضان الخلايا مع تركيز CPA منخفض داخل الخلايا. الاستفادة من الجفاف السريع الاسموزي ، تتركز التكلفة النسبية للاكتساب داخل الخلايا مباشره قبل التزجيج ، دون الحاجة إلى تتوازن تركيزات التكلفة الكلية السامة بالبالكامل. يتم تنفيذ الجفاف الخلوية في جهاز فلويدريك ومتكاملة مع توليد الانتاجيه العالية المستمر من قطرات كبيره الحجم التي يتم المزجج في النيتروجين السائل. هذه الطريقة الخالية من الجليد بالتبريد مع سميه الحد الأدنى للاكتساب مناسبه لكميات الخلايا الكبيرة والنتائج في زيادة القدرة علي البقاء في الكبد ووظيفة التمثيل الأيضي بالمقارنة مع الكلاسيكية بطيئه تجميد التبريد. تصف هذه المخطوطة أساليب التزجيج التجميعي الناجح للقطرة السائبة بالتفصيل.
Introduction
فقدان القدرة علي البقاء في الخلية والتمثيل الأيضي بعد التجميد من الخلايا الكبدية لا تزال قضية رئيسيه التي تحد من التطبيقات السريرية1,2,3. الطريقة القياسية لحفظ الخلايا الكبدية هي بطيئه التجمد ، والتي يتم تنفيذها قبل احتضان الخلايا الكبدية مع CPA (ثنائي ميثيل سلفوكسيد [dmso] ، والجلوكوز ، والزلال) وتجميد معدل اللاحقة (في حوالي 1 درجه مئوية/دقيقه) درجاتالحرارة المبردة 4,5. علي الرغم من العديد من التحسينات المبلغ عنها ، وسميه CPA مع الاختلالات الاسموزي الضارة اثناء تجميد والإجهاد الميكانيكي لتشكيل الجليد لا تزال العيوب الاساسيه لبطء تجميد6،7.
[تزجيج] يقدم ميزه علي [سلو-فريز] في ان أصابه واجبه إلى جليد تشكيل يكون تماما تفاديت بمباشره طور انتقال الماء داخل الزجاج دوله6. ومع ذلك ، للوصول إلى درجه حرارة التحول الزجاج من المياه النقية (-137 درجه مئوية) ، يجب تبريد المياه بمعدلات بترتيب 1,000,000 درجه مئوية في الثانية (اي معدل التبريد الحرجة) لتجنب تشكيل الجليد فوق درجه حرارة التحول الزجاج8 . أضافه CPAs يمكن ان تخفض معدل التبريد الحرجة وزيادة درجه حرارة التحول الزجاج من الحلول المائية9. ومع ذلك ، حتى مع تركيزات تكلفه الاكتساب العالية (علي سبيل المثال ، 40 ٪ v/v dmso أو اعلي) ومع ذلك فان معدلات التبريد السريع مطلوبه لعمليه التزجيج الناجحة8،9.
وتؤدي معدلات التبريد المطلوبة وتركيزات CPA العالية إلى عيبين رئيسيين في التزجيج. أولا ، لتمكين التبريد السريع ، يجب ان تكون العينات كتله حراريه منخفضه. ثانيا ، للوصول إلى تركيزات CPA عاليه مع تجنب الاصابه الاسموزي ، يجب إدخال CPAs ببطء ومعايرتها بالبالكامل بين المقصورات داخل وخارج الخلية6. وهذا يزيد من وقت التعرض للخلايا إلى CPAs السامة. معا ، وهذا يجعل التزجيج عمليه مرهقه التي تقتصر علي عدد قليل من العينات الصغيرة الحجم (ميكروليتر) في وقت واحد. وقد اقترح التزجيج التجميعي كحل محتمل لهذه القيود. من خلال تعريض قطرات الخلايا الضئيلة الحجم (نانولتر) إلى النيتروجين السائل ، فان معدل التبريد يزداد بشكل ملحوظ ، مما يسمح بالتالي بتخفيض كبير في تركيز CPA10،11،12 و13و14. علي الرغم من ان العديد من فوات توليد القطرات عاليه التردد يمكن استخدامها في وقت واحد ، فان حجم القطيرات الصغير للغاية يحد من الانتاجيه إلى ميكروليتر في الدقيقة10، مما يمنع التزجيج الفعال للخلية الكبيرة وحدات التخزين بمقادير اعلي من معدلات المعالجة بترتيب ملليلتر في الدقيقة.
