Summary
Lanthipeptide synthetases katalyseren multistep reacties tijdens de biosynthese van peptide natuurlijke producten. Hier beschrijven we een continue, bottom-up, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) workflow die kan worden gebruikt om de conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetases te bestuderen, evenals andere vergelijkbare enzymen die betrokken zijn bij peptide natuurlijke productbiosynthese.
Abstract
Waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) is een krachtige methode voor de biofysische karakterisering van enzym conformationele veranderingen en enzym-substraat interacties. Een van de vele voordelen, HDX-MS verbruikt slechts kleine hoeveelheden materiaal, kan worden uitgevoerd onder bijna inheemse omstandigheden zonder de noodzaak van enzym / substraat etikettering, en kan ruimtelijk opgeloste informatie over enzym conformationele dynamiek - zelfs voor grote enzymen en multiproteïne complexen. De methode wordt geïnitieerd door de verdunning van het enzym van belang in de in D2O bereide buffer. Dit activeert de uitwisseling van protium in peptide bond amides (N-H) met deuterium (N-D). Op de gewenste uitwisselingstijdpunten worden reactie aliquots gedoofd, wordt het enzym geprotelyseerd tot peptiden, worden de peptiden gescheiden door ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC) en wordt de verandering in massa van elk peptide (als gevolg van de uitwisseling van waterstof voor deuterium) geregistreerd door MS. De hoeveelheid deuteriumopname door elk peptide is sterk afhankelijk van de lokale waterstofbindingsomgeving van dat peptide. Peptiden aanwezig in zeer dynamische gebieden van het enzym uitwisseling deuterium zeer snel, terwijl peptiden afgeleid van goed geordende regio's ondergaan uitwisseling veel langzamer. Op deze manier rapporteert de HDX-rate over lokale enzymconformatiedynamiek. Verstoringen van de deuteriumopnameniveaus in aanwezigheid van verschillende liganden kunnen vervolgens worden gebruikt om ligandbindende locaties in kaart te brengen, allosterische netwerken te identificeren en de rol van conformationele dynamiek in de enzymfunctie te begrijpen. Hier illustreren we hoe we HDX-MS hebben gebruikt om de biosynthese van een type peptide natuurlijke producten genaamd lanthipeptiden beter te begrijpen. Lanthipeptiden zijn genetisch gecodeerde peptiden die post-translationeel worden gewijzigd door grote, multifunctionele, conformationeel dynamische enzymen die moeilijk te bestuderen zijn met traditionele structurele biologiebenaderingen. HDX-MS biedt een ideaal en aanpasbaar platform voor het onderzoeken van de mechanistische eigenschappen van dit soort enzymen.
Introduction
Eiwitten zijn structureel dynamische moleculen die verschillende conformaties bemonsteren op tijdschalen, variërend van femtoseconde-schaal bindingstrillingen tot herschikkingen van hele eiwitdomeinen die gedurende vele seconden kunnen optreden1. Deze conformationele fluctuaties zijn vaak kritische aspecten van de enzym/eiwitfunctie. Conformationele veranderingen veroorzaakt door ligandbinding zijn bijvoorbeeld vaak van cruciaal belang voor het moduleren van de enzymfunctie, hetzij door het organiseren van actieve plaatsresiduen die nodig zijn voor katalyse, het definiëren van substraatbindende locaties in sequentiële kinetische mechanismen, het afschermen van reactieve tussenproducten van de omgeving, of door het moduleren van de enzymfunctie via allosterische netwerken. Recente studies hebben ook aangetoond dat conformationele dynamica gedurende de gehele evolutie kan worden behouden en dat verstoringen van geconserveerde moleculaire bewegingen kunnen worden gecorreleerd met veranderingen in substraatspecifiekheid en de opkomst van nieuwe enzymfuncties2,3.
In de afgelopen jaren is waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) snel naar voren gekomen als een krachtige techniek om te onderzoeken hoe eiwitconforme landschappen reageren op verstoringen zoals ligandbinding of mutagenese4,5,6,7. In een typisch HDX-MS-experiment(figuur 1)wordt een interessant eiwit in een buffer geplaatst die is bereid in D2O, waardoor protonen die oplosmiddelen kunnen worden uitgewisseld, worden vervangen door deuteria. De wisselkoers van de amidemoiety van de peptidebindingen hangt sterk af van de pH, de lokale aminozuursequentie en van de lokale structurele omgeving van de amide8. Amiden die zich bezighouden met waterstofbindingsinteracties (zoals die aanwezig zijn in α-helices en β-sheets) wisselen langzamer uit dan amides in ongestructureerde gebieden van het eiwit die worden blootgesteld aan bulkoplosmiddel. De omvang van de deuteriumopname is dus een weerspiegeling van de structuur van het enzym. Enzymen die conformationeel dynamisch zijn, of die structurele overgangen ondergaan bij ligandbinding, zouden naar verwachting een meetbare HDX-respons opleveren.
De mechanistische basis voor de trage wisselkoers van een gestructureerdeamide is weergegeven in figuur 25,8,9. Om HDX te ondergaan, moet het gestructureerde gebied eerst een uitgevouwen conformatie tijdelijk bemonsteren, zodat de oplosmiddelmoleculen die hdx-uitwisseling katalyseren via een specifiek zuur/base chemisch mechanisme, toegang hebben tot het verwisselbareamide. Uiteindelijk bepalen de relatieve omvang van de chemische wisselkoers (kchem) en de vouw - en vouwkoersen (kopen en ksluiten) de HDX-koers gemeten in het experiment5,8. Vanuit dit eenvoudige kinetische model is het duidelijk dat de mate van deuteriumopname de onderliggende conformationele dynamiek weerspiegelt (zoals gedefinieerd door kopen en kclose). De meeste HDX-MS-experimenten worden uitgevoerd in een bottom-up workflow waarbij, na de uitwisselingsreactie, het eiwit van belang wordt verteerd in peptiden en de deuteriumopname door elk peptide wordt gemeten als een toename van massa7. Op deze manier maakt HDX-MS het mogelijk om verstoringen van enzymconformatiedynamiek in kaart te brengen op de lokale ruimtelijke schaal van peptiden, waardoor de onderzoeker kan beoordelen hoe de verstoring de dynamiek in verschillende regio's van het enzym van belang verandert.
De voordelen van de HDX-MS-aanpak voor het ophelderen van de structurele dynamiek van eiwitten zijn talrijk. Ten eerste kan de methode worden uitgevoerd met kleine hoeveelheden inheems eiwit of op eiwitcomplexen in systemen met quaternaire structuur10. Het is zelfs niet nodig dat het enzympreparaat dat in de test wordt gebruikt, sterk wordt gezuiverd11,12, zolang de bottom-up HDX-MS-workflow een voldoende aantal zelfverzekerd geïdentificeerde peptiden biedt die de eiwitsequentie van belang dekken. Bovendien kan HDX-MS informatie verstrekken over conformatiedynamiek onder bijna inheemse omstandigheden zonder dat locatiespecifieke eiwitetikettering nodig is, zoals zou worden gebruikt in fluorescentiestudies met één molecuul13, en er is geen groottelimiet voor het eiwit - of eiwitcomplex dat kan worden onderzocht (waardoor benaderingen zoals nucleaire magnetische resonantie [NMR] spectroscopie uitdagend zijn)7,14. Ten slotte kunnen tijd-opgeloste HDX-MS-methoden worden gebruikt om intrinsiek verstoorde eiwitten te bestuderen, die moeilijk te bestuderen zijn met röntgenkristallografie15,16,17,18. De belangrijkste beperking van HDX-MS is dat de gegevens een lage structurele resolutie hebben. HDX-MS-gegevens zijn nuttig om aan te geven waar de conformatiedynamiek verandert en om gekoppelde conformationele veranderingen te onthullen, maar ze geven vaak niet veel inzicht in het precieze moleculaire mechanisme dat de waargenomen verandering aanstuurt. Recente vooruitgang in de combinatie van elektronenafvangdissociatiemethoden met eiwit HDX-MS-gegevens heeft veelbelovend aangetoond voor het in kaart brengen van uitwisselingslocaties naar enkelvoudige aminozuurresiduen19, maar follow-up biochemische en structurele studies zijn nog steeds vaak nodig om duidelijkheid te verschaffen aan structurele modellen die worden doorgestuurd door HDX-MS-gegevens.
Hieronder wordt een gedetailleerd protocol voor de ontwikkeling van een HDX-MS-test gepresenteerd20. De onderstaande monstervoorbereidingsprotocollen moeten algemeen toepasbaar zijn op elk eiwit dat een goede oplosbaarheid vertoont in waterige buffers. Er zijn meer gespecialiseerde monsterbereidingsmethoden en HDX-MS-workflows beschikbaar voor eiwitten dan in aanwezigheid van detergentia of fosfolipiden21,22,23,24. Instrumentele instellingen voor HDX-MS-gegevensverzameling worden beschreven voor een quadrupole-tijd-of-flight massaspectrometer met hoge resolutie gekoppeld aan een vloeistofchromatografiesysteem. Gegevens over vergelijkbare complexiteit en resolutie kunnen worden verzameld op een van een aantal in de handel verkrijgbare lc-ms-systemen (liquid chromatography-mass spectrometry). Belangrijke aspecten van de gegevensverwerking met behulp van een commercieel beschikbaar softwarepakket worden ook verstrekt. We presenteren ook richtlijnen voor het verzamelen en analyseren van gegevens die in overeenstemming zijn met aanbevelingen van de bredere HDX-MS-gemeenschap12. Het beschreven protocol wordt gebruikt om de dynamische structurele eigenschappen van HalM2 te bestuderen, een lanthipeptide synthetase dat de multistep rijping van een antimicrobieel peptide natuurlijk product katalyseert20. We illustreren hoe HDX-MS kan worden gebruikt om substraatbindingssites en allosterische eigenschappen te onthullen die eerdere karakterisering hebben ontweken. Verschillende andere protocollen inzake eiwit HDX-MS zijn de afgelopen jaren gepubliceerd25,26. Samen met het huidige werk moeten deze eerdere bijdragen de lezer enige flexibiliteit bieden in experimenteel ontwerp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van gedeutereerde reagentia en enzymvoorraadoplossingen
- Bereid reagentia die nodig zijn voor de HDX-reacties (inclusief eventuele buffers, zouten, substraten, liganden, enz.) voor als 100−200x geconcentreerde stamoplossingen in D2O (99,9% atoomfractie D). Bereid ten minste 50 ml buffervoorraadoplossing voor.
