Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

Published: May 4, 2020 doi: 10.3791/61053
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, McGill University

Summary

סינתזות Lanthipeptide לזרז תגובות מרובות צעדים במהלך הביוסינתזה של מוצרים טבעיים פפטיד. כאן, אנו מתארים רציף, מלמטה למעלה, מימן-deuterium חילופי ספקטרומטריית מסה (HDX-MS) זרימת עבודה שניתן להפעיל כדי ללמוד את הדינמיקה הקונפורמטיבית של סינתטאז lanthipeptide, כמו גם אנזימים דומים אחרים המעורבים ביוסינתזה של מוצר טבעי פפטיד.

Abstract

ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) היא שיטה רבת עוצמה לאפיון ביופיזי של שינויים קונפורמיים של אנזימים ואינטראקציות בין מצע אנזימים. בין היתרונות הרבים שלה, HDX-MS צורכת רק כמויות קטנות של חומר, יכול להתבצע בתנאים מקומיים קרובים ללא צורך תיוג אנזים / מצע, והוא יכול לספק מידע נפתרה spatially על דינמיקה קונפורמציה אנזים-אפילו עבור אנזימים גדולים קומפלקסים multiprotein. השיטה היא ביוזמת דילול של האנזים של עניין לתוך חוצץ מוכן D2O. זה מפעיל את חילופי פרוטיום ב אמיד אג"ח פפטיד (N-H) עם דיטריום (N-D). בנקודות זמן ההחלפה הרצויות, אליקוטים תגובה מרווה, האנזים הוא proteolyzed לתוך פפטידים, פפטידים מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה (UPLC), ואת השינוי במסה של כל פפטיד (עקב חילופי מימן עבור דיטריום) נרשם על ידי טרשת נפוצה. כמות ספיגת הדיאוטריום על ידי כל פפטיד תלויה מאוד בסביבת מליטה מימן המקומית של פפטיד זה. פפטידים נוכחים באזורים דינמיים מאוד של דיטריום חילופי אנזימים במהירות רבה, ואילו פפטידים שמקורם באזורים מסודרים היטב עוברים חילופים הרבה יותר לאט. באופן זה, שיעור HDX מדווח על דינמיקה קונפורמציה אנזים מקומי. לאחר מכן ניתן להשתמש בהפרעות לרמות ספיגת הדיטריום בנוכחות ליגנדים שונים כדי למפות אתרי קשירה ליגנד, לזהות רשתות allosteric, ולהבין את התפקיד של דינמיקה קונפורמית בתפקוד האנזים. כאן, אנו ממחישים כיצד השתמשנו ב- HDX-MS כדי להבין טוב יותר את הביוסינתזה של סוג של מוצרים טבעיים פפטיד הנקרא lanthipeptides. Lanthipeptides הם פפטידים מקודדים גנטית כי הם לאחר תרגום שונה על ידי אנזימים גדולים, רב תכליתיים, דינמי קונפורמי שקשה ללמוד עם גישות ביולוגיה מבנית מסורתית. HDX-MS מספק פלטפורמה אידיאלית ומותאמת לבדיקת התכונות המכניסטיות של אנזימים מסוג זה.

Introduction

חלבונים הם מולקולות דינמיות מבחינה מבנית המדגמות קונפורמציות שונות על סולמות זמן החל רטט קשר בקנה מידה femtosecond כדי סידור מחדש של תחומי חלבון שלמים אשר יכול להתרחש על פני שניות רבות1. תנודות קונפורמיות אלה הן לעתים קרובות היבטים קריטיים של תפקוד האנזים/חלבון. לדוגמה, שינויים קונפורמיים הנגרמים על ידי קשירה ליגנד הם לעתים קרובות חשובים ביותר עבור מידול תפקוד האנזים, או על ידי ארגון שאריות אתר פעיל הדרושות לקטליזה, הגדרת אתרי איגוד מצע במנגנונים קינטיים רציפים, הגנה על ביניים תגובתיים מהסביבה, או על ידי היפוך פונקציית האנזים באמצעות רשתות allosteric. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו גם כי ניתן לשמר דינמיקה קונפורמטיבית לאורך האבולוציה וכי הפרעה לתנועות מולקולריות שמורות יכולה להיות מתואמת עם שינויים בספציפיות המצע והופעתם של פונקציות אנזים חדשות2,3.

בשנים האחרונות, ספקטרומטריית מסה חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) התפתחה במהירות כטכניקה רבת עוצמה כדי לחקור כיצד נופים קונפורמיים של חלבונים מגיבים להפרעות כגון קשירה ליגנד או mutagenesis4,5,6,7. בניסוי HDX-MS טיפוסי (איור 1), חלבון בעל עניין מוכנן למאגר שהוכן ב- D2O, אשר מפעיל החלפת פרוטונים הניתנים להחלפה בממס עם דוטריה. שער החליפין של ה- amide moiety של איגרות החוב פפטיד תלוי מאוד ב- pH, ברצף חומצות האמינו המקומיות ובסביבה המבנית המקומית של אמיד8. בין אלה העוסקים אינטראקציות מליטה מימן (כגון אלה הנוכחים α-helices ו β-sheets) להחליף לאט יותר מאשר בין באזורים לא מובנים של החלבון החשופים ממס בתפזורת. לכן, היקף ספיגת דיטריום הוא השתקפות של המבנה של האנזים. אנזימים דינמיים קונפורמיים, או העוברים מעברים מבניים על קשירה ליגנד, צפויים להניב תגובת HDX מדידה.

הבסיס המכניסטי לשער החליפין האיטי של אמיד מובנה מוצג באיור 25,8,9. על מנת לעבור HDX, האזור המובנה חייב תחילה לטעום באופן ארעי קונפורמציה נפרשת, כך מולקולות ממס לזרז חילופי HDX באמצעות חומצה ספציפית / מנגנון כימי בסיס, יש גישה אמיד להחלפה. בסופו של דבר, סדרי הגודל היחסיים של שער החליפין הכימי (kchem) ושיעורי הקיפול והקיפול מחדש (kopen ו- kclose) קובעים את שער ה- HDX הנמדד בניסוי5,8. ממודל קינטי פשוט זה, ברור כי היקף ספיגת הדיטריום ישקף את הדינמיקה הקונפורמציונית הבסיסית (כהגדרתה על ידי kopen ו- kclose). רוב הניסויים HDX-MS מבוצעים בזרימת עבודה מלמטה למעלה שבו, בעקבות תגובת ההחלפה, החלבון של עניין מתעכל לתוך פפטידים ואת ספיגת דיטריום על ידי כל פפטיד נמדד כמו עלייה במסה7. בדרך זו, HDX-MS מאפשר הפרעה דינמיקה קונפורמציה אנזים להיות ממופה בסולם המרחבי המקומי של פפטידים, המאפשר לחוקר להעריך כיצד הפרעה משנה את הדינמיקה באזורים שונים של האנזים של עניין.

היתרונות של גישת HDX-MS להבהרת הדינמיקה המבנית של החלבון הם רבים. ראשית, השיטה יכולה להתבצע עם כמויות קטנות של חלבון מקומי או על קומפלקסים חלבון במערכות עם מבנה quaternary10. זה אפילו לא הכרחי עבור הכנת האנזים המשמש ב assay להיות מטוהרים מאוד11,12, כל עוד זרימת העבודה HDX-MS מלמטה למעלה מספק מספר מספיק של פפטידים מזוהים בביטחון המכסים את רצף החלבון של עניין. יתר על כן, HDX-MS יכול לספק מידע על דינמיקה קונפורמטיבית בתנאים כמעט מקומיים ללא צורך בתיוג חלבון ספציפי לאתר כפי שהיה משמש במחקרי פלואורסצנטיות מולקולה אחת13, ואין מגבלת גודל למתחם החלבון או החלבון שניתן לחקור (מה שהופך גישות כגון תהודה מגנטית גרעינית [NMR] ספקטרוסקופיה מאתגרת)7,14. לבסוף, ניתן להציע שיטות HDX-MS שנפתרו בזמן כדי ללמוד חלבונים עם הפרעות מהותיות, שקשה ללמוד עם קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן15,16,17,18. המגבלה העיקרית של HDX-MS היא שהנתונים הם ברזולוציה מבנית נמוכה. נתוני HDX-MS שימושיים לצביעה על המקום שבו הדינמיקה הקונפורמית משתנה ולחשוף שינויים קונפורמיים מצמדים, אך לעתים קרובות הם אינם מספקים תובנה רבה לגבי המנגנון המולקולרי המדויק המניע את השינוי שנצפה. ההתקדמות האחרונה בשילוב של שיטות דיסוציאציה לכידת אלקטרונים עם נתוני HDX-MS חלבון הראו הבטחה למיפוי אתרי חילופי שאריות חומצת אמינו יחיד19, אבל מעקב אחר מחקרים ביוכימיים ומבניים עדיין נדרשים לעתים קרובות כדי לספק בהירות מודלים מבניים שהועברו על ידי נתוני HDX-MS.