وقد تبين مؤخرا ان هذه القيود المتاصله في التزجيج يمكن التغلب عليها بواسطة التزجيج التجميعي للقطيرات السائبة15. هذه الطريقة الجديدة تعزز الجفاف الاسموزي السريع للتركيز علي تركيز CPA داخل الخلايا من 7.5 ٪ v/v جلايكول الاثيلين و DMSO السابقة مباشره التزجيج ، والقضاء علي الحاجة إلى تاخيرمن كامله من تركيزات CPA السامة. يتم اجراء الجفاف الخلوي في جهاز فلويدريك عن طريق التعرض قصيرة من خلايا الكبد إلى تركيز CPA عاليه الخلية. علي الرغم من ان هذا التعرض يسبب الجفاف الاسموزي السريع ، فانه قصير جدا لتركيز CPA عاليه لتنتشر في الخلايا. مباشره بعد الجفاف ، يتم تحميل الخلايا في قطرات التي يتم المزجج مباشره في النيتروجين السائل. هذا الأسلوب يلغي الحاجة إلى الاستيعاب الكامل داخل الخلايا من تركيزات CPA عاليه في حين ان تركيز CPA عاليه الخلية تمكن من التزجيج من قطرات كبيره الحجم ، مما ادي إلى كميات عاليه الانتاجيه مع الحد الأدنى من سميه CPA.
التزجيج الحبريه يحسن القدرة علي البقاء المباشر وعلي المدى الطويل بعد الحفاظ عليها ، فضلا عن المورفولوجية ووظيفة الأيض من الخلايا الكبدية الرئيسية الفئران بالمقارنة مع الحفظ الكلاسيكي بالتبريد ببطء تجميد15. تقدم هذه المخطوطة التفاصيل المنهجية للتزجيج الحبريه السائبة من خلايا كبديه الفئران الاوليه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ العزلات الكبدية الاساسيه لهذا البروتوكول من قبل نواه الموارد الخلية (CRC) في مستشفي ماساتشوستس العام ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات الامريكيه. تمت الموافقة علي بروتوكول الحيوانية (#2011N000111) من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من مستشفي ماساتشوستس العام.
1-التزجيج الحبريه السائبة
- اعداد حلول التزجيج.
- أضافه 40 ملغ من الزلال المصل البقري (بوسنيا) إلى 17.0 مل من جامعه ويسكونسن الحل (UW) لجعل الحل التزجيج 1 (V1). تصفيه معقمه الحل V1 باستخدام فلتر 0.22 μm وتخزين في 4 درجه مئوية.
ملاحظه: UW هو الحل الحفاظ علي الجهاز المستخدمة بشكل شائع. انه يحتوي علي 50 g/l هيدروكسي ايثيل النشا ، 35.83 g/l حمض اللاكتوبيونيك ، 3.4 g/l فوسفات البوتاسيوم أحادي ، 1.23 g/l كبريتات المغنيسيوم هبت aهيدرات ، 17.83 g/l raffinose pentahydrate ، 1.34 g/l ادنودن ، 0.136 g/l الوبيورينول ، 0.992 g/l مجموع الجلوتاثيون ، 5.61 g /L هيدروكسيد البوتاسيوم ، وهيدروكسيد الصوديوم لضبط درجه الحموضة إلى 7.4. - الجمع بين 7.0 مل من UW ، 6.5 mL من DMSO ، 6.5 mL من الاثيلين جلايكول (EG) ، 40 ملغ من جيش صرب الجمهورية ، و 5.48 غرام من السكروز لجعل حل التزجيج 2 (V2). تصفيه معقمه الحل V2 باستخدام فلتر 0.22 μm. تحميل 3.5 مل من محلول العقيمة المصفاة V2 في حقنه 3 مل وتخزين في 4 درجه مئوية.
