ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離
Summary
成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。
Abstract
中枢神経系の常駐マクロファージとして、ミクログリアは脳の発達と恒常性を積極的に制御し、その機能不全がヒト疾患を駆動する可能性がある。恒静性ミクログリアの分子シグネチャや、環境刺激に応じた遺伝子発現の変化を明らかにするために、かなりの進歩が見られた。単一細胞ゲノム方法論の出現と成熟により、異種ミクログリアは、異なる発達および病理学的条件において果たす多様な役割の根底にある可能性がますます認識されています。このような不均一性のさらなる解剖は、目的の所定の領域からミクログリアを効率的に分離することによって達成され、続いて個々の細胞の敏感なプロファイリングが行われる。ここでは、単一の成人マウス脳半球における異なる脳領域からのミクログリアの迅速な分離のための詳細なプロトコルを提供する。また、プレートベースのディープシングルセルRNAシーケンシングにこれらのソートミクログリアを使用する方法も示します。この方法の適応性を他のシナリオに議論し、大規模な研究に対応するためのシステム改善のためのガイドラインを提供する。
Introduction
ミクログリアは、全神経細胞の5%−10%を表し、中枢神経系(CNS)1全体に散在するマクロファージである。血液脳関門の背後で保護され、健康な成人の脳の典型的なミクログリアは、急速に拡張し、毛陰腫のニューロンや他のグリア細胞と相互作用するために後退する多くの微細なプロセスを含んでいます。ミクログリアはまた、特定の発達段階の間、または傷害および疾患1、2、3、4における免疫上の課題に関連する貪食性形態を採用することができる。最近のエキサイティングな発見は、ミクログリアが脳由来または病理学的シグナルに対して決して受動的な傍観者ではなく、脳の発達と恒常性を制御する上で極めて重要な役割を果たすことを明らかに示している。ミクログリアのより多くの機能が解明されるにつれて、TREM2のような多くの神経変性疾患リスク遺伝子がミクログリア5、6、7によって主にまたは排他的に発現されることを示したヒト遺伝学研究によって興奮がさらに促進される。開発における彼らの意義ともっともらしい疾患駆動の役割を考えると、神経変性疾患1、8の新しい治療標的を見つけることを期待して、近年、微小グリア遺伝子の調節と機能の理解に向けて多大な努力が払われている。
RNAシーケンシング(RNA-seq)は、細胞型特異的遺伝子発現の偏りのない特徴付けを可能にし、これにより科学者が高密度細胞ネットワーク7における遺伝子機能を調査するよう導く。RNA-seqは、主にバルクサンプル上で行われていたが、他の神経細胞および免疫細胞9とそれらを区別する恒静性微小グリア遺伝子シグネチャの発見につながった。しかし、このようなアプローチは、ミクログリア、特に開発中に一過性に存在するミクログリア間の分子的および機能的な違いを見落とす可能性があり、老化や疾患に関連する。実際、単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)は、様々な文脈2、3、10においてミクログリアの不均一性を以前に過小評価したことを明らかにすることによって、フィールドに革命をもたらした感度と分解能を提供する。さらに、CNS循環界面に他の同様の免疫細胞が存在するため、scRNA-seqは、これらの関連細胞を分離し、機能的に解剖するための新しいツールの設計を助ける情報を提供する。
scRNA-seqプラットフォームの多様な配列が発明され、それぞれが特定のアプリケーション12に適しています。一般に、10xゲノミクスのような液滴ベースの方法は、各実行で配列された数千個の細胞とのスループットが高く、広範な分類を必要とする混合細胞集団を含む可能性のある入力に対する選択性が低くなります。プレートベースの方法は、より高い感度と読み取り深さ13、14を提供し、通常、微妙な違いやまれなトランスクリプトを明らかにするために、細胞ソートから特定の集団を対象とします。ミクログリア細胞の小さな割合、特に開発または疾患関連のサブ集団を考えると、すべてのCNS細胞型の中で、ミクログリアを特定の目的領域から単離し、それらの異質性を理解するために深く、全長の転写情報を得ることがしばしば望ましい。
ここでは、半自動化されたプレートベースのライブラリ調製手順に従って単一細胞(またはバルク)RNA-seqに使用される単一半球から解剖された異なるマウス脳領域からミクログリアを分離する方法について詳しく説明します。その後、他の半球を組織学的検証に使用できます。以前に公開された方法9から合理化されたこの絶縁プロトコルは、少量の出発物質からの歩留まりを最大化し、一方で内因性微小グリア遺伝子発現プロファイルを維持することを目的とする。蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、ミクログリア(または対象の他の関連免疫細胞)を96ウェルプレートに濃縮し、ライブラリ調製用試薬の量を小型化してスループットを向上させます。我々は、他のプレートベースの戦略が適用される可能性があるが、この敏感なscRNA-seqプラットフォームを強調する。この方法は、損傷や疾患病巣などの他の解剖組織からミクログリアを分離するために容易に適応することができ、マウスの年齢は、ほぼすべての出生後段階にわたって変化し得る。単一細胞トランストランスクリプトミクス研究のための局所ミクログリアの効率的な分離は、健康および疾患におけるその機能のより良い理解を促進する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ミクログリアは、CNSの他の細胞タイプと積極的に相互作用し、環境刺激に非常に敏感です。単離過程における炎症反応および遺伝子発現の異常変化を最小限に抑えるために、このプロトコルは以前に公開された方法9から合理化され、ミクログリアを単一マウス脳半球の複数の領域から並列に分離するのに適している。組織および試薬は冷温に保たれ、実験は限られた組織サ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、このプロトコルの開発中に彼らの助けをマリコL.ベネット、リアナニコールボナンノ、およびスパイロスダルマニスに感謝します。また、スタンフォード・シェアドFACS施設、特にメレディス・ウェグラーツとリサ・ニコルズに感謝します。スタンフォード・プロテイン・アンド・核酸施設(PAN)のヤン・トラン、マイケル・エッカートが撮影を大いにサポート。この作品は、JPB財団とヴィンセント・J・コーツ財団が出資しています。
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
Riferimenti
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