OPMERKING: Voor de karakterisering van HalM2 werden de volgende oplossingen voorbereid: 500 mM MgCl2, 100 mM tris (2-carboxyethyl)fosfine (TCEP), 750 mM ATP (in HEPES-buffer), 800 mM HEPES pD 7.1, 500 μM HalA2 en 500 mM AMPPNP. - Vries en lyofieleer de voorraadoplossingen voor droogheid.
- Re-dissolve in D2O, en herhaal lyophilization cyclus ten minste één extra keer om zoveel mogelijk van de verwisselbare protonen te vervangen door deuterons mogelijk.
- Pas de pD van de gedeutereerde HEPES-buffervoorraad aan op de gewenste waarde met geconcentreerde NaOD/DCl, rekening houdend met de volgende relatie27:
OPMERKING: De amide HDX-snelheid is sterk afhankelijk van de pL van de oplossing (pL = pH of pD)5. Verschillende partijen buffervoorraadoplossingen moeten op dezelfde manier worden bereid, opgeslagen en gebruikt om een lichte pL-drift tussen experimenten te voorkomen. - Bereken de hoeveelheid van elk reagens die nodig is voor een HDX-test van 300 μL en bewaar aliquots voor eenmalig gebruik bij -80 °C.
- Bereid een geconcentreerde enzymvoorraadoplossing (~100−200 μM) in geprotieerde enzymopslagbuffer met behulp van een centrifugaalfilter(tabel met materialen)of een gelijkwaardig apparaat.
OPMERKING: De exacte buffer en centrifugaalfilter moleculaire gewicht cutoff zal afhangen van het eiwit / enzym van belang. HalM2 wordt opgeslagen in 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM KCl en 10% glycerol. 10 kDa-filters werden gebruikt om het geconcentreerde enzym te bereiden. - Aliquot het enzym in porties voor eenmalig gebruik en bewaar bij -80 °C.
OPMERKING: Dit kan een stopplaats zijn. Alle in punt 1 beschreven voorraadoplossingen kunnen voorafgaand aan de HDX-reacties worden voorbereid. Bij opslag bij -80 °C zullen de meeste enzymen/gedeutereerde voorraadoplossingen vele maanden stabiel zijn.
2. Kalibratie van het HDX-blusvolume
- Bereid een HDX-reactie van 300 μL in D2O met behulp van de in rubriek 1 bereide gedeutereerde reagentia en geconcentreerde enzymvoorraden.
- Gebruik een uiteindelijke enzymconcentratie van 1−5 μM.
- Gebruik een laatste gedeutereerde HEPES-bufferconcentratie van ten minste 50−100 mM.
- Zorg ervoor dat de concentraties van andere componenten voldoende zijn om de gewenste enzymactiviteit/functie te behouden.
- Bereid 1 L HDX-blusoplossing (100 mM fosfaat, 0,8 M guanidine-HCl, pH 1,9). Invriezen en bewaren in zowel porties van 50 ml (voor langdurige voorraad) als porties van 1 ml (voor aliquots voor eenmalig gebruik).
OPMERKING: De exacte samenstelling van de blusbuffer is afhankelijk van het enzym dat wordt gebruikt in de proteolysestap van de bottom-up HDX-MS-workflow (stap 3.3.3). De hier gegeven quench buffer is compatibel met pepsine, het meest gebruikte protease voor HDX-MS. Als een ander protease wordt gebruikt, neem dan contact op met de proteaseleverancier om buffercompatibiliteit te garanderen. - Kalibreer het volume van de blusbuffer die nodig is om de uiteindelijke pL van het gedoofde HDX-reactiemengsel aan te passen aan een pH-meterwaarde van 2,3.
OPMERKING: De oplosmiddel H/D-wisselkoers van de peptideamide N-H-binding is een pH-afhankelijk proces dat onderhevig is aan zowel zuur- als basekatalyse. De minimale wisselkoers vindt plaats bij een waarde van pH 2,5 (pH-meterwaarde = 2,3 voor een mengsel van 50:50 H2O:D2O). Een uiteindelijke pL-waarde in de buurt van 2,5 minimaliseert dus de uitwisseling van waterstofruggen die optreedt tijdens de bottom-up LC-MS-analyse, waardoor het deuteriumlabel in de peptiden behouden blijft.- Meng 50 μL van het HDX-reactiemengsel uit stap 2.1 met 50 μL blusbuffer en meet de pL van het gedoofde mengsel met een microtipelektrode.
- Verhoog het volume van de blusoplossing indien nodig om de uiteindelijke pH-meterwaarde aan te passen tot een waarde van 2,3.
- Zodra het juiste blusvolume is bepaald, herhaalt u het blusproces meerdere keren met verse 50 μL aliquots uit de HDX-reactie (stap 2.1) om ervoor te zorgen dat een consistente uiteindelijke pL wordt bereikt na toevoeging van een vaste hoeveelheid blusbuffer.
3. Opstellen van referentievoorbeelden en optimalisatie van de bottom-up LC-MS workflow
- Bereid niet-gedeutereerde referentiemonsters voor het eiwit dat van belang is voor drievoud in buizen van 0,5 ml. Zorg ervoor dat de omstandigheden van het uiteindelijke reactiemengsel identiek zijn aan die welke worden gebruikt bij de authentieke HDX-reacties (stap 2.1), behalve dat de reacties in H2O worden bereid met behulp van reagensvoorraadoplossingen die ook in H2O zijn bereid.
- Blus de monsters zoals in stap 2.3 door het juiste volume blusbuffer toe te voegen om de uiteindelijke pH aan te passen aan 2,5. Vries de monsters in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C totdat ze klaar zijn voor analyse.
- Analyseer de geprotieerde enzymreferentiemonsters met behulp van een bottom-up LC-MS-workflow.
OPMERKING: Voordat u deze stappen uitvoert, moet het LC-MS-systeem dat moet worden gebruikt voor het verzamelen van gegevens correct worden gekalibreerd en klaar zijn voor gebruik. De timing en temperatuur van alle stappen in de bottom-up LC-MS-workflow moeten streng worden gecontroleerd om verschillen in ruguitwisseling tussen monsters te minimaliseren. Met de MS-instrumentatie die in dit protocol wordt gebruikt (Tabel met materialen En Ondersteunende informatie), kunnen de meeste stappen worden bediend via de instrumentsoftware. Om ervoor te zorgen dat nauwkeurige replica's worden gemaakt, wordt aanbevolen om zoveel mogelijk stappen in de werkstroom te automatiseren.- Haal een individueel enzymreferentiemonster (bereid als in stap 3.2) uit de vriezer en ontdooi gedurende 1 minuut bij 37 °C in een waterbad.
- Injecteer op precies 2 minuten na het verwijderen van het monster uit de vriezer en ontdooien een 40 μL-gedeelte van het gedoofde referentiemonster in een ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC) kolom (2,1 x 30 mm, 300 Å, 5 μM) met een stationaire fase gefunctionaliseerd met pepsine (een zuurstabieal protease).
- Verteer het monster met een debiet van 100 μL/min gedurende 3 min bij 15 °C met 0,1% mierenzuur in H2O (pH = 2,5) als oplosmiddel.
- Verzamel de peptische peptiden terwijl ze uit de pepsinekolom op een C18-valkolom van 0,4 °C komen om de uitwisseling van de rug te minimaliseren.
- Geef de ontzoute peptische peptiden van de valkolom door aan een C18-analytische kolom (1 mm x 100 mm, 1,7 μM, 130 Å) die bij 0,4 °C wordt gehouden en gebruikt voor de scheiding van de peptische peptiden.
OPMERKING: Stappen 3.3.3−3.3.5 kunnen worden geautomatiseerd door bepaalde LC-MS-systemen die worden gebruikt voor hdx-MS-gegevensverzameling. Als alternatief kunnen deze stappen onafhankelijk worden uitgevoerd, rekening houdend met het feit dat de timing en temperatuur van elke stap zorgvuldig moeten worden gecontroleerd om een consistent lage ruguitwisseling te bereiken. - Elute de C18 kolom met een acetonitril/water/0,1% mierenzuur oplosmiddel systeem. Optimaliseer de LC-gradiënt voor het eiwit van belang om de scheiding van en het behoud van het deuteriumlabel in de peptische peptiden te maximaliseren.
OPMERKING: Details over verloop elutie vindt u in de ondersteunende informatie. - Onderwerp de peptische digest aan elektrospray ionisatie (ESI) massaspectrometrie.
OPMERKING: De bronomstandigheden in de ondersteunende informatie zorgen voor voldoende ionisatie voor de meeste peptische peptiden.- Eenmaal geïoniseerd in het MS-instrument, voert u een ionenmobiliteitsscheiding in de gasfase uit met stikstof als buffergas om de piekcapaciteit van de methode te verbeteren.