להלן, פרוטוקול מפורט לפיתוח של HDX-MS assay מוצג20. פרוטוקולי ההכנה לדוגמה המוצגים להלן צריכים להיות רלוונטיים בדרך כלל לכל חלבון המציג מסיסות טובה במאגרים מימיים. שיטות הכנה מדגם מיוחדות יותר ותהליכי עבודה HDX-MS זמינים עבור חלבונים מאשר צריך להיות assayed בנוכחות חומר ניקוי או פוספוליפידים21,22,23,24. הגדרות אינסטרומנטליות לאיסוף נתונים HDX-MS מתוארות עבור ספקטרומטר מסה מרובע ברזולוציה גבוהה בשילוב למערכת כרומטוגרפיה נוזלית. נתונים של מורכבות ורזולוציה דומים ניתן לאסוף על כל אחד ממספר מערכות ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית זמינה מסחרית (LC-MS). היבטים מרכזיים של עיבוד הנתונים באמצעות חבילת תוכנה זמינה מסחרית מסופקים גם כן. כמו כן, אנו מציגים קווים מנחים לאיסוף וניתוח נתונים התואמים להמלצות של קהילת HDX-MS הרחבה יותר12. הפרוטוקול המתואר משמש לחקר המאפיינים המבניים הדינמיים של HalM2, סינתטאז lanthipeptide המזרז את התבגרות רב-שלבי של מוצר טבעי פפטיד מיקרוביאלית20. אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש ב- HDX-MS כדי לחשוף אתרי איגוד מצע ומאפיינים אלוסטריים שחמקו מאפיון קודם. מספר פרוטוקולים אחרים על חלבון HDX-MS פורסמו בשנים האחרונות25,26. יחד עם העבודה הנוכחית, תרומות קודמות אלה אמורות לספק לקורא גמישות מסוימת בעיצוב ניסיוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים מנווטים ופתרונות מלאי אנזימים

  1. הכן ריאגנטים הדרושים לתגובות HDX (כולל כל מאגרים, מלחים, מצעים, ליגנדים וכו ') כפתרונות מלאי מרוכזים 100-200x ב- D2O (99.9% שבר אטום D). הכן לפחות 50 מ"ל של פתרון מלאי מאגר.
    הערה: לאפיון HalM2, הפתרונות הבאים הוכנו: 500 mM MgCl2, 100 מ"מ טריס (2-קרבוקסיתיל) פוספין (TCEP), 750 מ"מ ATP (במאגר HEPES), 800 מ"מ HEPES pD 7.1, 500 מיקרומטר HalA2 ו 500 mM AMPPNP.
  2. להקפיא ולליופיליז את פתרונות המלאי ליובש.
  3. להתמוסס מחדש ב D2O, ולחזור על מחזור lyophilization לפחות פעם אחת נוספת להחליף כמה שיותר פרוטונים להחלפה עם deuterons ככל האפשר.
  4. התאם את ה- pD של מלאי מאגר HEPES המנוון לערך הרצוי עם NaOD/DCl מרוכז, תוך התחשבות בקשר הגומלין הבא27:
    Equation 1
    הערה: קצב ה-HDX של amide תלוי מאוד ב- pL של הפתרון (pL = pH או pD)5. קבוצות שונות של פתרונות מלאי מאגר צריך להיות מוכן, מאוחסן, ולהשתמש באופן זהה כדי למנוע סחף pL קל בין ניסויים.
  5. לחשב את הכמות של כל מגיב הדרוש עבור 300 μL HDX assay ולאחסן כמו aliquots לשימוש יחיד ב -80 °C (70 °F).
  6. הכינו תמיסת מלאי אנזימים מרוכזת (כ-100-200 מיקרומטר) במאגר אחסון אנזימים פרות באמצעות מסנן צנטריפוגלי(טבלת חומרים)או מכשיר שווה ערך.
    הערה: המאגר המדויק וחיתוך המשקל המולקולרי של המסנן הצנטריפוגלי יהיו תלויים בחלבון/אנזים המעניין. HalM2 מאוחסן 50 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM KCl, ו 10% גליצרול. 10 מסנני kDa שימשו להכנת האנזים המרוכז.
  7. אליעזר את האנזים לחלקים חד פעמיים ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: זו יכולה להיות נקודת עצירה. ניתן להכין את כל פתרונות המלאי המתוארים בסעיף 1 לקראת תגובות ה-HDX. אם מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס, רוב האנזימים / פתרונות מלאי מנואים יהיו יציבים במשך חודשים רבים.

2. כיול עוצמת מרווה HDX

  1. הכינו תגובת HDX של 300 μLב-D 2O בעזרת ריאגנטים מרוטשים ומניות אנזימים מרוכזות שהוכנו בסעיף 1.
    1. השתמש בריכוז אנזים סופי של 1-5 מיקרומטר.
    2. השתמש בריכוז מאגר HEPES אחרון של 50-100 מ"מ לפחות.
    3. ודא את הריכוזים של רכיבים אחרים מספיקים כדי לשמור על פעילות /פונקציה האנזים הרצוי.
  2. הכן 1 L של פתרון מרווה HDX (100 מ"מ פוספט, 0.8 M guanidine-HCl, pH 1.9). להקפיא ולאחסן הן מנות 50 מ"ל (עבור מלאי לטווח ארוך) ו 1 מנות מ"ל (עבור aliquots לשימוש יחיד).
    הערה: ההרכב המדויק של מאגר הרווה יהיה תלוי באנזים המשמש בשלב הפרוטאוליזה של זרימת העבודה HDX-MS מלמטה למעלה (שלב 3.3.3). מאגר הרווה שניתן כאן תואם לפפסין, הפרוטאז הנפוץ ביותר עבור HDX-MS. אם נעשה שימוש בפרוטאז אחר, בדוק עם ספק הפרוטאז כדי להבטיח תאימות מאגר.
  3. כייל את עוצמת הקול של מאגר הרוויה הדרוש כדי להתאים את ה- pL הסופי של תערובת תגובת HDX מרווה לערך קריאה של מד pH של 2.3.
    הערה: שער החליפין של פפטיד אמיד N-H הוא תהליך תלוי pH הכפוף הן לחומצה והן לקטליזה בסיסית. שער החליפין המינימלי מופיע בערך של pH 2.5 (קריאת מד pH = 2.3 עבור תערובת 50:50 H2O:D2O). לכן, ערך pL הסופי ליד 2.5 יהיה למזער חילופי מימן בחזרה המתרחשת במהלך ניתוח LC-MS מלמטה למעלה, ובכך לשמר את תווית דיטריום בפפטידים.
    1. מערבבים 50 μL של תערובת תגובת HDX משלב 2.1 עם 50 μL של חיץ מרווה ולמדוד את ה- pL של התערובת מרווה עם אלקטרודה microtip.
    2. הגדל את עוצמת הפתרון להרוות לפי הצורך כדי להתאים את קריאת מד ה- pH הסופית לערך של 2.3.
    3. לאחר קביעת עוצמת הריוות המתאימה, חזור על תהליך ההתרוממה מספר פעמים באמצעות ציטוטים טריים של 50 μL מתגובת HDX (שלב 2.1) כדי להבטיח ש- pL סופי עקבי יושג עם תוספת של כמות קבועה של מאגר מרווה.