ملاحظه: لتسهيل حل CPAs ، يتم اعداد الحلول بكميات أكبر من المطلوب.
- أضافه 40 ملغ من الزلال المصل البقري (بوسنيا) إلى 17.0 مل من جامعه ويسكونسن الحل (UW) لجعل الحل التزجيج 1 (V1). تصفيه معقمه الحل V1 باستخدام فلتر 0.22 μm وتخزين في 4 درجه مئوية.
- اعداد جهاز التزجيج الحبريه السائبة.
- لاعداد ابره الخلط ، قطع أولا علي طول جانب واحد من الأكمام الرمادية الخارجية ابره خلط ، ومن ثم ثني الأكمام مفتوحة لأزاله من ابره الخلط.
- الشريحة 2 25 مم أنابيب السيليكون المقاطع علي مداخل الابره خلط وتامين موقفهم مع الغراء (الشكل 1ا).
- قطع الابره إلى طول 20 ملم (اي طول الحلزون خلط الداخلية) كما هو مبين في الشكل 1ا.
ملاحظه: طول ابره خلط يتناسب مع مستوي الصوت داخل الابره ، التالي يمكن تغييرها للسيطرة علي وقت التعرض للخلايا الكبدية إلى حل تركيز CPA عاليه. - ادخل ماخذ القطع لابره الخلط في ابره حقن 20 جرام (الشكل 1ب).
ملاحظه: حجم ابره الحقن يؤثر علي حجم القطيرات. - تعقيم الجمعية ابره خلط عن طريق التعقيم.
- أملا ديوار معقم بالنيتروجين السائل. تعقيم خارج ديوار مع ايزوبروبانول قبل وضع ديوار في الخلية العقيمة تدفق الخلايا الثقافة هود.
ملاحظه: التلوث هو اعتبار مهم اثناء التعرض المباشر للقطرات إلى النيتروجين السائل. علي الرغم من عدم وجود تلوث باستخدام النيتروجين السائل غير معقم في البروتوكول الحالي ، يمكن تصفيه النيتروجين السائل أو المشع لضمان العقم إذا لزم الأمر16. - ادراج قمع مع القطر الخارجي نفس القطر الداخلي لل dewar النيتروجين السائل إلى أنبوب مخروطي 50 mL لإنشاء جهاز جمع الحبريه (الشكل 1C−E).
- دمج جهاز تجميع القطرات في النيتروجين السائل بالضغط عليه ببطء في موضعه العمودي النهائي باستخدام ملقط كبير. تاكد من ان الأنبوب المخروطي يقع في وضع عمودي في أسفل الديوان (الشكل 1D−E).
ملاحظه: يجب ان يبقي القمع المدرجة في ويستريح علي أنبوب مخروطي الشكل. يجب ان يكون مستوي النيتروجين السائل 1 سم تحت ارتفاع مدخل القمع ، كما هو مبين في الشكل 1د. - جبل مضخة حقنه في موقف عمودي علي جدار هود ثقافة الخلية عن طريق ربط سلسله من القدمين مضخة حقنه لمسامير جاحظ من جدار الخلية الثقافة هود.
- ضع النيتروجين السائل ديوار مع جهاز تجميع الحبريه تحت مضخة حقنه عموديا (الشكل 1ه).
- قبل احتضان مع CPAs.
- بعد الحصول علي خلايا الكبد الفئران المعزولة الطازجة ، عد تركيز الأسهم من قبل الاستبعاد الأزرق تريبان واتخاذ 40,000,000 خلايا الكبد قابله للحياة.
ملاحظه: التعامل مع لطيف من خلايا الكبد في تعليق أمر بالغ الاهميه لمنع موت الخلايا. - الطرد المركزي في 50 x g لمده 5 دقائق دون الفرامل.
- يستنشق ماده طافي وأعاده التعليق علي خلايا الكبد في 3.4 مل من محلول V1.
- احتضان علي الجليد لمده 3 دقائق.
- أضافه 150 μL من DMSO و 150 μL من EG إلى خلايا الكبد وتخلط برفق.
- احتضان علي الجليد لمده 3 دقائق.
- مره أخرى ، أضافه 150 μL من DMSO و 150 μL من EG إلى خلايا الكبد وتخلط برفق.