- Na de ionenmobiliteitsscheiding worden de peptische peptideprecursoren onderworpen aan een MSE-workflow met afwisselende cycli van lage botsingsenergie (4 V) en hoge botsingsenergie (21−40 V).
OPMERKING: De afwisselende lage en hoge botsingsenergieregimes maken het mogelijk om MS-gegevens (lage botsingsenergie) tegelijkertijd met MSMS-gegevens (hoge botsingsenergie) te verzamelen. Dit maakt op zijn beurt de tijdcorrelatie van precursorionen met hun respectieve fragmentionen mogelijk. Deze correlatie is essentieel voor een zekere identificatie van peptiden zoals beschreven in rubriek 4. - Detecteer de peptideprecursor en fragmentionen met behulp van een massaanalysator met een oplossend vermogen van ten minste 20.000.
- Gelijktijdig met de gegevensverwerving, verwerven MS-gegevens voor een [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) externe standaard.
OPMERKING: De MS-werkstroom die in stap 3.3.7 wordt beschreven, wordt een MSE-protocol genoemd. Volledige instrumentele instellingen voor een MSE-protocol dat geschikt is voor bottom-up HDX-MS zijn opgenomen in de ondersteunende informatie.
- Beoordeel de kwaliteit van de LC-MS data.
OPMERKING: Met behulp van het hierboven beschreven protocol en de instrumentele instellingen in de ondersteunende informatiemoeten de referentiemonsters een totaal ionenchromatogram produceren met een maximale signaalintensiteit van ongeveer 1 x 108. Er moeten veel peptische peptiden eluting tussen 3−9 min (Figuur 3A−C). - Injecteer 40 μL blanco monsters (0,1% mierenzuur in water) om de pepsine- en analytische C18-kolommen te reinigen.
OPMERKING: Over het algemeen moeten 2−3 spaties voldoende zijn. - Herhaal stap 3.3.1−3.3.9 voor elk van de drievoudsmonsters van referentie-eiwit.
4. Verwerking van de referentiegegevens en het definiëren van een peptidelijst
- Analyseer de ruwe MSE-gegevens (stap 3.3.7) met behulp van proteomics-software (Table of Materials). Navigeer met behulp van de proteomics-software naar Bibliotheken | Protein Sequence Databanks om de eiwitdatabase te definiëren door de aminozuursequentie van het eiwit van belang te importeren.
OPMERKING: Het doel van deze stap is om de referentie-MS-gegevens te doorzoeken op peptische peptiden afgeleid van het eiwit van belang, en om de MSMS-gegevens (gelijktijdig verkregen met de MS-gegevens) te gebruiken om eventuele putatieve peptide-identificaties te valideren. - Geef een naam aan de eiwitsequentie van belang. Importeer de eiwitsequentie (in FASTA-formaat). De software zal een in silico vertering van het database-eiwit uitvoeren om een lijst met peptiden te genereren die zullen worden gebruikt om de LC-MS-gegevens te doorzoeken.
- Definieer de verwerkingsparameters (onder het menu Bibliotheek). Selecteer Electrospray MSE als het type gegevensverwerving. Voer in het veld Lock Mass for Charge 2 785.8426 in voor de m/z voor het 2+ ion van [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) en klik op voltooien.
- Definieer de werkstroomparameters (onder het menu Bibliotheek).
- Selecteer Electrospray MSE voor het zoektype. Onder de workflow | Kop databasezoekquery selecteert u het database-eiwit dat is gemaakt in stap 4.2 in het veld Database.
- Wijzig Primair digestreagens in aspecifieke en wis het veld Vaste modificator-reagens door de Ctrl-knop ingedrukt te houden terwijl u op Carbamidomethyl Cklikt.
- Geef de uitvoermap op door naar opties | automatiseringsopstelling | Identiteit E. Vink de vakjes aan voor Apex 3D en Peptide 3D Output en Ion Accounting Output en geef de gewenste directory op.
- De referentievoorbeeldgegevens verwerken.
- Maak op de linker gereedschapsbalk van de proteomics platformwerkruimte een nieuwe plaat door met de rechtermuisknop op Microtiter Platete klikken. Markeer drie putten in de microtiterplaat (één voor elk referentiemonster dat in punt 3 wordt verzameld). Klik met de linkermuisknop in één put, houd ingedrukt en sleep naar drie putten.
- Klik met de rechtermuisknop en selecteer onbewerkte gegevens toevoegen. Navigeer in het venster dat wordt weergegeven naar de map met de drie referentiebestanden uit sectie 3 en selecteer ze tegelijkertijd.
- Klik op volgende en kies de verwerkingsparameters die zijn gedefinieerd in stap 4.3. Klik op volgende en selecteer de workflowparameters die zijn gedefinieerd in stap 4.4. Klik vervolgens op voltooien.
- Zodra de onbewerkte gegevens, verwerkingsparameters en workflowparameters aan elke put op het bord zijn toegewezen, verschijnen de putten blauw. Selecteer de putten, klik met de rechtermuisknop en selecteer de nieuwste onbewerkte gegevens verwerken. Klik op de rechterbenedenhoek van het venster om de verwerking van de gegevens bij te houden. Zodra het bericht Geen taak meer hoeft uit te voeren, is de verwerking volledig voltooid.
- Nadat de gegevensverwerking is voltooid, worden de putten in de plaat groen. Klik met de rechtermuisknop op de putten en selecteer werkstroomresultaten weergeven. Voor elk referentiegegevensbestand wordt een afzonderlijk venster geopend.
- Inspecteer de gegevens om er zeker van te zijn dat de meeste MS-signalen in de referentiemonstergegevens met succes zijn toegewezen aan peptiden die zijn voorspeld door de in-silico-vergisting van het eiwit van belang. Overeenkomende peptiden worden blauw gekleurd in het uitgangsspectrum (figuur 4). Dubbelklik op het OK-filter en controleer of de procentuele dekking groter is dan 99%.
OPMERKING: Bij de verwerking wordt de gegevensuitvoer automatisch opgeslagen met de bestandsextensie(raw_data_file_name_IA_final_peptide) in de map die is opgegeven in stap 4.5. - Importeer de proteomics software output in de HDX-processing software (Table of Materials) voor extra drempels.
- Klik op Gegevens in de linkerhoek van het HDX-verwerkingssoftwarevenster. Klik op plgs-resultaten importeren en klik op het pictogram toevoegen. Kies de verwerkte gegevensbestanden uit stap 4.9 door naar de juiste map te navigeren.
- Klik op Volgende en geef de volgende parameters op: minimale opeenvolgende ionen ≥ 2, massafout = 5 ppm en bestandsdrempel = 3. Klik op voltooien.
- Zodra u tevreden bent met de drempelparameters, slaat u het HDX-project op. Alle HDX-gegevens worden in dit project geïmporteerd voor analyse en weergave.
OPMERKING: De in de volgende sectie beschreven deuterium uitgewisselde monsters moeten worden verwerkt met een identieke LC-MS-workflow. Voordat u doorgaat met HDX-test (rubriek 5), moet u er daarom voor zorgen dat het monstervoorbereiding (punt 2), de bottom-up LC-MS-workflow (sectie 3) en de gegevensverwerkingsworkflows (sectie 4) de gewenste reproduceerbaarheid en sequentiedekking van het doeleiwit bieden. Als een van deze processen moet worden gewijzigd om de dekking te verbeteren, wordt geadviseerd om terug te keren naar stap 2.1, nieuwe referentiemonsters in drievoud te bereiden en sectie 2−4 te herhalen (terwijl de nodige aanpassingen aan het protocol worden aangebracht) om ervoor te zorgen dat elk peptide reproduceerbaar kan worden gegenereerd en gedetecteerd.
5. HDX-reacties uitvoeren
- Bereid de werkruimte voor op HDX-reacties.
- Pre-aliquot blusbuffer in goed gelabelde buizen van 0,5 ml. Bereid een andere buis voor op elk tijdspunt, elke replica en elke biochemische toestand die moet worden geanalyseerd. Gebruik het juiste volume blusbuffer vanaf stap 2.2 dat nodig is om de uiteindelijke pH-meterwaarde van een 50 μL-gedeelte van de HDX-reactie aan te passen op een waarde van 2,3.
- Centrifugeer kort de 0,5 ml kuipen om alle blusbuffer naar de bodem van de buis over te brengen. Leg de buizen op ijs.
- Vul een kleine Dewar met vloeibare stikstof en blijf naast de werkruimte.
- Bereid de HDX-reacties voor. Zorg ervoor dat er voldoende reactievolume is om het gewenste aantal wisseltijdpunten te verzamelen (één 50 μL aliquot voor elk gewenst tijdspunt). Verzamel ten minste 4−5 tijdpunten over 3−4 ordes van grootte in tijdschaal (bijv. blustijden van 15 s, 60 s, 300 s [5 min], 1.800 s [30 min], en 14.400 s [4 h] bieden voldoende dekking van de uitwisselingsdynamiek voor de meeste enzymen).
- Meng alle gedeutereerde componenten (minus enzym) voor uit stap 1.1 in D2O.
- Bereid voor elke te onderzoeken biochemische toestand (vrij enzym, enzym + ligand, enzym + remmer, enz.) HDX-reacties in ten minste drievoud voor.
- Incubeer de reactiemengsels in een temperatuurgeregeld waterbad bij 25 °C gedurende 10 minuten voordat het enzym wordt toevoeging.