3. הכנת דגימות ייחוס ואופטימיזציה של זרימת העבודה של LC-MS מלמטה למעלה

  1. הכינו דגימות ייחוס לא מאויטות לחלבון המעניין בטריפלאט בצינורות של 0.5 מ"ל. ודא שתנאי תערובת התגובה הסופיים זהים לאלה המשמשים בתגובות HDX אותנטיות (שלב 2.1), אלא שהתגובות מוכנות ב- H2O באמצעות פתרונות מלאי ריאגנטיים שהוכנו גם ב- H2O.
  2. מרווה את הדגימות כמו בשלב 2.3 על-ידי הוספת עוצמת הקול המתאימה של מאגר quench כדי להתאים את ה- pH הסופי ל- 2.5. פלאש להקפיא את הדגימות חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד מוכן לניתוח.
  3. נתח את דגימות ההפניה לאנזימים המתוחים באמצעות זרימת עבודה של LC-MS מלמטה למעלה.
    הערה: לפני ביצוע שלבים אלה, יש לכייל כראוי את מערכת LC-MS המשמשת לרכישת נתונים ולהיות מוכנה לשימוש. התזמון והטמפרטורה של כל השלבים בזרימת העבודה של LC-MS מלמטה למעלה חייבים להיות נשלטים בקפדנות על מנת למזער את ההבדלים בחילופי הדברים בין הדגימות. עם מכשור MS המשמש בפרוטוקול זה (טבלת חומרים ו מידע תומך), ניתן לשלוט ברוב השלבים באמצעות תוכנת המכשיר. כדי להבטיח איסוף של משכפלים מדויקים, מומלץ להפוך כמה שיותר שלבים בזרימת העבודה לאוטומטיים.
    1. הסר דגימת ייחוס אנזים בודד (מוכן כמו בשלב 3.2) מהמקפיא ולהפשיר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות באמבט מים.
    2. בדיוק 2 דקות לאחר הסרת המדגם מהמקפיא והפשרה, להזריק חלק 40 μL של מדגם התייחסות מרווה לתוך כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה (UPLC) עמודה (2.1 x 30 מ"מ, 300 Å, 5 μM) המכיל שלב נייח פונקציונלי עם פפסין (פרוטאז חומצה יציבה).
    3. לעכל את המדגם בקצב זרימה של 100 μL / min במשך 3 דקות ב 15 מעלות צלזיוס באמצעות 0.1% חומצה פורמית ב H2O (pH = 2.5) כמו הממס.
    4. לאסוף את פפטידים פפטי כפי שהם לברוח מעמוד פפסין על עמוד מלכודת C18 שנערך ב 0.4 °C (69 °F) כדי למזער את ההחלפה בחזרה.
    5. מעבירים את הפפטידים הפפטיים המותפלים מעמודת המלכודת לעמודה אנליטית C18 (1 מ"מ x 100 מ"מ, 1.7 מיקרומטר, 130 Å) מוחזקים ומופעלים ב-0.4 מעלות צלזיוס להפרדת הפפטידים הפפטיים.
      הערה: מערכות LC-MS מסוימות המשמשות לרכישת נתונים מסוג HDX-MS יכולות להפוך לאוטומטיות בשלבים 3.3.3-3.5. לחלופין, צעדים אלה יכולים להתבצע באופן עצמאי, תוך התחשבות כי התזמון והטמפרטורה של כל צעד צריך להיות נשלט בקפידה כדי להשיג חילופי גב נמוך באופן עקבי.
    6. Elute עמודת C18 עם אצטוניטריל / מים / 0.1% מערכת ממס חומצה פורמית. מטב את שיפוע ה-LC לחלבון המעניין על מנת למקסם את ההפרדה ולשמור על תווית ה deuterium בפפטידים הפפטיים.
      הערה: פרטי ההדרגה של מעבר הצבע מסופקים במידע התומך.
    7. הכפיף את התקציר הפפטי לספקטרומטריית מסה אלקטרוספרית (ESI).
      הערה: תנאי המקור המסופקים במידע התומך יספקו יינון מספיק עבור רוב הפפטידים הפפטיים.
      1. לאחר מיוננת במכשיר MS, לבצע הפרדת ניידות יון שלב גז באמצעות חנקן כמו גז חיץ כדי לשפר את קיבולת השיא של השיטה.
      2. בעקבות הפרדת ניידות היונים, הכפיף את יוני פפטיד מבשר פפטיד לזרימת עבודה MSE מעורבים מחזורים לסירוגין של אנרגיית התנגשות נמוכה (4 V) ואנרגיית התנגשות גבוהה (21-40 V).
        הערה: משטרי האנרגיה של התנגשות נמוכה וגבוהה לסירוגין מאפשרים איסוף של נתוני MS (אנרגיית התנגשות נמוכה) בו-זמנית עם נתוני MSMS (אנרגיית התנגשות גבוהה). זה, בתורו, מאפשר את מתאם הזמן של יונים מבשר עם יונים שבר בהתאמה שלהם. מתאם זה חיוני לזיהוי פפטיד בטוח המתואר בסעיף 4.
      3. לזהות את מבשר פפטיד יונים שבר באמצעות מנתח המוני עם כוח פתרון של לפחות 20,000.
      4. במקביל לרכישת הנתונים, רכוש נתוני MS עבור תקן חיצוני [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib).
        הערה: זרימת העבודה של MS המתוארת בשלב 3.3.7 נקראת פרוטוקול MSE. הגדרות אינסטרומנטליות מלאות עבור פרוטוקול MSE המתאים ל- HDX-MS מלמטה למעלה מסופקות במידע התומך.
    8. הערך את איכות נתוני LC-MS.
      הערה: באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל ואת ההגדרות האינסטרומנטליות המסופקות מידע תומך, דגימות הפניה צריך לייצר כרומטוגרמה יון הכולל עם עוצמת אות מקסימלית של כ 1 x 108. צריך להיות הרבה פפטידים פפטיים שמציקים בין 3-9 דקות(איור 3A-C).
    9. להזריק 40 μL של דגימות ריקות (0.1% חומצה פורמית במים) כדי לנקות את הפפסין ועמודי C18 אנליטיים.
      הערה: באופן כללי, 2-3 ריקים צריכים להספיק.
    10. חזור על שלבים 3.3.1-3.3.9 עבור כל אחת מדגימות חלבון הייחוס המשולשות.

4. עיבוד נתוני הייחוס והגדרת רשימת פפטיד

  1. נתח את נתוני MSE הגולמיים (שלב 3.3.7) באמצעות תוכנת פרוטאומיקה(טבלת חומרים). באמצעות תוכנת הפרוטאומיקס, נווט אל ספריות | Databanks רצף חלבון להגדיר את מסד הנתונים של החלבון על ידי ייבוא רצף חומצות אמינו של החלבון של עניין.
    הערה: מטרת שלב זה היא לחפש את נתוני MS הייחוס עבור פפטידים פפטיים הנגזרים מהחלבון המעניין, ולהשתמש בנתוני MSMS (שנרכשו בו זמנית עם נתוני MS) כדי לאמת כל זיהוי פפטיד פואטי.
  2. תן שם לרצף החלבונים של עניין. יבא את רצף החלבונים (בפורמט FASTA). התוכנה תבצע עיכול silico של חלבון מסד הנתונים כדי ליצור רשימה של פפטידים שישמשו לחיפוש בנתוני LC-MS.
  3. הגדר את פרמטרי העיבוד (הממוקמים תחת תפריט ספריה). בחר אלקטרוספריי MSE כסוג רכישת הנתונים. בשדה נעל מסה עבור טעינה 2, הזן 785.8426 עבור m/z עבור 2+ יון של [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) ולחץ על סיום.
  4. הגדרת הפרמטרים של זרימת עבודה (הממוקמים תחת תפריט ספריה).
    1. בחר אלקטרוספריי MSE עבור סוג החיפוש. תחת | זרימת עבודה כותרת שאילתת חיפוש מסד נתונים, בחר את חלבון מסד הנתונים שנוצר בשלב 4.2 בשדה Databank.
    2. שנה מגיב תקציר ראשי ללא ספציפי, ונקה את השדה Reagent משנה קבוע על ידי החזקת לחצן Ctrl בעת לחיצה על Carbamidomethyl C.
  5. ציין את ספריית הפלט על-ידי ניווט לאפשרויות | | הגדרת אוטומציה זהות E. סמן את התיבות עבור Apex 3D ו- Peptide פלט תלת-ממדי ופלט חשבונאות יון וציין את הספריה הרצויה.
  6. עבד את הנתונים לדוגמה של ההפניה.
    1. בסרגל הכלים השמאלי של סביבת העבודה של פלטפורמת proteomics, ליצור צלחת חדשה על ידי לחיצה ימנית על צלחת Microtiter. הדגש שלוש בארות בצלחת המיקרוטיטר (אחת עבור כל דגימת התייחסות שנאספה בסעיף 3). לחץ שמאלה בבאר אחת, החזק וגרור לשלוש בארות.
    2. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר הוסף נתונים גולמיים. בחלון שמופיע, נווט אל הספריה המכילה את שלושת קבצי ההפניה ממקטע 3 ובחר אותם בו-זמנית.
    3. לחץ על הבא ובחר את פרמטרי העיבוד המוגדרים בשלב 4.3. לחץ על הבא ובחר את הפרמטרים של זרימת העבודה המוגדרים בשלב 4.4. לאחר מכן לחץ על סיום.
  7. לאחר שהנתונים הגולמיים, פרמטרי העיבוד ופרמטרים של זרימת העבודה הוקצו לכל באר בצלחת, הבארות ייראו כחולות. בחר את הבארות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר תהליך הנתונים הגולמיים העדכניים ביותר. לחץ על הפינה הימנית התחתונה של החלון כדי לעקוב אחר עיבוד הנתונים. לאחר שההודעה לא מופיעה משימה להפעלה, העיבוד מתבצע במלואו.
  8. לאחר עיבוד הנתונים הושלם, בארות בצלחת יהפוך ירוק. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על בארות ובחר הצג תוצאות זרימת עבודה. ייפתח חלון נפרד עבור כל קובץ נתוני הפניה.
  9. בדוק את הנתונים כדי לוודא שרוב אותות MS בנתוני מדגם הייחוס מופו בהצלחה לפפטידים החזויים מעיכול in-silico של החלבון המעניין. פפטידים תואמים יצבעו בכחול בספקטרום הפלט (איור 4). לחץ פעמיים על המסנן אישור ולבדוק כי כיסוי אחוז גדול מ 99%.
    הערה: בעת העיבוד, פלט הנתונים יישמר באופן אוטומטי עם סיומת הקובץ (raw_data_file_name_IA_final_peptide) בספריה שצוינה בשלב 4.5.
  10. יבא את פלט התוכנה proteomics לתוכנת עיבוד HDX (טבלה של חומרים) עבור סף נוסף.
    1. לחץ על נתונים בפינה השמאלית של חלון התוכנה לעיבוד HDX. לחץ על ייבוא תוצאות PLGS ולחץ על סמל הוסף. בחר את קבצי הנתונים המעובדים משלב 4.9 על-ידי ניווט לספריה המתאימה.
    2. לחץ על הבא וציין את הפרמטרים הבאים: יונים רצופים מינימליים ≥ 2, שגיאת מסה = 5 עמודים לדקה, וסף קובץ = 3. לחץ על סיום.
  11. לאחר מרוצה הפרמטרים thresholding, לשמור את הפרויקט HDX. כל נתוני HDX ייובאו לתוך פרוייקט זה לצורך ניתוח ותצוגה.
    הערה: יהיה צורך לעבד את הדגימות שהוחלפו ב- deuterium המתוארות בסעיף הבא עם זרימת עבודה זהה של LC-MS. לכן, לפני שתמשיך עם מבחני HDX (סעיף 5), ודא שהכנת הדגימה (סעיף 2), זרימת העבודה של LC-MS מלמטה למעלה (סעיף 3) ותהליכי עבודה לעיבוד נתונים (סעיף 4) מספקים את השחזור הרצוי ואת כיסוי הרצף של חלבון היעד. אם יש צורך לשנות אחד מתהליכים אלה כדי לשפר את הכיסוי, מומלץ לחזור לשלב 2.1, להכין דגימות ייחוס טריות בשליש ולחזור על סעיפים 2-4 (תוך ביצוע ההתאמות הדרושות לפרוטוקול) כדי להבטיח שניתן יהיה ליצור ולזהות כל פפטיד.