- تحميل 3.5 mL في حقنه 3 مل.
- بعد الحصول علي خلايا الكبد الفئران المعزولة الطازجة ، عد تركيز الأسهم من قبل الاستبعاد الأزرق تريبان واتخاذ 40,000,000 خلايا الكبد قابله للحياة.
- اجراء التزجيج.
- ادراج حقنه مع الخلايا الكبدية قبل احتضان والمحاقن الحل V2 علي محول مضخة حقنه.
- نعلق اثنين من الإناث Luer قفل خرطوم المحولات بارب إلى المحاقن والانزلاق أنابيب السيليكون من الجمعية الخلط ابره علي التجهيزات بارب (الشكل 1و).
- وضع التجميع بأكمله في مضخة حقنه (الشكل 1ه).
- ثلاث دقائق بعد الاضافه الاخيره من DMSO و EG إلى الخلايا الكبدية ، وبدء المضخة في 2 مل/دقيقه.
- وقف المضخة بعد ان تم أضافه جميع الخلايا الكبدية إلى النيتروجين السائل.
2. تخزين المبردة
- ثقب 10 ثقوب صغيره في غطاء أنبوب مخروطي 50 mL باستخدام ابره 20 G والتفاف خارج الغطاء مع فيلم مرنه ، كما هو مبين في الشكل 1ب. هذا يخلق صمام التي تمكن من الهروب من تبخر بقايا النيتروجين السائل.
- لجمع قطرات الخلايا الكبدية المزجج ، أولا أزاله القمع من النيتروجين السائل ديوار. بعد ذلك ، استخدم ملقط طويل لأخذ الأنبوب المخروطي الذي يحتوي علي قطرات من النيتروجين السائل ويصب ببطء النيتروجين السائل الزائد من الأنبوب المخروطي.
- اغلق الأنبوب المخروطي مع الغطاء المثقوب وضع الأنبوب المخروطي المغلق مباشره مع قطرات الكبد اللاذعة مره أخرى في ديوار النيتروجين السائل.
- نقل أنبوب مخروطي من النيتروجين السائل إلى بخار النيتروجين السائل التبريد.
3. أعاده تسخين قطرات الكبد اللاذعة
-
اعداد حل أعاده التسخين.
- حل 17.13 غرام من السكروز في 100 mL من الاعلام الكبدي DMEM الثقافة لجعل حل أعاده الاحترار. تصفيه معقمه حل أعاده الاحترار باستخدام فلتر 0.22 μm ودافئه إلى 37 درجه مئوية.
-
أعاده تسخين خلايا الكبد.
- اتخاذ أنبوب مخروطي مع الخلايا الكبدية المزجج من البرد ونقلها في ديوار النيتروجين السائل إلى غطاء المحرك الثقافة الخلية.
- تخفيف طفيفه الغطاء ووضع الأنبوب المخروطي مره أخرى في النيتروجين السائل.
- أضافه قطرات الكبد المزجج إلى الكاس فارغه ، أضافه علي الفور الدافئة (37 درجه مئوية) حل أعاده الاحترار ، ويحرك فورا ل 10 ثانيه.
ملاحظه: من الضروري العمل بسرعة لتجنب التجمد اثناء أعاده التسخين. اعتمادا علي متطلبات الدراسة ، يمكن أعاده تسخين عدد قليل من جميع قطرات المزجج في ان واحد.
-
تفريغ الحل أعاده الاحترار.
- تقسيم الحل أعاده الاحترار مع خلايا الكبد أكثر من 2 50 مل أنابيب مخروطيه.
- الطرد المركزي الأنابيب المخروطية اثنين لمده 2 دقيقه في 100 x g في 4 درجه مئوية دون الفرامل.
- يستنشق ماده طافي لترك حجم الكلي من 12.5 ml باستخدام علامة التخرج أنبوب مخروطي الشكل كمرجع وأضافه 12.5 ml من الجليد dmem الباردة لكل أنبوب مخروطي لتخفيف الحل أعاده الاحترار إلى 50 ٪.
- أعاده تعليق خلايا الكبد واحتضان علي الجليد لمده 3 دقائق.