OPMERKING: Het enzym moet worden bereid als een geconcentreerde stamoplossing (~100−200 μM, stap 1.6) om de toevoeging van protium aan de HDX-test te minimaliseren. - Wanneer u het enzym toevoegt aan een eindconcentratie van 1−5 μM, start u de timer. Meng de oplossing voorzichtig en snel met behulp van een pipet van 200 μL om ervoor te zorgen dat het enzym gelijkmatig in het monster wordt verdeeld.
- Verwijder op de gewenste wisseltijdpunten 50 μL aliquots uit de HDX-reactie en meng snel en gelijkmatig met de vooraf geciteerde, ijskoude blusbuffer in een buis van 0,5 ml.
OPMERKING: De mengvolumes en de mengprocedure moeten zo nauwkeurig en reproduceerbaar mogelijk zijn om ervoor te zorgen dat de gewenste einddamp van 2,3 snel in alle monsters wordt bereikt. Het koud houden van de blusbuffer zal helpen om de teruguitwisseling bij denaturatie van het enzym te minimaliseren. - Onmiddellijk na het doven van het HDX-monster, dop de buis en flits bevries in vloeibare stikstof.
- Ga door met het verzamelen van tijdspunten totdat alle tests zijn voltooid en breng vervolgens monsters over naar de vriezer van -80 °C voor opslag.
OPMERKING: Dit kan een stopplaats zijn. Na het verzamelen van alle HDX-tijdpunten kunnen de monsters bij -80 °C worden bewaard totdat ze klaar zijn voor LC-MS-analyse. Idealiter moeten drievoud HDX-reacties worden uitgevoerd voor alle biochemische toestanden van belang op dezelfde dag. Ten minste moeten alle gerepliceerde HDX-reacties voor een bepaalde biochemische toestand op dezelfde dag parallel worden uitgevoerd.
- Na het verzamelen van alle gedoofde HDX-tijdpunten, onderwerpt u de monsters aan de geoptimaliseerde bottom-up LC-MS-workflow die is ontwikkeld zoals beschreven in stap 3.3. Injecteer HDX-monsters in een gerandomiseerde volgorde met een passend aantal spaties tussen de monsters om ervoor te zorgen dat elke overdracht van peptiden minimaal is.
OPMERKING: HDX-gegevens hoeven niet te worden verzameld in de MS E-modus. Daarom moet het energiesegment met hoge botsingen (stap 3.3.7.2) uit de ms-bedrijfscyclus worden verwijderd. Dit moet de enige wijziging zijn die is aangebracht in de werkstroom die in stap 3.3 wordt beschreven. - Beoordeel de kwaliteit van de HDX-gegevens terwijl deze worden verzameld.
- Zorg ervoor dat de chromatografische pieken in het totale ionenchromatogram van de niet-gedeutereerde referentiemonsters op hetzelfde retentietijdje in de gedeutereerde monsters voorkomen (zoals in figuur 3D−F).
- Zorg ervoor dat massaspectra, opgeteld over specifieke tijdsintervallen van referentie- en gedeutereerde monsters, bewijs tonen voor deuteratie (d.w.z. een verschuiving in de isotopenomhulsel van individuele peptiden naar hogere m/z-waarden in de gedeutereerde monsters [figuur 6]).
6. Verwerking van HDX-gegevens
- Importeer de HDX-gegevens in het HDX-project dat in stap 4.11 is gemaakt door te klikken op Gegevens | MS-bestanden in de bovenste gereedschapsbalk.
- Klik op Nieuwe toestand en Nieuwe blootstelling indien nodig om de biochemische toestanden (bijv. vrij enzym, enzym + ligand, enz.) en deuteriumblootstellingstijden te definiëren, die relevant zijn voor de analyse.
- Klik op New Raw om de te analyseren HDX-gegevensbestanden te selecteren. Wijs de juiste uitwisselingstijden en biochemische status toe aan elk onbewerkt gegevensbestand dat wordt geïmporteerd.
OPMERKING: De gegevens kunnen in batches of allemaal tegelijk worden geïmporteerd en verwerkt. Als u gegevens aan het project toevoegt, wordt geen analyse ongedaan gemaakt die eerder binnen dat project is uitgevoerd.
- Zodra de gegevensbestanden zijn toegevoegd, klikt u op voltooien om de gegevensverwerking te starten. Na een korte vertraging zal de software vragen of de gebruiker de gegevens wil opslaan voordat hij doorgaat. Klik op ja.
OPMERKING: De eerste verwerking kan enkele uren duren, afhankelijk van het aantal monsters dat wordt geanalyseerd, hoeveel peptiden zich in de uiteindelijke peptidelijst bevinden (stap 4.10), de grootte van het chromatografische venster en de frequentie van spectrale acquisitie. - Wijzig desgewenst de verwerkingsparameters in het menu Configuratie om de ionenzoekparameters te wijzigen. Zorg ervoor dat u dezelfde ionenzoekparameters gebruikt voor alle gegevens in een bepaald project.
7. Analyse en visualisatie van de HDX-gegevens
OPMERKING: Zodra de eerste verwerking van de onbewerkte gegevens is voltooid (stap 6.2), zal de HDX-verwerkingssoftware peptiden uit de peptidelijst (gegenereerd in stap 4.10) hebben gevonden in elk van de onbewerkte gegevensbestanden die zijn geanalyseerd. Zodra de isotoopverdeling voor een peptide in de lijst zich in een onbewerkt gegevensbestand bevindt, vertegenwoordigt de HDX-verwerkingssoftware elke isotoop met een "stick" (zoals in figuur 6C−E). De relatieve intensiteiten van de sticks voor een bepaald peptide worden vervolgens gebruikt om de deuteriumopname ten opzichte van de referentiespectra te berekenen. Hoewel de HDX-verwerkingssoftware bewonderenswaardig werk levert door "sticks" correct toe te wijzen aan de meeste peptiden, zal er nog steeds een aanzienlijke handmatige curatie van de deuteriumopnamewaarden nodig zijn.
- Analyse van de opnamewaarden van peptidedeuterium
- Selecteer het eerste peptide in de peptidelijst en open het gestapelde spectrale plot in het menu Weergaven. Scroll op en neer in het gestapelde spectra plotvenster om de massaspectra voor het geselecteerde peptide te zien als functie van deuteriumuitwisselingstijd(figuur 7D,E).
- Wijs stokken toe en wijs deze indien nodig toe met behulp van muisklikken om ervoor te zorgen dat de juiste isotoopverdeling zich in de gegevens bevindt en dat elke isotooppieken zijn toegewezen (toegewezen sticks zien er blauw uit). Door op een van de spectra in de gestapelde spectrale plot (figuur 7D,E) te klikken, kan de gebruiker stokken toewijzen/denassigneren in het actieve gegevensviewervenster (figuur 7C).
- Controleer de sticktoewijzingen voor elke laadstatus door de laadstatus boven aan het gestapelde spectrale plotvenster te plaatsen.
- Herhaal stap 7.1.1−7.1.3 voor elke biochemische toestand van belang. De biochemische toestand kan ook worden geschakeld aan de bovenkant van het gestapelde spectrale plotvenster. Voor de meest nauwkeurige deuteriumopnameverschilmetingen moet u ervoor zorgen dat sticks worden toegewezen voor dezelfde set ladingstoestanden voor elke biochemische toestand.
- Herhaal stap 7.1.1−7.1.4 voor elk peptide in de peptidelijst.
- Controleer de standaardafwijking van de opnamewaarden van peptidedeuterium met behulp van de dekkingskaart.
- Open de dekkingskaart in het menu Weergaven, waarin elk peptide in de peptidelijst wordt weergegeven die is toegewezen langs de aminozuursequentie van het eiwit van belang (Figuur 8C). Kleur de peptiden volgens relatieve standaarddeviatie (eenheden van Da).
- Zoek visueel op de kaart naar uitschieterpeptiden met een hoge relatieve standaardafwijking. Klik op de uitschieterpeptiden in de dekkingskaart om de gestapelde spectrale plots (figuur 8B) en het venster van de gegevensviewer (figuur 8A) te vullen met het doelpeptide.
- Met behulp van de gestapelde spectrale plot, zorgvuldig controleren of alle ladingstoestanden en alle tijd punten van de uitschieter peptide hebben op de juiste manier toegewezen stokken.
OPMERKING: Meestal hebben peptiden met grote standaardafwijkingen (>0,3 Da) isotopenpieken die niet op de juiste manier door de software zijn toegewezen (zoals aangegeven in figuur 8B). Door ontbrekende sticks toe te wijzen, kan de relatieve standaardafwijking van een peptide over het algemeen worden teruggebracht tot <0,3 Da. - Verberg het peptide uit de lijst als de relatieve standaardafwijking niet kan worden teruggebracht tot minder dan 0,3 Da.
- Exporteer HDX-verschilgegevens tussen twee biochemische toestanden voor het in kaart brengen op een structureel model van het eiwit van belang.
- Het verschil in interesse in de dekkingskaart weergeven. Klik met de rechtermuisknop op de dekkingskaart om de verschilgegevens naar een .csv-bestand te exporteren. Exporteer de statusgegevens (in .csv-indeling) door naar Gegevens | Statusgegevens exporteren in de hoofdgereedschapsbalk.
OPMERKING: De juiste opmaak van de gegevens van het verschil en de statusgegevensbestanden vindt u in de ondersteunende informatie. - Importeer de verschilgegevens, de staatsgegevens en het pdb-bestand van het eiwit van belang in Deuteros28. Kies het betrouwbaarheidsinterval van 99%, selecteer som inschakelenen verwerk de gegevens.