5. ביצוע תגובות HDX

  1. הכן סביבת עבודה לתגובות HDX.
    1. חיץ מרווה טרום אליקוט לצינורות 0.5 מ"ל מסומנים כראוי. הכינו צינור שונה לכל נקודת זמן, לכל שכפול ולכל מצב ביוכימי שיש לנתח. השתמש בנפח המתאים של חיץ מרווה משלב 2.2 הדרוש כדי להתאים את קריאת מד ה- pH הסופית של חלק של 50 μL מתגובת HDX לערך של 2.3.
    2. בקצרה צנטריפוגה אמבטיות 0.5 מ"ל להעביר את כל חיץ להרוות לתחתית הצינור. מניחים את הצינורות על קרח.
    3. ממלאים דיואר קטן בחנקן נוזלי ושומרים צמוד לסביבת העבודה.
  2. הכינו את תגובות ה-HDX. ודא כי יש נפח תגובה מספיק כדי לאסוף את המספר הרצוי של נקודות זמן ההחלפה (אחד 50 μL aliquot עבור כל נקודת זמן רצויה). לאסוף לפחות 4-5 נקודות זמן על פני 3-4 סדרי גודל בסולם הזמן (למשל, להרוות פעמים של 15 s, 60 s, 300 s [5 דקות], 1,800 s [30 דקות], ו 14,400 s [4 h] לספק כיסוי הולם של דינמיקת החליפין עבור רוב האנזימים).
    1. יש לערבב מראש את כל הרכיבים המרוטים (מינוס אנזים) משלב 1.1ב-D 2O.
    2. עבור כל מצב ביוכימי להיבדק (אנזים חינם, אנזים + ligand, אנזים + מעכב, וכו '), להכין תגובות HDX לפחות משולש.
    3. דגירה תערובות התגובה באמבט מים מבוקר טמפרטורה ב 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לפני תוספת של האנזים.
      הערה: האנזים צריך להיות מוכן כפתרון מלאי מרוכז (~ 100-200 מיקרומטר, שלב 1.6) כדי למזער את התוספת של פרוטיום לתוך HDX assay.
    4. לאחר הוספת האנזים לריכוז סופי של 1-5 מיקרומטר, התחל את שעון העצר. בזהירות ובמהירות לערבב את הפתרון באמצעות פיפטה 200 μL כדי להבטיח כי האנזים מופץ באופן שווה במדגם.
    5. בנקודות זמן ההחלפה הרצויות, להסיר 50 μL aliquots מתגובת HDX ומערבבים במהירות ובאופן שווה עם חיץ מרווה קר כקרח מראש בצינור 0.5 מ"ל.
      הערה: נפחי הערבוב והליך הערבוב חייבים להיות מדויקים וניתן לשחזור ככל האפשר כדי להבטיח שה- pL של מרווה סופית רצויה של 2.3 מושגת במהירות בכל הדגימות. שמירה על קרח חיץ מרווה קר יעזור למזער את ההחלפה בחזרה על denaturation של אנזים.
    6. מיד לאחר מרווה את מדגם HDX, כובע הצינור פלאש להקפיא חנקן נוזלי.
    7. המשך לאסוף נקודות זמן עד להשלמת כל מבחני ההכנה ולאחר מכן העבר דגימות למקפיא -80 °C (60 °F) לאחסון.
      הערה: זו יכולה להיות נקודת עצירה. לאחר איסוף כל נקודות הזמן HDX, ניתן לאחסן את הדגימות ב -80 °C (70 °F) עד מוכן לניתוח LC-MS. באופן אידיאלי, תגובות HDX משולש צריך להתבצע עבור כל מצבי עניין ביוכימיים באותו יום. לכל הפחות, כל תגובות HDX לשכפל עבור מצב ביוכימי נתון צריך להיות לרוץ במקביל באותו יום.
  3. לאחר איסוף כל נקודות הזמן של HDX מרווה, לחשוף את הדגימות לזרימת העבודה LC-MS ממוטבת מלמטה למעלה שפותחה כמתואר בשלב 3.3. הזרק דגימות HDX בסדר אקראי עם מספר מתאים של ריקים בין דגימות כדי להבטיח כי כל פפטיד לשאת מעל הוא מינימלי.
    הערה: אין צורך לאסוף נתוני HDX במצב MSE. לפיכך, יש להסיר את מקטע האנרגיה של התנגשות גבוהה (שלב 3.3.7.2) ממחזור החובה של MS. זה צריך להיות השינוי היחיד שנעשה בזרימת העבודה המתוארת בשלב 3.3.
  4. להעריך את האיכות של נתוני HDX כפי שהוא נאסף.
    1. ודאו שהפסגות הכרומטוגרפיות הקיימות בכרומטוגרמה הכוללת של היונים של דגימות הייחוס הבלתי מוגדרות יופיעו באותו זמן שמירה בדגימות המרוטשות (כמו באיור 3D-F).
    2. ודא שספקטרום מסה שסוכם על פני מרווחי זמן ספציפיים מהפניות ודגימות מנוטרלות מראה ראיות לניתוק (כלומר, הסטה במעטפה האיזוטופית של פפטידים בודדים לערכי m/z גבוהים יותר בדגימות המנוטרלות [איור 6]).

6. עיבוד נתוני HDX

  1. יבא את נתוני HDX לפרויקט HDX שנוצר בשלב 4.11 על ידי לחיצה על נתונים | קבצי MS בסרגל הכלים העליון.
    1. לחץ על מצב חדש וחשיפה חדשה לפי הצורך כדי להגדיר את המצבים הביוכימיים (למשל, אנזים חופשי, אנזים + ליגנד וכו ') וזמני חשיפה דיטריום, בהתאמה, הרלוונטיים לניתוח.
    2. לחץ על Raw חדש כדי לבחור את קבצי הנתונים HDX שיש לנתח. הקצה את זמני ההחלפה המתאימים ואת המצב הביוכימי לכל קובץ נתונים גולמי המיובא.
      הערה: ניתן לייבא ולעבד את הנתונים באצוות, או בבת אחת. הוספת נתונים לפרוייקט לא תבטל ניתוח שבוצע בעבר בתוך פרוייקט זה.
  2. לאחר הוספת קבצי הנתונים, לחץ על סיום כדי להתחיל בעיבוד הנתונים. לאחר השהיה קצרה, התוכנה תשאל אם המשתמש רוצה לשמור את הנתונים לפני שתמשיך. לחץ על כן.
    הערה: העיבוד הראשוני יכול להימשך עד מספר שעות, תלוי כמה דגימות מנותחות, כמה פפטידים נמצאים ברשימת הפפטיד הסופית (שלב 4.10), גודל החלון הכרומטוגרפי ותדירות הרכישה הספקטרלית.
  3. אם תרצה, שנה את פרמטרי העיבוד בתפריט תצורה כדי לשנות את פרמטרי החיפוש של היונים. הקפד להשתמש באותם פרמטרי חיפוש ion עבור כל הנתונים בפרוייקט נתון.