- أضافه 25 مل من الجليد DMEM الباردة لكل أنبوب مخروطي لتخفيف الحل أعاده الاحترار إلى 25 ٪.
- الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 50 x g في 4 درجه مئوية دون الفرامل.
- يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق خلايا الكبد في 2 مل من الثقافة المطلوبة المتوسطة للاستخدام.
ملاحظه: يمكن استخدام طرد التدرج الكثافة لأزاله خلايا الكبد الميتة من تعليق الخلية إذا رغبت في ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام خلايا الكبد الاوليه المعزولة الطازجة من خمسه كبد فئران مختلفه للمقارنة المباشرة للتزجيج الحبريه السائبة إلى الحجز الكلاسيكي بالتبريد باستخدام بروتوكولات التجميد البطيء البارزة المبلغ عنها في الأدبيات4، 5. باختصار ، تم تعليق خلايا الكبد في UW تستكمل مع جيش صرب البوسنيين (2.2 ملغ/مل) ، والجلوكوز (333 mM) ، و DMSO (10 ٪ v/v) والمجمدة باستخدام الفريزر معدل الخاضعة للرقابة. بعد التخزين في-196 درجه مئوية ، تم أذابه العينات في حمام الماء الدافئ. بعد كل الجليد ذاب ، تم تخفيف DMSO مباشره في حين تم خفض تركيز الجلوكوز تدريجيا خلال خطوات متعددة للحد من الإصابات الاسموزي. البروتوكول الدقيق يمكن العثور عليها بالتفصيل في مكان آخر15. وتراوحت فترات الحفظ بين يومين وثمانيه أيام وتمت مطابقتها بين التزجيج التجميعي بالجملة وتجميد التبريد لكل نسخه بيولوجية لضمان المقارنة المتساوية. علي الرغم من ان فترات الحفظ أقصر تم اختبارها لاعتبارات عمليه ، تجدر الاشاره إلى انه يمكن تخزين الخلايا الكبدية الاوليه في-196 درجه مئوية لسنوات دون فقدان القدرة علي البقاء5.
ينتج عن التزجيج التجميعي للقطرة السائبة قابليه الحفاظ علي الخلايا الكبدية بشكل مباشر بنسبه 79% ، مقيسا باختبار الاستبعاد الأزرق من التريان ، والذي يحدد سلامه الغشاء (الشكل 2ا). هذا هو اعلي بكثير من القدرة علي البقاء 68 ٪ بعد الكلاسيكية الأمثل التبريد. العائد من التزجيج الحبريه السائبة هو 56 ٪ التي هي 10 ٪ اعلي ، والاهم من ذلك أكثر اتساقا ، بالمقارنة مع الكلاسيكية التجميد (الشكل 2ب).
وكان النشاط الأيضي للخلايا الكبدية, يقاس باستخدام مقال الأيض الأزرق Presto في ثقافات ساندويتش الكولاجين علي المدى الطويل, اعلي بكثير بعد التزجيج الحبريه السائبة من بعد التجميد الكلاسيكي. الزلال التوليف ، وهو المعلمة الأكثر استخداما علي نطاق واسع من الوظيفة الاصطناعية من الخلايا الكبدية ، وكان أكبر من قبل ما يقرب من اثنين اضعاف بعد التزجيج قطره السائبة بالمقارنة مع الكلاسيكية التجميد (الشكل 3ا). إنتاج اليوريا هو المعلمة الأكثر استخداما علي نطاق واسع من وظيفة أزاله السموم من خلايا الكبد. بعد الثقافة لمده أسبوع واحد ، كان إنتاج اليوريا من الخلايا الكبدية السائبة الحبريه اعلي بكثير من الخلايا الكبدية الكلاسيكية بالتبريد (الشكل 3ب).
وباختصار ، التزجيج القطيرات السائبة يحسن القدرة علي البقاء مباشره بعد الحفظ والوظيفة الايضيه علي المدى الطويل من الخلايا الكبدية الفئران الاوليه في الثقافات ساندويتش الكولاجين ، بالمقارنة مع الحجز بالتبريد ببطء التجميد.