OPMERKING: MATLAB moet op de pc worden geïnstalleerd om Deuteros uit te voeren. Deuteros zal de repliceermetingen in de dataset gebruiken om de standaarddeviatie van de opnamegegevens voor elk peptide te berekenen. Deze standaardafwijking wordt gebruikt om het betrouwbaarheidsinterval voor significante uitwisseling te definiëren, dat op de percelen wordt weergegeven. - Selecteer onder PyMOL-opties | voor exportopname exporteren om een Pymol-script te genereren om regio's met een significant uitwisselingsverschil in kaart te brengen op de pdb-structuur van het eiwit van belang met behulp van PyMOL-software.
OPMERKING: Met behulp van de workflow die in dit protocol wordt beschreven, is het betrouwbaarheidsinterval van 99% voor een significant deuteriumopnameverschil voor een bepaald peptide op één tijdstip meestal 0,3−0,5 Da. Het betrouwbaarheidsinterval van 99% voor het verschil dat wordt opgeteld over alle wisseltijdpunten is meestal 0,7−1,0 Da.
- Het verschil in interesse in de dekkingskaart weergeven. Klik met de rechtermuisknop op de dekkingskaart om de verschilgegevens naar een .csv-bestand te exporteren. Exporteer de statusgegevens (in .csv-indeling) door naar Gegevens | Statusgegevens exporteren in de hoofdgereedschapsbalk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het is noodzakelijk om de kwaliteit van de proteolytische spijsvertering en de reproduceerbaarheid van de workflow voor elke set monsterinjecties te beoordelen. Dus, voorafgaand aan het uitvoeren van HDX-MS-assays, is het essentieel om effectieve voorwaarden vast te stellen voor de proteolyse van het eiwit van belang, voor de scheiding van peptiden met behulp van omgekeerde fase vloeistofchromatografie en gasfase ionenmobiliteit, en voor de detectie van peptiden met behulp van MS. Hiertoe moeten eerst de referentiemonsters voor het eiwit van belang (verzameld bij afwezigheid van deuterium) worden onderzocht (punt 3). De chromatografische gegevens in figuur 3A−C tonen de totale ionenchromatogrammen (TICs) voor drie referentiemonsters van het HalM2 lanthipeptide synthetase. De TIC is de tijdsafhankelijke verandering in de som van alle ionentellingen bij alle m/z-waarden die zijn opgenomen in de massaspectrale scan. In figuur 3D−Fworden de TICs tussen 3 en 8 min nader bekeken . De massaspectra in figuur 3G−I vertegenwoordigt een optelling van alle massaspectra over een klein tijdsinterval (van 5,0 tot 5,1 min) van elke TIC. Bijzondere aandacht dient te worden besteed aan de volgende kenmerken in figuur 3.
Ten eerste vertegenwoordigt de grote piek van bijna 9,3 min aan het einde van de gradiënt onvolledig verteerde (en dus grote en meer hydrofobe) fragmenten van HalM2 (Figuur 3A−C). De spijsvertering kan efficiënter worden gemaakt door de HalM2-concentratie te verlagen, maar dit vermindert de intensiteit van het peptidesignaal en de signaal:ruisverhouding. De spijsvertering kan ook efficiënter worden gemaakt door de contacttijd (vanaf 3 min, protocolstap 3.3.3) met de pepsinekolom te verlengen. Een langere contacttijd zal echter leiden tot meer terugruil. Uiteindelijk moeten deze parameters worden uitgebalanceerd voor het eiwit van belang om de gewenste sequentiedekking, signaalintensiteit en deuteriumretentie te bieden. Ten tweede moeten de vorm en intensiteit van de TIC-profielen vergelijkbaar zijn (zoals in figuur 3D−F). Dit suggereert dat de proteolytische vertering van HalM2 reproduceerbaar is en in alle drie de referentiemonsters van vergelijkbare efficiëntie is. De verwachting is dat een vergelijkbare vertering van een deuterium-uitgewisseld monster dezelfde set peptiden met vergelijkbare retentietijden zal produceren. Ten derde moet de massaspectra over een bepaald tijdsinterval ook vergelijkbaar zijn (figuur 3G−I). Een snelle visuele vergelijking van de samengevatte massaspectra over het tijdsinterval van 5,0−5,1 min van de chromatografische scheiding toont aan dat massaspectrale signalen in elk monster inderdaad zeer vergelijkbaar zijn, wat het vertrouwen geeft dat vergelijkbare peptiden in elk monster aanwezig zijn en op vergelijkbare tijdstippen uit de C18-kolom eluteren. Een soortgelijke snelle visuele inspectie moet worden uitgevoerd over andere tijdsintervallen in het chromatogram.
Na het visueel verifiëren van de gelijkenis in de LC-MS-gegevens van de referentiemonsters, wordt proteomics-software gebruikt om de MS-gegevens te doorzoeken op peptiden die zijn afgeleid van de aminozuursequentie van het betrokken eiwit. Na het definiëren van de eiwitsequentiedatabank (de aminozuursequentie van het eiwit van belang), de verwerking en de workflowparameters zoals beschreven in protocolstappen 4.2−4.4, wordt elk afzonderlijk referentiemonster verwerkt om peptische peptiden te detecteren die overeenkomen met voorspelde peptiden afgeleid van het eiwit van belang. Een voorbeeld van de proteomics-software-uitvoer voor een niet-gedeuterd HalM2-referentiemonster is weergegeven in figuur 4. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de volgende kenmerken. Ten eerste wordt elk MS-signaal dat is afgestemd op een specifiek peptide in het eiwit van belang volgens de waarden die zijn gedefinieerd in de verwerkings- en workflowparameters blauw gekleurd in het onderste spectrum. Als een referentiemonster "met succes" wordt verwerkt, verschijnen de meeste signalen blauw (zoals het geval is voor de gegevens in figuur 4). Controleer bovendien in het paneel linksboven of het "OK-filter" naar het groene vinkje is geschakeld. Wanneer dit is gebeurd, zullen de statistieken in de bovenste balk van het paneel rechtsboven (blauw gemarkeerd in figuur 4) alleen die peptiden weerspiegelen die hoge betrouwbaarheidsscores geven. Deze peptiden vertonen een lage ppm massanauwkeurigheid, meerdere fragmentionen en een goede correlatie tussen fragment en bovenliggende ionenretentietijden, en worden beschouwd als zelfverzekerde identificaties. Voor het getoonde HalM2-referentiemonster werden 1.421 peptiden gedetecteerd met hoge scores, die 99,6% van de HalM2-reeks beslaan. Bijna 100% sequentiedekking moet haalbaar zijn voor de meeste eiwitten met behulp van de bottom-up LC-MS-workflow die wordt beschreven in protocolsectie 3. Bovendien worden aanvullende nuttige statistieken voor elk peptide in de rechterbovenhoek weergegeven, inclusief de massafout, de retentietijd van de precursor, het aantal fragmenten (productionen), de volledige lijst van fragmentionen bij naam en de drifttijd van de ionenmobiliteit. Deze informatie is nuttig voor de interpretatie van resultaten, die altijd gericht moeten zijn op de meest zelfverzekerd geïdentificeerde peptiden.
De definitieve peptidelijst moet worden bepaald door extra drempelwaarden in de HDX-verwerkingssoftware. Na het analyseren van de referentiegegevens om de peptidelijst te genereren (protocolsectie 4), moet de uitvoer worden geïmporteerd in de HDX-verwerkingssoftware voor extra drempelwaarden. De uitvoerbestanden worden opgeslagen in een map zoals gedefinieerd in protocolstap 4.5 met de bestandsextensie "..._IA_final_peptide.csv.". Bij het uploaden van de uitvoer naar de HDX-verwerkingssoftware wordt de volledige lijst met peptiden weergegeven in het paneel "peptide preview"(figuur 5),en het aantal peptiden, sequentiedekking en redundantie worden rechtsonder in het venster weergegeven. Deze waarden veranderen in realtime wanneer extra drempelwaarden worden toegepast. Nadat u op volgendehebt geklikt, kunnen drempelwaarden worden ingesteld in de aangegeven velden. De meest kritische filters zijn de "bestandsdrempel" die vereist dat alle peptiden zich in elk van de drie referentiemonsters bevinden, de "maximale MH+ fout (ppm)" die moet worden ingesteld op een waarde <10 ppm, en "minimale opeenvolgende producten", waarbij het peptide ten minste twee opeenvolgende fragmentionen moet genereren tijdens de MSMS-fase (d.w.z. hoge botsingsenergie) van de MSE-workflow (protocolstap 3.3.7.2).
De belangrijkste technische beperking van de HDX-MS-test is de teruguitwisseling van deuterium voor protium die optreedt zodra deuterium-uitgewisselde monsters worden gedoofd (met geprotieerde buffer). De teruguitwisseling gaat door tijdens de proteasevertering en LC-MS-gedeelten van de workflow. Teruguitwisseling is onvermijdelijk, maar als de pH, temperatuur en timing van alle stappen na het doven zorgvuldig worden gecontroleerd zoals beschreven in het protocol, kan 60%−70% van het deuteriumlabel worden gehandhaafd. Om deze reden is het essentieel om tijdens de vroege stadia van de testontwikkeling te controleren of de meeste peptiden deuterium behouden. Dit kan snel worden bereikt door de ruwe gegevens van een gedeutereerd monster te vergelijken met die van een referentiemonster. Zoals is gedaan om de reproduceerbaarheid van de referentiemonsters te waarborgen (figuur 3), vergelijkt u de TICs van de deuteriumgeruilde en niet-gedeutereerde referentiemonsters, zodat de vormen van de profielen op elkaar lijken. Som bovendien de massaspectra op over hetzelfde chromatografische tijdsinterval in beide monsters. De meeste peptiden in het geruilde deuteriummonster moeten duidelijke verschuivingen vertonen in hun isotopenverdelingen naar hogere m/z-waarden (zoals in figuur 6). Deze gegevens geven aan dat een aanzienlijk deel van het deuteriumetiket wordt gehandhaafd gedurende de hele loop van de zuurdoven, pepsinevertering en LC-MS-gegevensverzameling.