7. ניתוח והדמיה של נתוני HDX

הערה: לאחר השלמת העיבוד הראשוני של הנתונים הגולמיים (שלב 6.2), תוכנת עיבוד ה- HDX תמוקם פפטידים מרשימת הפפטיד (הנוצרת בשלב 4.10) בכל אחד מקבצי הנתונים הגולמיים שנותחו. לאחר שהתפלגות האיזוטופים עבור פפטיד ברשימה ממוקמת בקובץ נתונים גולמי, תוכנת עיבוד HDX מייצגת כל איזוטופ עם "מקל" (כמו באיור 6C-E). העוצמות היחסיות של המקלות לפפטיד נתון משמשות לאחר מכן לחישוב ספיגת הדיאוטריום ביחס לספקטרום הייחוס. בעוד תוכנת עיבוד HDX עושה עבודה ראויה להערצה של הקצאת כראוי "מקלות" לרוב הפפטידים, אוצרות ידנית משמעותית של ערכי ספיגת deuterium עדיין יידרש.

  1. ניתוח ערכי ספיגת דיטריום פפטיד
    1. בחרו בפפטיד הראשון ברשימת הפפטיד ופתחו את העלילה הספקטרלית המוערמת מתפריט 'תצוגות'. גללו למעלה ולמטה בחלון התוויית הספקטרום המוערם כדי לראות את ספקטרום המסה של הפפטיד שנבחר כפונקציה של זמן חילופי דיטריום (איור 7D,E).
    2. הקצאה ו ביטול הקצאה של מקלות לפי הצורך באמצעות לחיצות עכבר כדי להבטיח שהתפלגות האיזוטופים המתאימה אותרה בנתונים ושכל פסגות איזוטופ הוקצו (מקלות שהוקצו יופיעו כחולים). לחיצה על כל אחד מהספקטרום בעלילה הספקטרלית המוערמת (איור 7D,E)תאפשר למשתמש להקצות/לבטל הקצאה של מקלות בחלון מציג הנתונים הפעיל (איור 7C).
    3. בדוק את הקצאות המקל עבור כל מצב טעינה על-ידי החלפת מצב הטעינה בחלק העליון של חלון ההתוויה הספקטרלי המוערם.
    4. חזור על שלבים 7.1.1-7.1.3 עבור כל מצב ביוכימי של עניין. ניתן גם לעבור את המצב הביוכימי בחלק העליון של חלון העלילה הספקטרלי המוערם. למדידות מדויקות ביותר של הפרשי ספיגת דיטריום, ודאו שמקלות מוקצים עבור אותה קבוצת מצבי טעינה עבור כל מצב ביוכימי.
    5. חזור על שלבים 7.1.1-7.1.4 עבור כל פפטיד ברשימת הפפטיד.
    6. בדוק את סטיית התקן של ערכי ספיגת דיטריום פפטיד באמצעות מפת הכיסוי.
      1. גש למפת הכיסוי מתפריט 'תצוגות', המציג כל פפטיד ברשימת הפפטיד הממופה לאורך רצף חומצות האמינו של חלבון העניין(איור 8C). צבע את הפפטידים לפי סטיית תקן יחסית (יחידות Da).
      2. חפשו במפה פפטידים חריגים עם סטיית תקן יחסית גבוהה. לחצו על הפפטידים החריגים במפת הכיסוי כדי לאכלס את החלקות הספקטרליות המוערמות (איור 8B)ואת חלון מציג הנתונים (איור 8A)בפפטיד היעד.
      3. באמצעות העלילה הספקטרלית המוערמת, בדוק היטב שכל מצבי הטעינה וכל נקודות הזמן של הפפטיד החריג הקצו מקלות כראוי.
        הערה: לרוב, פפטידים עם סטיות תקן גדולות (>0.3 Da) כוללים פסגות איזוטופיות שלא הוקצו כראוי על ידי התוכנה (כפי שצוין באיור 8B). הקצאת מקלות חסרים תאפשר בדרך כלל להפחית את סטיית התקן היחסית של פפטיד ל- <0.3 Da.
      4. הסתר את הפפטיד מהרשימה אם לא ניתן להפחית את סטיית התקן היחסית לפחות מ- 0.3 Da.
  2. ייצוא נתוני הפרש HDX בין שני מצבים ביוכימיים למיפוי על מודל מבני של החלבון של עניין.
    1. הצג את הפרשי העניין במפת הכיסוי. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מפת העיתוד כדי לייצא את נתוני ההפרש לקובץ .csv. יצא את נתוני המצב (בתבנית .csv) על-ידי ניווט אל נתונים | יצא נתוני מצב בסרגל הכלים הראשי.
      הערה: עיצוב מתאים של נתוני ההפרש וקבצי נתוני המצב מסופק במידע התומך.
    2. יבא את נתוני ההפרש, את נתוני המצב ואת קובץ ה- pdb של החלבון המעניין לתוך Deuteros28. בחר את הרווח בר-הסמך של 99%, בחר הפוך סכום לזמיןועיבד את הנתונים.
      הערה: יש להתקין את MATLAB במחשב כדי להפעיל את Deuteros. Deuteros ישתמש במדידות השכפול בערכת הנתונים כדי לחשב את סטיית התקן של נתוני הספיגה עבור כל פפטיד. סטיית תקן זו תשמש להגדרת הרווח בר-הסמך עבור החלפה משמעותית, שתוצג על ההתוויות.
    3. תחת אפשרויות PyMOL, בחר ספיגת ייצוא | לייצא כדי ליצור סקריפט Pymol למפות אזורים של הבדל חילופי משמעותי על מבנה pdb של החלבון של עניין באמצעות תוכנת PyMOL.
      הערה: באמצעות זרימת העבודה המתוארת בפרוטוקול זה, מרווח הביטחון של 99% עבור הפרש משמעותי של ספיגת דיטריום עבור פפטיד נתון בנקודת זמן אחת הוא בדרך כלל 0.3-0.5 Da. מרווח הביטחון של 99% עבור ההפרש המסוכם על פני כל נקודות זמן ההחלפה הוא בדרך כלל 0.7-1.0 Da.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יש צורך להעריך את איכות העיכול הפרוטאוליטי ואת הרבייה של זרימת העבודה עבור כל קבוצה של זריקות מדגם. לכן, לפני ביצוע מבחני HDX-MS, חיוני לקבוע תנאים יעילים לפרוטאואליזה של החלבון המעניין, להפרדת פפטידים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית פאזה הפוכה וניידות שלב גז יון, ולגילוי פפטידים באמצעות טרשת נפוצה. לשם כך, יש לחקור תחילה את דגימות הייחוס לחלבון המעניין (שנאסף בהיעדר דיטריום) (סעיף 3). הנתונים הכרומטוגרפיים באיור 3A-C מראים את סך כרומטוגרמות היונים (TICs) עבור שלוש דגימות ייחוס של סינתזת הלם-2 לנטיפפטיד. TIC הוא השינוי תלוי הזמן בסכום של כל ערכי היונים הכלולים בסריקה הספקטרלית של המסה. מבט מקרוב על ה- TICs בין 3 ל- 8 דקות מוצג באיור 3D-F. ספקטרום המסה המוצג באיור 3G-I מייצג סיכום של כל ספקטרום המסה על פני מרווח זמן קטן (מ- 5.0 עד 5.1 דקות) של כל TIC. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לתכונות הבאות באיור 3.

ראשית, הפסגה הגדולה הקרובה ל-9.3 דקות בסוף השיפוע מייצגת שברי HalM2 (איור 3 A-C) שלא יתעכלו באופן חלקי (ולכן, שברים גדולים והידרופוביים יותר) של HalM2(איור 3A-C). העיכול יכול להיות יעיל יותר על ידי הפחתת ריכוז HalM2, אבל זה יקטין את עוצמת אות פפטיד ואות:יחס רעש. העיכול יכול גם להיות יעיל יותר על ידי הגדלת זמן המגע (מ 3 דקות, פרוטוקול שלב 3.3.3) עם עמודת פפסין. עם זאת, זמן מגע מוגבר יגרום להחלפה אחורית רבה יותר. בסופו של דבר, פרמטרים אלה צריכים להיות מאוזנים עבור החלבון של עניין על מנת לספק את כיסוי הרצף הרצוי, עוצמת האות, ושמירת דיטריום. שנית, הצורה והעוצמה של פרופילי ה-TIC צריכות להיות דומות (כמו באיור 3D-F). זה מרמז כי העיכול הפרוטאוליטי של HalM2 הוא לשחזור והוא של יעילות דומה בכל שלוש דגימות התייחסות. הציפייה היא כי עיכול דומה של מדגם שהוחלף deuterium יפיק את אותה קבוצה של פפטידים עם זמני שמירה דומים. שלישית, גם ספקטרום המסה על פני מרווח זמן נתון צריך להיות דומה (איור 3G-I). השוואה ויזואלית מהירה של ספקטרום המסה המסוכם על פני מרווח הזמן של 5.0-5.1 דקות של ההפרדה הכרומטוגרפית מראה כי אותות ספקטרליים המוניים בכל מדגם אכן דומים מאוד, ומספקים ביטחון כי פפטידים דומים קיימים בכל מדגם והם מתרוצצים בזמנים דומים מעמודת C18. בדיקה חזותית מהירה דומה צריכה להתבצע על פני מרווחי זמן אחרים על פני הכרומטוגרמה.