الشكل 1: الاعداد التجريبي لتزجيج القطرات السائبة.
(ا) توضيح كيفيه اعداد ابره الخلط وإرفاق قسمين من أنابيب السيليكون بمداخل ابره الخلط. (ب) توضيح لإدخال ابره خلط القطع في ابره الحقن لإكمال تجميع ابره الخلط. (ج) رسم إيضاحي لأنبوب مخروطي الشكل وال50 mL الذي يشكل جهاز تجميع القطرات. (د) رسم تخطيطي يبين موقف الأنبوب المخروطي ، والقمع ، ومستوي النيتروجين السائل في ديوار. (ه) تمثيل الاعداد الكامل التجريبي للتزجيجات الحبريه السائبة من أسفل إلى اعلي: النيتروجين السائل ديوار (رمادي) ؛ الجهاز مجموعه الحبريه التي يتم وضعها داخل النيتروجين السائل ديوار (واضح); الجمعية ابره خلط (واضحة الصفراء) تعلق علي المحاقن التي يتم وضعها في مضخة حقنه (الأحمر). (و) توضيح المحاقن وخلط ابره التجمع. وفرضت اثنين من المحاقن 3 مل في محول مضخة حقنه (الأزرق) ؛ وينبغي ملء حقنه واحده مع الخلايا الكبدية قبل احتضانها في حل V1 والاخر مع حل تركيز CPA عاليه (حل V2). يتم إرفاق الجمعية ابره خلط إلى المحاقن من قبل اثنين من الإناث Luer قفل خرطوم المحولات بارب. (ز) توضيح كيفيه إنشاء غطاء الأنبوب المخروطي للتخزين المبرد الذي يمكن بقايا النيتروجين السائل المبخر من الهروب من الأنبوب المخروطي اثناء تخزين قطرات الكبد اللاذعة. اعلي: غطاء مع ثقوب ثقب. أدناه: غطاء مثقوب ملفوفه مع فيلم مرن. قضبان المقياس: 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بقاء الخلايا الكبدية والغلة بعد الحفظ.
(ا) صلاحيه الخلايا الكبدية الطازجة (الرمادية) والمحفوظة بالتبريد (الزرقاء) والسائبة (الخضراء). (ب) محصول الحفاظ علي الخلايا الكبدية المعباه بالتبريد والقطرات السائبة. نجوم: p < 0.05 ([ويلكوكسون] يماثل-أزواج يوقع رتبه اختبار). شعيرات: دقيقه إلى حد اقصي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النشاط الأيضي في الثقافات ساندويتش الكولاجين علي المدى الطويل.
(ا) توليف ألبومين من الخلايا الكبدية الطازجة (الرمادية) والمحفوظة بالتبريد (الزرقاء) والسائبة (الخضراء) في أيام الثقافة 3 و 5 و 7. (ب) إنتاج اليوريا من الخلايا الكبدية الطازجة والمحفوظة بالتبريد والقطرات السائبة. النجوم: p < 0.05 (ANOVA باتجاه واحد متبوعا بتصحيح tukey للاختبارات المتعددة). أشرطه الخطا: الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحفظ بالتبريد من خلايا الكبد ببطء تجميد النتائج في انخفاض القدرة علي البقاء والتمثيل الأيضي وظيفة. يقدم التزجيج بديلا واعدا للحجز الكلاسيكي بالتبريد ، حيث يتم تجنب الاصابه بالتجمد تماما9. ومع ذلك ، مطلوب الحضانة مع CPAs لخفض معدل التبريد الحرجة8. التالي ، فان التسمم الذي تتعرض له الوحدة17 ويقتصر علي حجم العينات الصغيرة يعوق التزجيج. وفي اطار الجهود المبذولة للتغلب علي هذه القيود ، تم تطوير طريقه التزجيج التجميعي المقدمة في هذه المخطوطة للتمكين من التزجيج لكميات كبيره من الخلايا مع استخدام تركيز منخفض للاكتساب قبل الاحتضان15. هذا التزجيج قطره السائبة يؤدي إلى زيادة بقاء الخلايا الكبدية ووظيفة التمثيل الأيضي بالمقارنة مع الأكثر الأمثل بطيئه تجميد طريقه التبريد في الأدب. وهنا ، تقدم الأساليب الشاملة لتزجيج القطرات السائبة والرؤى التفصيلية في الجوانب العملية للإجراءات.