Nadat is gecontroleerd of de werkstroom voldoende deuteriumretentie biedt, moet de deuteriumopname worden gekwantificeerd. Zo worden de ruwe gegevens voor deuterium-uitgewisselde monsters geïmporteerd in de HDX-verwerkingssoftware. Met behulp van de referentiemonsters en de voltooide peptidelijst zal de HDX-verwerkingssoftware de peptiden uit de peptidelijst in elk van de onbewerkte gegevensbestanden lokaliseren en "sticks" toewijzen aan elk van de isotopenpieken. In de representatieve gegevens voor HalM2 in figuur 7zijn de met succes toegewezen sticks blauw gekleurd in alle spectra. Na het toewijzen van sticks wordt de centroide m/z-waarde voor de isotopenverdeling bepaald door de software en gebruikt om de deuteriumopname ten opzichte van het niet-gedeutereerde referentiemonster te berekenen. De deuteriumuitwisselingswaarde voor elk peptide moet handmatig worden gecontroleerd. In figuur 7wordt het momenteel geselecteerde peptide (HIDKLTVGL, met HalM2-residuen 110−118) weergegeven in het linkerpaneel van de belangrijkste gegevensviewer (figuur 7A). De andere panelen tonen HDX-gegevens die aan dit peptide zijn gekoppeld. Als u op een peptide in de peptidelijst klikt, worden de andere panelen gevuld met HDX-gegevens van dat peptide. Figuur 7B toont de deuteriumopnamepercelen voor peptide 110−118. Deze gegevensset bevat vier uitwisselingstijdpunten: 0,5, 5, 30 en 240 minuten (verzameld in drievoud). Er werden uitwisselingsgegevens verzameld voor twee biochemische toestanden: het vrije HalM2-enzym (rood) en het HalM2-enzym gecomplexeerd tot AMPPNP en het substraatpeptide HalA2 (blauw). Let op het significante deuteriumopnameverschil in peptide 110−118 over de gehele tijdsloop en de hoge precisie van de repliceermetingen (foutbalken worden weergegeven op de plot in figuur 7B). Over het algemeen zal voor de meeste peptiden een vergelijkbare precisie in de opnamemeting worden verkregen, wat de reproduceerbaarheid van de in dit protocol gepresenteerde workflow onderstreept. Bij ligandbinding (blauwe curve in figuur 7B)ondergaan de peptidebindings-amiden in het 110−118-gebied van HalM2 blijkbaar een aanzienlijke bescherming tegen deuteriumuitwisseling, wat suggereert dat de aminozuren in de 110−118-regio stabieler gestructureerd worden bij ligandbinding. Daaropvolgende mutagenese van deze regio duidde op een rol in de binding aan het precursorpeptide, HalA220. Ook in figuur 7 zijn de gestapelde spectrale plots voor de halm2-toestand (figuur 7D) en de toestand HalM2:AMPPNP:HalA2 (figuur 7E) weergegeven . In deze plots neemt de ruiltijd toe van onder naar boven. De massatoename van peptide 110−118 bij deuteriumuitwisseling op langere tijdstippen blijkt uit visuele inspectie. Het is ook duidelijk dat peptide 110−118 meer deuterium inneemt in de HalM2-toestand (figuur 7D) dan in de volledig liganded toestand (Figuur 7E). Indien nodig kan de gebruiker door op een van de subplots in figuur 7D of figuur 7Ete klikken, de toewijzing van sticks in de hoofdgegevensviewer handmatig wijzigen (figuur 7C). Bij toewijzing/toewijzing van de stick zal de HDX-verwerkingssoftware de opnamewaarden van deuterium opnieuw berekenen en worden alle plots in realtime bijgewerkt. Evenzo vult het klikken op afzonderlijke gegevenspunten in paneel B de gegevensviewer in paneel C voor handmatige sticktoewijzing.
Nadat voor elk peptide en het uitwisselingstijdpunt voor alle biochemische toestanden stokken zijn toegewezen, moet de standaardafwijking van de gemeten opnamewaarden worden gecontroleerd. Dit is het gemakkelijkst uit te voeren met de dekkingskaart en het gestapelde spectrale plot (figuur 8). Selecteer in de dekkingskaart (figuur 8C) de status en de wisselkoers van de rente en selecteer vervolgens de relatieve opnamestandaardafwijking. De peptiden in de dekkingskaart worden gekleurd volgens de standaardafwijking in de gemeten deuteriumopnamewaarde. Op deze manier zal het heel gemakkelijk zijn om peptiden met isotoopstickfouten visueel te identificeren. Als u op het uitschieterpeptide (met hoge standaardafwijking) in de dekkingskaart klikt, worden de belangrijkste gegevensviewer en de gestapelde spectraplot gevuld met HDX-gegevens van het uitschieterpeptide. De sticktoewijzingen voor elk tijdspunt en laadstatus kunnen vervolgens zo nodig worden gewijzigd om de gemeten opnamewaarde te corrigeren. Nogmaals, de HDX-verwerkingssoftware werkt alle gegevensdisplays in realtime bij terwijl de sticktoewijzingen worden gewijzigd.
Na volledige curatie van de HDX-dataset moet de significantie van de deuteriumopnameverschilmeting voor elk peptide worden overwogen voorafgaand aan de interpretatie van de gegevens. Met behulp van een door Engen en collega's29beschreven benadering hebben we een gemiddelde opnamewaarde van 0,1 ± 0,1 Da voor het HalM2-eiwit geschat met behulp van de workflow die wordt beschreven in het bovenstaande protocol20. Deze waarde komt overeen met de fouten die door anderen zijn gemeld voor vergelijkbare bottom-up, continue exchange HDX-workflows29,30. Onlangs ontwikkelden Politis en collega's Deuteros, een handige open source tool (geïmplementeerd in MATLAB) voor het snel bepalen van significante opnameverschillen in HDX-datasets28. Representatieve invoerbestanden voor Deuteros ("State_Data_for_Deuteros" en "Difference_Data_for_Deuteros") zijn opgenomen in de ondersteunende informatie. Indien rechtstreeks geëxporteerd vanuit de HDX-processing software beschreven in dit protocol(Tabel van materialen),het verschil en de staat gegevensbestanden zal het juiste formaat voor het lezen van bestanden door Deuteros. Als HDX-gegevens worden gegenereerd op een ander LC-MS-systeem, moeten gegevensbestanden die lijken op de bestanden in de ondersteunende informatie handmatig worden geconstrueerd.
De werkruimte Dueteros wordt weergegeven in figuur 9. Zodra de gegevens in Deuteros zijn geïmporteerd, selecteert de gebruiker de gewenste betrouwbaarheidslimiet (>98% aanbevolen) en klikt op Importeren en berekenen. Selecteer dekking voor gegevenstype en absoluut voor kleurschaal voor de afgevlakte gegevenstoewijzing. Klik op plot. Selecteer voor de houtplots binair filter als gegevenstype, het gewenste vertrouwensfilter en schakel de som in. Bij het klikken op plot,Zal Deuteros alle peptiden plotten op elk uitwisselingstijdpunt als functie van hun positie in de aminozuursequentie en hun deuteriumopnamewaarden. Peptiden die significante uitwisseling vertonen, worden rood of blauw gekleurd, afhankelijk van of het peptide respectievelijk meer of minder deuterium inneemt, afhankelijk van het verschil dat wordt berekend. De significantiewaarde die in elk perceel wordt gerapporteerd (variërend van 0,39 tot 0,72 Da in de in figuur 9geplote gegevens ) wordt berekend op basis van de standaardafwijkingen van de opnameverschillen die voor elk peptide worden gemeten, zoals bepaald aan de hand van de repliceermetingen in de gegevensverzameling. De betrouwbaarheidsintervallen worden weergegeven als onderbroken balken over elk afzonderlijk plot. Indien ingeschakeld, voegt de "Som" eenvoudig het opnameverschil toe dat op elk tijdspunt voor elk peptide wordt gemeten. Ten slotte, voor visualisatie van de opnamegegevens over de driedimensionale structuur van het eiwit van belang, selecteert u exportopname onder PyMOL-opties en exporteertu vervolgens . Deuteros genereert een PyMOL-script dat kan worden gesleept en gedropt in de PyMOL-werkruimte met het open pdb-bestand van het eiwit van belang.