לאחר אימות חזותי של הדמיון בנתוני LC-MS של דגימות הייחוס, תוכנת proteomics משמשת לחיפוש בנתוני MS אחר פפטידים הנגזרים מרצף חומצות האמינו של החלבון המעניין. לאחר הגדרת מאגר הנתונים של רצף החלבונים (רצף חומצות האמינו של החלבון המעניין), העיבוד ופרמטרים של זרימת העבודה כמתואר בשלבי פרוטוקול 4.2-4.4, כל דגימת התייחסות בודדת מעובדת כדי לזהות פפטידים פפטיים התואמים לפפטידים חזויים הנגזרים מחלבון העניין. דוגמה לפלט התוכנה הפרוטאומית עבור דוגמת הפניה לא מוגדרת של HalM2 מוצגת באיור 4. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לתכונות הבאות. ראשית, כל אות טרשת נפוצה המותאם לפפטיד ספציפי בתוך החלבון המעניין על פי הערכים המוגדרים בפרמטרי העיבוד וזרימת העבודה ייצבע בכחול בספקטרום התחתון. אם דוגמת הפניה מעובדת "בהצלחה", רוב האותות יופיעו כחולים (כמו במקרה של הנתונים באיור 4). יתר על כן, בחלונית השמאלית העליונה, ודא כי "מסנן אישור" הוא הוחצה לסימן הביקורת הירוק. כאשר פעולה זו תסתיים, הנתונים הסטטיסטיים בסרגל העליון של הלוח הימני העליון (המסומן בכחול באיור 4)ישקפו רק את הפפטידים שנותנים ציוני ביטחון גבוהים. פפטידים אלה מפגינים דיוק מסה נמוך של עמודים לדקה, יוני שברים מרובים ומתאם טוב בין זמני שימור שברים ויוני אב, ונחשבים לזיהויים בטוחים. עבור מדגם הייחוס HalM2 המוצג, 1,421 פפטידים זוהו עם ציונים גבוהים, מכסה 99.6% מרצף HalM2. כיסוי רצף קרוב ל-100% צריך להיות בר השגה עבור רוב החלבונים באמצעות זרימת העבודה של LC-MS מלמטה למעלה המתוארת בפרוטוקול סעיף 3. יתר על כן, סטטיסטיקות שימושיות נוספות עבור כל פפטיד מסומנות בטבלה בלוח הימני העליון, כולל שגיאת המסה, זמן השמירה של קודמן, מספר הקטע (יוני המוצר), הרשימה המלאה של יונים מפוצלים לפי שם וזמן הסחף של ניידות היונים. מידע זה שימושי עבור הפרשנות של תוצאות, אשר תמיד צריך להיות ממוקד על פפטידים המזוהים ביותר בביטחון.

רשימת הפפטיד הסופית צריכה להיקבע על ידי סף נוסף בתוכנת עיבוד HDX. לאחר ניתוח נתוני הייחוס כדי ליצור את רשימת הפפטיד (סעיף פרוטוקול 4), יש לייבא את הפלט לתוכנת עיבוד HDX לסף נוסף. קבצי הפלט יאוחסנו בספריה כפי שהוגדרה בפרוטוקול שלב 4.5 עם סיומת הקובץ "..._IA_final_peptide.csv". עם העלאת הפלט לתוכנת עיבוד HDX , הרשימה המלאה של פפטידים תוצג בחלונית "תצוגה מקדימה של פפטיד"(איור 5),ומספר הפפטידים, כיסוי הרצף והיתירות יוצגו בפינה הימנית התחתונה של החלון. ערכים אלה ישתנו בזמן אמת עם החלת סף נוסף. לאחר לחיצה על הבא, ניתן להגדיר ערכי סף בשדות שצוינו. המסננים הקריטיים ביותר הם "סף הקובץ" שדורש שכל הפפטידים ימוקמו בכל אחת משלוש דגימות ההפניה, "שגיאת MH+ המרבית (ppm)" שיש להגדיר לערך <10 עמודים לדקה ו"מוצרים עוקבים מינימליים", המחייבים את הפפטיד ליצור לפחות שני יוני שבר רצופים במהלך שלב MSMS (כלומר, אנרגיית התנגשות גבוהה) של זרימת העבודה של MSE (שלב פרוטוקול 3.3.7.2).

המגבלה הטכנית המשמעותית ביותר של ה-HDX-MS assay היא ההחלפה האחורית של דיטריום לפרוטיום המתרחשת ברגע שדגימות שהוחלפו על-ידי דיטריום מרווה (עם מאגר פרוטי). ההחלפה האחורית נמשכת במהלך עיכול פרוטאז וחלקי LC-MS של זרימת העבודה. החלפה אחורית היא בלתי נמנעת, אך אם ה- pH, הטמפרטורה והתזמון של כל השלבים שלאחר הרוויה נשלטים בקפידה כמתואר בפרוטוקול, ניתן לשמור על 60%-70% מתווית ה- deuterium. מסיבה זו, חיוני לבדוק בשלבים המוקדמים של התפתחות הבדיקה כי רוב הפפטידים שומרים על דיטריום. ניתן להשיג זאת במהירות על-ידי השוואת הנתונים הגולמיים של מדגם מנוון לזה של דוגמת הפניה. כפי שנעשה כדי להבטיח שחזור של דוגמאות ההפניה (איור 3), השווה את ה- TICs של דוגמאות ההפניה שהוחלפו על-ידי deuterium ו- undeuterated, כדי להבטיח שצורות הפרופילים יהיו דומות זו לזו. בנוסף, לסכם את ספקטרום המסה על אותו מרווח זמן כרומטוגרפי בשתי הדגימות. רוב הפפטידים במדגם שהוחלפו על-ידי דיטריום אמורים להציג שינויים ברורים בהתפלגות האיזוטופית שלהם לעבר ערכי m/z גבוהים יותר (כמו באיור 6). נתונים אלה מצביעים על כך שחלק ניכר של תווית deuterium נשמר לאורך כל מרווה חומצה, עיכול פפסין, ואיסוף נתונים LC-MS.

לאחר אימות שזרימת העבודה מספקת שמירה מספקת של דיטריום, יש לכמת את ספיגת ה deuterium. לכן, הנתונים הגולמיים עבור דגימות שהוחלפו ב- deuterium מיובאים לתוכנת עיבוד HDX. באמצעות דגימות הייחוס ורשימת הפפטיד הסופית, תוכנת עיבוד ה- HDX תאתר את הפפטידים מרשימת הפפטיד בכל אחד מקבצי הנתונים הגולמיים ותקצה "מקלות" לכל אחת מהפסגות האיזוטופיות. בנתונים הייצוגיים של HalM2 המוצגים באיור 7, המקלות שהוקצו בהצלחה צבועים בכחול בכל הספקטרום. לאחר הקצאת מקלות, ערך centroid m/z עבור ההתפלגות האיזוטופית ייקבע על-ידי התוכנה וישמש לחישוב ספיגת דיטריום ביחס לדוגמת ההפניה הלא מוגדרת. יש לבדוק באופן ידני את ערך ההחלפה של deuterium עבור כל פפטיד. באיור 7, הפפטיד הנוכחי שנבחר (HIDKLTVGL, המשתרע על פני שאריות HalM2 110-118) מוצג בלוח השמאלי של מציג הנתונים הראשי (איור 7A). הלוחות האחרים מציגים נתוני HDX המשויכים לפפטיד זה. לחיצה על כל פפטיד ברשימת הפפטיד תאכלס את הלוחות האחרים בנתוני HDX מאותו פפטיד. איור 7B מציג את חלקות ספיגת הדיאוטריום עבור פפטיד 110-118. ערכת נתונים זו מכילה ארבע נקודות זמן החלפה: 0.5, 5, 30 ו- 240 דקות (נאספות בטריפל). נתוני ההחלפה נאספו עבור שני מצבים ביוכימיים: אנזים HalM2 חינם (אדום) והאנזים HalM2 המורכב מ- AMPPNP והמצע שלו פפטיד HalA2 (כחול). שימו לב להפרש הספיגה המשמעותי של דיטריום לפפטיד 110-118 לאורך כל מסלול הזמן ולדיוק הגבוה של מדידות השכפול (קווי שגיאה מוצגים בעלילה באיור 7B). באופן כללי, דיוק דומה במדידת הספיגה יתקבל עבור רוב הפפטידים, תוך הדגשת השחזור של זרימת העבודה המוצגת בפרוטוקול זה. עם כריכת הליגנד (עקומה כחולה באיור 7B),קשר הפפטיד באזור 110-118 של HalM2 עובר ככל הנראה הגנה משמעותית מפני חילופי דיטריום, מה שמרמז על כך שחומצות האמינו באזור 110-118 הופכות למובניות יותר על כריכת ליגנד. מוטיגנזה עוקבת של אזור זה הצביעה על תפקיד בקשירת פפטיד מבשר, HalA220. באיור 7 מוצגים גם החלקות ספקטרליות מוערמות עבור מצב HalM2(איור 7D)ומצב HalM2:AMPPNP:HalA2 (איור 7E). בחלקות אלה, זמן ההחלפה גדל מלמטה למעלה. העלייה ההמונית של פפטיד 110-118 על חילופי דיטריום בנקודות זמן ארוכות יותר ניכרת מבדיקה חזותית. כמו כן, ניכר כי פפטיד 110-118 משתלט על יותר דיטריום במצב HalM2(איור 7D)מאשר במצב ליגה מלא(איור 7E). במידת הצורך, לחיצה על כל אחד מפלחי המשנה באיור 7D או באיור 7E, תאפשר למשתמש לשנות באופן ידני את הקצאת המקלות במציג הנתונים הראשי (איור 7C). עם הקצאת מקל / ביטול הקצאה, תוכנת עיבוד HDX תחשב מחדש את ערכי ספיגת deuterium, וכל החלקות יעודכנו בזמן אמת. באופן דומה, לחיצה על נקודות נתונים בודדות בחלונית ב' תאכלס את מציג הנתונים בלוח C למשימת מקל ידנית.