وتعد الخطوات المتعددة في البروتوكول بالغه الاهميه وتتطلب اهتماما إضافيا. ملء ديوار مع النيتروجين السائل غير معقمه يحتمل ان يؤدي إلى ظروف شبه معقمه. باستخدام الاحتياطات الموضحة في البروتوكول ، لم يتم الكشف عن اي تلوث خلال الثقافات ساندويتش الكولاجين علي المدى الطويل لدينا. غير انه يمكن اتخاذ تدابير تعقيم اضافيه إذا اقتضت الضرورة ذلك. يمكن تعقيم النيتروجين السائل عن طريق الإشعاع أو تصفيه16 والنظام قد تكون مغلقه تماما مع غطاء علي ديوار النيتروجين السائل مع مدخنه متصلة بابره الخلط. وبدلا من ذلك ، يمكن استكشاف أساليب التزجيج بالقطرات غير الملامسة ، علي الرغم من ان هذا قد يحد من الانتاجيه الأكبر للحجم14.
ومن الأجزاء الاساسيه الأخرى للبروتوكول فترات الحضانة السابقة للتحميل والتفريغ. يمكن ان تؤدي المدد الأطول إلى أصابه التكلفة السامة للاكتساب بينما قد تسبب الفترات الأقصر أصابه بالتسمم الكلوي. أيضا ، من المهم لضمان ان القطرات الكبدية المزجج دائما البقاء تحت درجه حرارة التحول الزجاج لان الكلي غير المنضبط والمجهرية الجليد النوى في درجات حرارة اعلي يؤدي إلى أصابه الخلايا الكبدية الحاده وموت الخلية. من الناحية العملية ، فان الخطوة الأكثر اهميه في التزجيج الحبريه السائبة هي أعاده احترار قطرات الكبد اللاذعة. عندما يتم أزاله قطرات المزجج من النيتروجين السائل انها يمكن ان تجمد في غضون ثوان إذا لم يتم أعاده تسخينها بسرعة عن طريق أضافه علي الفور الساخنة حل أعاده الاحترار.
ويمكن ان يؤدي التحسين المستقبلي لعمليات التزجيج الحبريه السائبة إلى زيادة تحسين نتائج الحفظ ، مثل القدرة علي البقاء ، والغلة ، والوظيفة الايضيه. ويمكن اختبار كل من CPAs المنفذة وغير المنفذة لتحسين الجفاف الاسموزي قبل التزجيج. وهذا يمكن ان يقلل من الصدمة الاسموزي اثناء الجفاف ، وقد يسمح أيضا لإنقاص تركيزات CPA قبل احتضانها. بالاضافه إلى ذلك ، فلويدريك المستمر ، بدلا من batchwise ، CPA قبل الحضانة من شانه ان يسمح نظريا التزجيج من كميات الخلايا غير محدود. لان المعدات المختبرية العامة فقط مطلوبه لتزجيج القطيرات السائبة ، فهي طريقه بسيطه وفعاله من حيث التكلفة يمكن استخدامها للحفاظ علي أنواع الخلايا الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ المصالح المالية المتنافسة. وقد طلبات البراءات المؤقتة ذات الصلة بهذه الدراسة من قبل الاستخبارات الخاصة. الدكتور يوغون لديه مصلحه مالية في الاجهزه الحلول ، وهي شركه تركز علي تطوير الجهاز الحفاظ علي التكنولوجيا. تدار جميع اهتمامات الباحثين من قبل وزاره الصحة العامة وشركاء الرعاية الصحية وفقا لسياسات تضارب المصالح الخاصة بهم.
Acknowledgments
التمويل من المعاهد الوطنية الامريكيه للصحة (R01DK096075, R01DK107875, و R01DK114506) ووزارة الدفاع الامريكيه (وزاره الخارجية RTRP W81XWH-17-1-0680) ومن المسلم به إلى حد كبير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M - Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R.
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A.
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E.
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G.
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al.
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