De HDX-MS workflow gepresenteerd in dit protocol werd gebruikt om de biochemische eigenschappen van een enzym (HalM2) te karakteriseren dat een reeks post-translationele modificaties katalyseert op een genetisch gecodeerd peptide (HalA2)20. In figuur 10worden representatieve HDX-MS resultaten getoond voor de binding van het HalA2 precursor peptide aan het HalM2:AMP-PNP complex. Paneel A toont de HalM2-dekkingskaart, waarbij de kleur het relatieve opnameverschil aangeeft tussen de biochemische toestand [HalM2:AMPPNP] en de status [HalM2:AMPPNP:HalA2]. Deuteros werd gebruikt om deze opnameverschillen in kaart te brengen op een homologiemodel van het HalM2-enzym (figuur 10B,C). Peptiden die rood gekleurd zijn, duiden op een afname van de deuteriumopname bij HalA2-binding, wat suggereert dat deze gebieden van HalM2 rechtstreeks betrokken kunnen zijn bij de binding van het precursorpeptide. Om deze hypothese te onderzoeken, werden regio's I-III gemuteerd en werden de kinetische eigenschappen van de variantenzymen onderzocht. Mutaties in regio I en III leidden beide tot significante verstoringen in de HalA2 peptide binding affiniteit, wat suggereert dat deze regio's van HalM2 ofwel direct interageren met het peptidesubstraat, ofwel nodig zijn om structuren te vormen die HalA2 binding mogelijk maken. Daarentegen had mutatie van gebied II geen effect op halA2 bindingsaffiniteit, maar deze mutant was bijna verstoken van katalytische activiteit. Een verklaring voor deze bevinding is dat de organisatie van regio II waargenomen op HalA2 binding leidt tot een conformationele verandering die het enzym activeert. Er zij op gewezen dat vóór deze studie geen informatie beschikbaar was over de halm2-hala2-bindingsmodus of over de katalytisch relevante conformatieveranderingen in het systeem, voornamelijk omdat de grote omvang en het flexibele karakter van zowel HalM2 als HalA2 structurele studies hebben uitgesloten. Deze representatieve gegevens over de HalM2 lanthipeptide synthetase illustreren dus hoe HDX-MS kan worden gebruikt om snel functioneel relevante gebieden van structureel dynamische enzymsystemen te lokaliseren, zelfs bij afwezigheid van structurele gegevens met hoge resolutie.
Figuur 1: Een continue uitwisseling, bottom-up HDX-MS workflow. Zie tekst voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: De HDX-koers is afhankelijk van de eiwitconformatiedynamiek (kopen en kclose) en de pH-afhankelijke koers van de chemische uitwisseling van de N-H-bindingen in de eiwitbackbone voor N-D-bindingen (kchem). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Representatieve LC-MS-gegevens voor de referentiemonsters van het drievoud HalM2. Het getal in de rechterbovenhoek van elk paneel vertegenwoordigt het totale aantal ionen. Elke rij bevat gegevens voor een ander referentievoorbeeld. De eerste kolom (A−C) toont de totale ionenchromatogrammen (TICs). De grote piek op 9,3 min vertegenwoordigt grote, onverteerd peptiden. De middelste kolom (D−F) toont een beter zicht op de TICs tussen 3 en 8 min. Let op de goede overeenstemming van de vormen van de profielen, wat wijst op een vergelijkbaar onderliggend mengsel van peptidesignalen in elk referentiemonster over het hele chromatogram. De derde kolom (G−I) toont massaspectra voor elk referentiemonster dat wordt gegenereerd door alle massaspectra op te sommen die zijn geregistreerd tussen tijdpunt 5.0 en 5.1 min van de chromatografische run. Visuele inspectie van deze gegevens geeft aan dat veel van dezelfde peptiden worden gedetecteerd in elk monster. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Representatieve proteomics software output voor een HalM2 referentie monster. Het paneel linksboven toont de volledige lijst van halm2-afgeleide peptische peptiden gedetecteerd in de MS-gegevens. Merk op dat het "OK-filter" het groene vinkje weergeeft. Dit filtert de gegevens op basis van de betrouwbaarheidsscore en verwijdert peptide-identificaties van lage betrouwbaarheid. De bovenste balk van het rechterpaneel (blauw gemarkeerd) toont cumulatieve statistieken voor de set peptiden met hoge scores. De belangrijkste statistieken zijn het aantal gedetecteerde peptiden (in dit geval 1.421) en de sequentiedekking (in dit geval 99,6%). Aanvullende statistieken voor elk peptide worden ook weergegeven in de rechterbovenhoek paneel. Elke kolom in deze gegevenstabel kan worden gesorteerd. Het onderste paneel toont alle MS-signalen die overeenkwamen met een voorspeld HalM2-afgeleid peptisch peptide. Merk op dat de meeste MS-signalen zijn toegewezen en blauw gekleurd zijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Extra drempels in de HDX-verwerkingssoftware. De proteomics-software-uitvoer voor elk van de drie HalM2-referentiemonsters wordt geïmporteerd in de HDX-verwerkingssoftware (linkerpaneel). Na het importeren van gegevens wordt extra drempelwaarden uitgevoerd (rechterpaneel). Het veld "minimale opeenvolgende producten" verwijst naar fragmentionen gegenereerd door decolleté van aangrenzende peptidebindingen in het peptide. De parameter "minimale MH+ fout" stelt de gebruiker in staat om de aanvaardbare massanauwkeurigheid te definiëren, en de "bestandsdrempel" stelt de gebruiker in staat om peptiden te beperken tot alleen die peptiden die in alle drie de referentiebestanden zijn gedetecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Representatieve gegevens voor een HalM2-referentiemonster (rood) en een HalM2-monster geïncubeerd in D2O-buffer gedurende 5 minuten (groen). Beide voorbeelden werden onderworpen aan de bottom-up LC-MS workflow beschreven in protocol sectie 3. De linkerkolom toont massaspectra opgeteld over het tijdvenster van 6,0−6,1 min. De drie rechterkolommen tonen dichtere weergaven van dezelfde massaspectra, waarbij de verschuiving naar hogere m/z-waarden in het gedeutereerde monster (groen, boven) duidelijk is voor de meeste peptidesignalen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Schermafbeelding van werkruimte in de HDX-verwerkingssoftware. (A) De lijst van van HalM2 afgeleide peptiden verkregen uit de analyse van HalM2-referentiemonsters met de proteomics-software (figuur 3) en de daaropvolgende drempelwaarden in de HDX-verwerkingssoftware (figuur 4). Het momenteel geselecteerde peptide (HIDKLTVGL, dat HalM2-residuen 110−118 overspant) is blauw gemarkeerd. (B) De deuteriumopnamecurven (als functie van de uitwisselingstijd) voor de twee biochemische toestanden van belang: het vrije HalM2-enzym en het HalM2-enzym gebonden aan AMPPNP en het precursorlanthipeptide, HalA2. (C) Massaspectrum van het actief geselecteerde monster (in dit geval een van de niet-gedeuterde HalM2-referentiemonsters). De blauwe sticks in paneel C kunnen indien nodig handmatig worden toegewezen/niet toegewezen als ze tijdens de eerste gegevensverwerking niet correct zijn toegewezen door de HDX-verwerkingssoftware. (D,E) Gestapelde spectrale plots voor de HalM2-status (D) en de halM2:AMPPNP:HalA2-status (E). De tijdsafhankelijke toename van de deuteriumopname is goed zichtbaar, net als het opnameverschil tussen de twee biochemische toestanden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: Minimaliseren van standaarddeviatie in gemeten opnamewaarden. De dekkingskaart in de HDX-verwerkingssoftware (paneel C) biedt een handig middel om snel peptiden met grote standaardafwijkingen in hun gemeten deuteriumopnamewaarden te identificeren. In dit hypothetische geval zijn sommige van de isotooppieken (blauwe stokken) voor het van HalM2 afgeleide peptide dat residuen 110−118 overspant, niet toegewezen voor de 5 minuten wisseltijdpunten (de grijze stokken in paneel B). Dit leidt tot een grote standaardafwijking in de opnamewaarde van het deuterium, gemeten voor het uitwisselingstijdpunt van 5 minuten. De grote standaardafwijking is duidelijk te zien aan de blauwe kleur van het peptide 110−118 in de dekkingskaart (paneel C) en aan de spreiding van het gegevenspunt en de grote foutbalk in het opnameplot (paneel A). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9: De Deuteros werkplek. In dit voorbeeld werden de opnameverschilwaarden berekend in de HDX-verwerkingssoftware door de deuteriumopname van de status HalM2:AMPPNP:HalA2 af te trekken van die van de status HalM2:AMPPNP. Het doel van de vergelijking was om te visualiseren hoe peptide (HalA2) binding de structurele dynamiek van het HalM2:AMPPNP complex veranderde. De dataset bevatte 4 uitwisselingstijdpunten (0,5, 5, 30 en 240 min). Het opnameverschil voor elk peptide op elk uitwisselingstijdpunt wordt geïllustreerd in de Woods-plots. De gekleurde peptiden in de Woods-plots duiden op peptiden die een significant opnameverschil vertonen, zoals gedefinieerd door de standaardafwijking van de repliceermetingen die aanwezig zijn in de dataset en de door de gebruiker gedefinieerde betrouwbaarheidslimieten die in Deuteros zijn geselecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10: HDX-MS data guides functionele analyse van peptide binding en allosterische activering in de lanthipeptide synthetase HalM2. De deuteriumopname verandering bij binding van de HalA2 precursor peptide aan de HalM2 lanthipeptide synthetase werd onderzocht. Het opnameverschil voor elk peptide na een uitwisselingsreactie van 5 minuten wordt uitgezet (A). Dit plot is gegenereerd in de HDX-verwerkingssoftware. Peptiden gekleurd rood en blauw ondergaan minder en meer deuterium opname, respectievelijk, in aanwezigheid van de HalA2 peptide. Deze HDX "hot spots" zijn in kaart gebracht op een HalM2 homologie model (B,C). De identificatie van peptiden die significante uitwisselingsverschillen ondergingen, werd bepaald in Deuteros. Het PyMOL-script dat werd gebruikt om de verschilwaarden op het homologiemodel in kaart te brengen, werd gegenereerd in Deuteros. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De IN dit protocol gepresenteerde HDX-MS workflow biedt een opmerkelijk robuust platform voor het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van structureel dynamische elementen in eiwitten en voor het onderzoeken hoe deze dynamiek verandert als reactie op verstoring (ligandbinding, enzym mutagenese, etc.). HDX-MS heeft verschillende duidelijke voordelen ten opzichte van andere structurele biologiebenaderingen die vaak worden gebruikt om conformatiedynamiek te onderzoeken. Het meest in het bijzonder zijn slechts kleine hoeveelheden eiwitten nodig. Met behulp van de hierin beschreven workflow biedt een 1 ml monster van 1 μM eiwit voldoende materiaal voor drievoud HDX-reacties die elk 5 uitwisselingstijdpunten bevatten. Bovendien is er vrijwel geen groottelimiet voor het eiwit van belang, en eiwitcomplexen zijn even ontvankelijk voor de HDX-MS-benadering. De groottelimiet wordt alleen beperkt door de mate waarin de peptische peptiden chromatografisch kunnen worden opgelost, en in de afmetingen m/z en ionenmobiliteit. Zo zal HDX-MS voor veel eiwitten/eiwitcomplexen waardevolle informatie verschaffen over eiwit-eiwitinteractie-interfaces, ligandbindingsplaatsen, conformatiedynamiek en allosterische netwerken. Ten slotte wordt de HDX-reactie uitgevoerd onder zachte, bijna-inheemse omstandigheden zonder de noodzaak van site-specifieke etikettering / engineering van het eiwit, wat moet helpen om ervoor te zorgen dat de endogene activiteit behouden blijft. De belangrijkste beperking van de benadering (in termen van de mechanistische informatie die het biedt over het eiwit van belang) is dat de HDX-gegevens op peptideniveau van inherent lage ruimtelijke resolutie zijn. De gegevens zijn dus voldoende om af te leiden dat er een verandering in de secundaire structuur optreedt, maar de mechanistische effecten van de structurele verstoring vereisen een hogere resolutie (bijv. NMR-, cryoEM- of röntgenkristal) structuren, berekeningsstudies en / of biochemische studies om volledig te interpreteren.