לאחר שהוקצו מקלות עבור כל פפטיד ונקודת זמן החלפה עבור כל המצבים הביוכימיים, יש לבדוק את סטיית התקן של ערכי הספיגה הנמדדים. הכי קל לבצע זאת עם מפת הכיסוי והעלילה הספקטרלית המוערמת (איור 8). במפת הכיסוי (איור 8C), בחר את המצב ואת זמן ההחלפה של הריבית ולאחר מכן בחר סטיית תקן ספיגה יחסית. הפפטידים במפת הכיסוי ייצבעו בהתאם לסטיית התקן בערך ספיגת ה deuterium הנמדד. בדרך זו, זה יהיה קל מאוד לזהות חזותית פפטידים כי יש מקל איזוטופ mis-assignments. לחיצה על פפטיד חריג (עם סטיית תקן גבוהה) במפת הכיסוי תאכלס את מציג הנתונים הראשי ואת העלילה ספקטרום מוערם עם נתוני HDX מן פפטיד חריג. לאחר מכן ניתן לשנות את הקצאות המקל עבור כל נקודת זמן ומצב טעינה לפי הצורך כדי לתקן את ערך הספיגה הנמדד. שוב, תוכנת עיבוד HDX תעדכן את כל תצוגות הנתונים בזמן אמת כאשר הקצאות המקל ישתנו.

לאחר אוצרות מלאה של ערכת הנתונים HDX, יש לקחת בחשבון את המשמעות של מדידת הפרש ספיגת הדיאוטריום עבור כל פפטיד לפני פרשנות הנתונים. באמצעות גישה המתוארת על ידי Engen ועמיתים לעבודה29, הערכנו ערך ספיגה ממוצע של 0.1 ± 0.1 Da עבור חלבון HalM2 באמצעות זרימת העבודה המתוארת בפרוטוקוללעיל 20. ערך זה עולה בקנה אחד עם השגיאות שדווחו על-ידי אחרים עבור זרימות עבודה דומות מסוג HDX של החלפה מלמעלה למעלה ורציף29,30. לאחרונה, פוליטיס ועמיתים לעבודה פיתחו Deuteros, כלי קוד פתוח שימושי (מיושם MATLAB) לקביעת במהירות הבדלי ספיגה משמעותיים בערכות נתונים HDX28. קבצי קלט מייצגים עבור Deuteros ("State_Data_for_Deuteros" ו- "Difference_Data_for_Deuteros") כלולים במידע התומך. אם מיוצא ישירות מתוכנת עיבוד HDX המתוארת בפרוטוקול זה (טבלה של חומרים), ההבדל וקבצי נתוני מצב יהיה הפורמט המתאים לקריאת קבצים על ידי Deuteros. אם נתוני HDX נוצרים במערכת LC-MS שונה, יהיה צריכה לבנות ידנית קבצי נתונים הדומים לאלה המסופקים במידע התומך.

סביבת העבודה של Dueteros מוצגת באיור 9. לאחר ייבוא הנתונים לתוך Deuteros, המשתמש בוחר את מגבלת הביטחון הרצויה (>מומלץ 98%) ומלחץ על ייבוא וחשב. למפת הנתונים המשוטחת, בחרו כיסוי לסוג נתונים ו'מוחלט' לקנה מידה של צבעים. לחץ על התוויה. עבור החלקות היער, בחר מסנן בינארי כסוג נתונים, מסנן הביטחון הרצוי והפוך את הסכום לזמין. עם לחיצה על העלילה, Deuteros יתווה את כל הפפטידים בכל נקודת זמן חילופי כפונקציה של מיקומם ברצף חומצת האמינו וערכי ספיגת deuterium שלהם. פפטידים המציגים חילופי משמעותיים ייצבעו באדום או בכחול, תלוי אם הפפטיד תופס פחות או יותר דיטריום, בהתאמה, על פי ההבדל המחושב. ערך המשמעות המדווח בכל חלקה (בטווח שבין 0.39 ל- 0.72 Da בנתונים המותווים באיור 9) מחושב בסטיות התקן של הפרשי הספיגה הנמדדים עבור כל פפטיד כפי שנקבע ממדידות השכפול הקיימות בערכת הנתונים. הרווחים בר-הסמך מוצגים כקווים מקווקווים על-פני כל התוויה בודדת. אם אפשרות זו מופעלת, ה"סכום" פשוט מוסיף את הפרש הספיגה הנמדד בכל נקודת זמן עבור כל פפטיד. לבסוף, להדמיה של נתוני ספיגה על המבנה התלת מימדי של החלבון המעניין, בחר ספיגת ייצוא תחת אפשרויות PyMOL, ולאחר מכן יצא. Deuteros יפיק סקריפט PyMOL שניתן לגרור ולהפיל לתוך סביבת העבודה PyMOL המכיל את קובץ pdb פתוח של החלבון של עניין.

זרימת העבודה HDX-MS שהוצגה בפרוטוקול זה שימשה לאפיון המאפיינים הביוכימיים של אנזים (HalM2) המזרז סדרה של שינויים פוסט-תרגומיים על פפטיד מקודד גנטית (HalA2)20. באיור 10, מוצגות תוצאות HDX-MS מייצגות לכריכה של פפטיד מבשר HalA2 למתחם HalM2:AMP-PNP. לוח א' מציג את מפת הכיסוי של HalM2, שבה הצבע מציין את הפרש הספיגה היחסי בין המצב הביוכימי [HalM2:AMPPNP] למצב [HalM2:AMPPNP:HalA2]. Deuteros שימש למיפוי הבדלי ספיגה אלה על מודל הומולוגיה של האנזים HalM2(איור 10B,C). פפטידים בצבע אדום מצביעים על ירידה בספיגת דיטריום על כריכת HalA2, דבר המצביע על כך שאזורים אלה של HalM2 עשויים להיות מעורבים ישירות בקשירת פפטיד מבשר. כדי לחקור השערה זו, אזורים I-III עברו מוטציה ואת המאפיינים הקינטיים של האנזימים וריאנט נחקרו. מוטציות באזור I ו- III הובילו שתיהן לתנודות משמעותיות בזיקה מחייבת פפטיד HalA2, דבר המצביע על כך שאזורים אלה של HalM2 מקיימים אינטראקציה ישירה עם מצע הפפטיד, או נדרשים ליצור מבנים המאפשרים כריכת HalA2. לעומת זאת, למוטציה באזור השני לא הייתה השפעה על הזיקה המחייבת של HalA2, אך מוטציה זו הייתה כמעט נטולת פעילות קטליטית. הסבר אחד לממצא זה הוא שארגון אזור II שנצפה על כריכת HalA2 מפעיל שינוי קונפורמי המפעיל את האנזים. יש לציין, כי לפני מחקר זה לא היה מידע זמין על מצב מחייב HalM2-HalA2 או על השינויים הקונפורמיים הרלוונטיים באופן קטלייתי במערכת, בעיקר משום שהגודל הגדול והאופי הגמיש של HalM2 ו- HalA2 מנעו מחקרים מבניים. לפיכך, נתונים מייצגים אלה על סינתטאז HalM2 lanthipeptide ממחישים כיצד ניתן להשתמש ב- HDX-MS כדי לאתר במהירות אזורים רלוונטיים מבחינה תפקודית של מערכות אנזימים דינמיות מבחינה מבנית - גם בהיעדר נתונים מבניים ברזולוציה גבוהה.