Om de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen, moet rekening worden gehouden met verschillende kritieke aspecten van het protocol. Ten eerste zijn de mate van deuteriumuitwisseling tijdens de HDX-reactie en de mate van ruguitwisseling tijdens de work-up en analyse sterk afhankelijk van pH, tijd en temperatuur. De procedures voor de voorbereiding van buffers, HDX-reacties en LC-MS-methoden moeten dus zo systematisch mogelijk zijn om variatie in deze fysieke parameters in datasets te minimaliseren. Waar mogelijk moeten HDX-reacties voor biochemische toestanden die moeten worden vergeleken, op dezelfde dag door dezelfde onderzoeker worden uitgevoerd en moeten de LC-MS-gegevens voor deze monsters gedurende opeenvolgende dagen met dezelfde partij oplosmiddel worden verzameld. Na verloop van tijd zal de efficiëntie van de pepsinevertering ook afnemen, dus het is optimaal voor monsters die worden vergeleken om binnen een relatief smal tijdvenster te worden verteerd en geanalyseerd , vooral als de pepsinekolom wordt gebruikt om veel andere soorten monsters te verteren. Het is een goede gewoonte om periodiek de spijsverteringsefficiëntie van de pepsinekolom te controleren met behulp van een standaardeiwit. Om dit te bereiken, kan een speciaal HDX-verwerkingssoftwareproject worden opgezet waar nieuw verteerd monsters kunnen worden vergeleken met oudere monsters om ervoor te zorgen dat dezelfde set doelpeptiden met vergelijkbare intensiteiten wordt gedetecteerd.
Hoewel de workflow in dit protocol voldoende gegevens moet opleveren voor veel enzym-/eiwitsystemen, zijn er verschillende mogelijke optimalisatiepunten. Ten eerste kan de tijdschaal van de HDX-reactie worden gewijzigd om dynamiek vast te leggen die sneller / langzamer is. Het meest in het bijzonder zullen veel enzymen zeer dynamische elementen bevatten die binnen enkele seconden volledig worden uitgewisseld. Als deze uiterst dynamische elementen van belang zijn, zijn methoden voor pre-steady state, continue uitwisseling HDX-MS gerapporteerd in de literatuur31. Ten tweede kunnen de lc-methodeomstandigheden gemakkelijk worden gewijzigd om de spijsverteringsefficiëntie (die uiteindelijk de sequentiedekking bepaalt) en de deuteriumretentie (die uiteindelijk de gevoeligheid van de methode bepaalt) te wijzigen. Gezien de duur en temperatuur van de pepsinevertering, zullen langzamere debieten en hogere temperatuur een grondigere vertering van het eiwit bevorderen. De eiwitconcentratie in de HDX-test kan ook worden verhoogd als de signaalintensiteit te laag is, of verlaagd als de pepsinevertering te inefficiënt is. Gezien de acetonitrilgradiënt die wordt gebruikt om de peptische peptiden op de analytische C18-kolom te scheiden, behoudt een snellere gradiënt het deuteriumetiket, maar ten koste van de chromatografische resolutie van de peptische peptiden die aanwezig zijn in het verteerde reactiemengsel. Voor kleinere eiwitten (~ 200 aminozuren) waar minder peptische peptiden in de digest aanwezig zijn, kan een snellere LC-gradiënt gemakkelijker te implementeren zijn. Voor grotere eiwitten zoals HalM2 (~ 1.000 aminozuren) is een langere gradiënt nodig om de extra spectrale complexiteit op te lossen die wordt gegenereerd door het grotere aantal peptiden in het mengsel. In dit laatste scenario kan de opname van een ionenmobiliteitsscheiding in de gasfase helpen om de piekcapaciteit van de analyse drastisch te verbeteren. De opname van de ionenmobiliteitsscheiding gaat gepaard met een iets lagere signaal-ruisverhouding. Ten slotte moet worden opgemerkt dat de MS-gegevens voor de HDX-monsters niet in de MSE-modus hoeven te worden verzameld. Het MSMS-gedeelte van de MSE-duty cycle (d.w.z. het energiesegment met hoge botsing, stap 3.3.7.2) is alleen vereist voor de referentiemonsters om de peptidelijst te definiëren (protocolsectie 4). HDX-monsters moeten dus worden geanalyseerd in de ms-only-modus om de signaal:ruisverhouding te verhogen.
Als de workflow die in dit protocol wordt beschreven goed werkt, moeten volledig uitgewisselde peptiden een relatieve deuteriumopnamewaarde van 60%−70% vertonen. Als blijkt dat de deuteriumopname aanzienlijk lager is dan deze (voor een oplosmiddelgebloeeerd, onbeschermd peptide), is de meest waarschijnlijke verklaring dat de pH van het monster verandert tijdens een deel van de workup/analyse. In dit scenario moet een microtipelektrode worden gebruikt om de pH van de HDX-test en van de gedoofde reactie aliquot zorgvuldig te controleren. De pH van de LC-MS-oplosmiddelen moet ook worden gecontroleerd. Om het optreden van dit probleem tot een minimum te beperken, wordt het ten zeerste aanbevolen om geconcentreerde voorraadoplossingen voor te bereiden en op te slaan van alle buffers en reagentia die nodig zijn voor de test (zoals beschreven in protocolsectie 1).
In de afgelopen jaren is HDX-MS naar voren gekomen als een krachtig analytisch hulpmiddel om de structurele dynamiek van eiwitten te onderzoeken. De ontwikkeling van commercieel beschikbare LC-MS-systemen die zijn ontworpen en geoptimaliseerd voor HDX-experimenten (zoals het systeem dat in deze studie wordt gebruikt en in de materialen wordt vermeld) in combinatie met krachtige softwarepakketten, heeft de HDX-MS-aanpak uitgebreid tot veel academische en industriële laboratoria en heeft wat ooit een nichetechniek was 15 jaar geleden omgevormd tot een gebruiksvriendelijker analytisch platform. Ondanks de beperkingen in ruimtelijke resolutie biedt HDX-MS zeer kwantitatieve en reproduceerbare metingen op eiwitbewegingen en is het bij uitstek geschikt voor het bestuderen van conformationeel dynamische enzymen die moeilijk te onderzoeken zijn met andere benaderingen. Vanwege deze kenmerken vult HDX-MS een essentiële niche in de structurele biologie van verstoorde en dynamische eiwitsystemen die relevant zijn op veel fundamentele gebieden van biologie en geneeskunde. Als zodanig wordt verwacht dat HDX-MS-analyses in de nabije toekomst een belangrijk instrument zullen blijven in het arsenaal van de structurele bioloog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, het Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, de Canadian Foundation for Innovation en mcgill university start-up fondsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| [glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
| 0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
| acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
| ATP | SIGMA | a2383-5G | |
| D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
| formic acid | Thermo Fisher | 28905 | |
| guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Magnesium chloride | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
| Potassium chloride | BioBasic | PB0440 | |
| potassium phosphate | BioBasic | PB0445 | |
| TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptide was synthesized upon request |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| software | |||
| Deuteros | Andy M C Lau, et al | version 1.08 | |
| DynamX | Waters | version 3.0 | |
| MassLynx | Waters | version 4.1 | |
| Protein Lynx Global Server (PLGS) |
Waters | version 3.0.3 | |
| PyMOL | Schrödinger | version 2.2.2 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Instrument and equipment | |||
| ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column | Waters | 186002346 | |
| ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column | Waters | 186003978 | |
| ACQUITY UPLC M-Class HDX System | Waters | ||
| HDX Manager | Waters | ||
| microtip pH electrode | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
| Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn | Waters | 186007233 | |
| Waters Synapt G2-Si | Waters |
References
- Karplus, M., McCammon, J. A.
- Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
- Tokuriki, N., Tawfik, D. S.
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224 (2011).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214 (1991).
- Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522 (1993).
- Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
- Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
- Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
- Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
- Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883 (2015).
- Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
- Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
- Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
- Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
- Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
- Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
- Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
- Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
- Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
- Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
- Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).
- Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).
- Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
- Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
- Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).
- Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
- Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).