Figure 1
איור 1: החלפה רציפה, זרימת עבודה של HDX-MS מלמטה למעלה. עיין בטקסט לקבלת פרטים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שער ה-HDX תלוי בדינמיקה קונפורמית של חלבונים (kopen ו- kclose) ובשיעור תלוי ה- pH של חילופי הכימיקלים של קשרי N-H בעמוד השדרה של החלבון לאג"ח N-D (kchem). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: נתוני LC-MS מייצגים עבור דוגמאות ההפניה המשולשות של HalM2. המספר בפינה השמאלית העליונה של כל חלונית מייצג את ספירת היונים הכוללת. כל שורה מציגה נתונים עבור דוגמת הפניה שונה. העמודה הראשונה (A-C) מציגה את סך כל כרומטוגרמות היונים (TICs). הפסגה הגדולה ב 9.3 דקות מייצג גדול, פפטידים מעוכלים. העמודה האמצעית (D-F) מציגה תצוגה קרובה יותר של רכיבי ה- TICs בין 3 ל- 8 דקות. שים לב להסכמה הטובה של צורות הפרופילים, המציינת תערובת דומה של אותות פפטיד בכל דגימת הפניה על פני הכרומטוגרמה כולה. העמודה השלישית (G-I) מציגה ספקטרום מסה עבור כל דגימת הפניה הנוצרת על-ידי סיכום כל ספקטרום המסה שנרשם בין נקודת זמן 5.0 ל- 5.1 דקות של הריצה הכרומטוגרפית. בדיקה חזותית של נתונים אלה מצביעה על כך שרבים מאותם פפטידים מזוהים בכל מדגם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פלט תוכנה של proteomics מייצג עבור דוגמת הפניה של HalM2. החלונית השמאלית העליונה מציגה את הרשימה המלאה של פפטידים פפטיים שמקורם ב- HalM2 שזוהו בנתוני MS. שים לב ש"מסנן אישור" מציג את סימן הביקורת הירוק. זה מסנן את הנתונים על פי ציון הביטחון ומסיר זיהויי פפטיד של ביטחון נמוך. הסרגל העליון של החלונית הימנית (מסומן בכחול) מציג נתונים סטטיסטיים מצטברים עבור קבוצת הפפטידים עם ציונים גבוהים. הנתונים הסטטיסטיים החשובים ביותר הם מספר הפפטידים שזוהו (במקרה זה 1,421) וכיסוי הרצף (במקרה זה 99.6%). נתונים סטטיסטיים נוספים עבור כל פפטיד מוצגים גם בלוח הימני העליון. כל עמודה בטבלת נתונים זו ניתנת למיון. הלוח התחתון מציג את כל אותות ה- MS שהותאמו לפפטיד פפטי פפטי צפוי שמקורו ב- HalM2. שים לב שרוב אותות ה- MS הוקצו ונצבעו בכחול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: סף נוסף בתוכנת עיבוד HDX. פלט התוכנה proteomics עבור כל אחת משלוש דגימות הייחוס HalM2 מיובא לתוכנת עיבוד HDX (לוח שמאלי). לאחר ייבוא נתונים, מתבצעת סף נוסף (חלונית ימנית). השדה "מינימום מוצרים רצופים" מתייחס ליונים שבר שנוצר על ידי מחשוף של אג"ח פפטיד סמוכות בפפטיד. הפרמטר "שגיאת MH+ מינימלית" מאפשר למשתמש להגדיר את דיוק המסה המקובל, ו"סף הקובץ" מאפשר למשתמש להגביל פפטידים רק לאותם פפטידים שזוהו בכל שלושת קבצי הייחוס. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: נתונים מייצגים עבור דוגמת הפניה של HalM2 (אדום) ודגימת HalM2 המודגרת במאגר D2O למשך 5 דקות (ירוק). שתי הדגימות היו כפופות לזרימת העבודה של LC-MS מלמטה למעלה המתוארת בפרוטוקול סעיף 3. העמודה השמאלית מציגה ספקטרום מסה המסוכם מעל חלון הזמן של 6.0-6.1 דקות. שלוש העמודות הימניות מציגות תצוגות קרובות יותר של אותה ספקטרום מסה, כאשר המעבר לערכי m/z גבוהים יותר במדגם המנוטרל (ירוק, עליון) ברור לרוב אותות הפפטיד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: צילום מסך של סביבת העבודה בתוכנת עיבוד HDX. (A)רשימת הפפטידים הנגזרים מ-HalM2 המתקבלים מניתוח דגימות הייחוס של HalM2 עם תוכנת הפרוטאומיקס(איור 3)ומהספין הבא בתוכנת עיבוד ה-HDX (איור 4). פפטיד שנבחר כעת (HIDKLTVGL, פורש שאריות HalM2 110-118) מודגש בכחול. (B)עקומות ספיגת הדיאוטריום (כפונקציה של זמן החלפה) עבור שני מצבי העניין הביוכימיים: האנזים HalM2 החופשי, והאנזים HalM2 המאוגד ל- AMPPNP והמבשר lanthipeptide, HalA2. (C) ספקטרום המסה של המדגם שנבחר באופן פעיל (במקרה זה, אחת מדגימות ההפניה של HalM2 שלא נותק). המקלות הכחולים בלוח C ניתנים להקצאה/ביטול הקצאה ידנית לפי הצורך אם הם לא הוקצו כראוי על-ידי תוכנת עיבוד HDX במהלך עיבוד הנתונים הראשוני. (ד,ה) חלקות ספקטרליות מוערמות עבור מצב HalM2 (D) ומצב HalM2:AMPPNP:HalA2 (E). העלייה תלוית הזמן בספיגת דיטריום נראית לעין, כמו גם הבדל הספיגה בין שני המצבים הביוכימיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: מזעור סטיית התקן בערכי ספיגה נמדדים. מפת הכיסוי בתוכנת עיבוד HDX (לוח C) מספקת אמצעי נוח לזיהוי מהיר של פפטידים עם סטיות תקן גדולות בערכי ספיגת ה deuterium הנמדדים שלהם. במקרה היפותטי זה, חלק מפסגות האיזוטופ (מקלות כחולים) עבור שאריות הפפטיד הנגזרות של HalM2 110-118 אינן מוקצות עבור 5 דקות חילופי נקודות זמן (המקלות האפורים בלוח B). הדבר מוביל לסטיית תקן גדולה בערך ספיגת ה deuterium שנמדד עבור נקודת זמן ההחלפה של 5 דקות. סטיית התקן הגדולה ברורה בקלות מהצבע הכחול של פפטיד 110-118 במפת הכיסוי (לוח C) ומפיזור נקודת הנתונים ופס שגיאה גדול בעלילת הספיגה (לוח A). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: סביבת העבודה של דוטרו. בדוגמה זו, ערכי הפרשי הספיגה חושבו בתוכנת עיבוד HDX על-ידי חיסור ספיגת ה deuterium של המצב HalM2:AMPPNP:HalA2 מזה של מצב HalM2:AMPPNP. מטרת ההשוואה הייתה לדמיין כיצד איגוד הפפטיד (HalA2) שינה את הדינמיקה המבנית של קומפלקס HalM2:AMPPNP. ערכת הנתונים הכילה 4 נקודות זמן החלפה (0.5, 5, 30 ו- 240 דקות). הבדל הספיגה עבור כל פפטיד בכל נקודת זמן חילופי מאויר בחלקות וודס. הפפטידים הצבעוניים בחלקות וודס מצביעים על פפטידים המציגים הבדל ספיגה משמעותי, כפי שמוגדר בסטיית התקן של מדידות השכפול הקיימות בערכת הנתונים ובמגבלות הביטחון המוגדרות על-ידי המשתמש שנבחרו בדוטרוס. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: נתוני HDX-MS מנחים ניתוח פונקציונלי של איגוד פפטיד והפעלה אלוסטרית בסינתזת lanthipeptide HalM2. שינוי ספיגת דיטריום על כריכת פפטיד מבשר HalA2 לסינתיטאז Lanthipeptide HalM2 נחקר. הפרש הספיגה עבור כל פפטיד לאחר תגובת החלפה של 5 דקות מותווה (A). עלילה זו נוצרה בתוכנת עיבוד HDX. פפטידים בצבע אדום וכחול עוברים פחות ויותר ספיגת דיטריום, בהתאמה, בנוכחות הפפטיד HalA2. אלה HDX "נקודות חמות" ממופים על מודל הומולוגיה HalM2 (B, C). זיהוי פפטידים שעברו הבדלי חליפין משמעותיים נקבע בדוטרוס. סקריפט PyMOL המשמש למיפוי ערכי ההפרש למודל ההומולוגיה נוצר ב- Deuteros. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זרימת העבודה HDX-MS המוצגת בפרוטוקול זה מספקת פלטפורמה איתנה להפליא למיפוי ההתפלגות המרחבית של אלמנטים דינמיים מבנית בחלבונים ולחקור כיצד דינמיקות אלה משתנות בתגובה לטריאבינציה (קשירה ליגנד, מוטגנזיס אנזים וכו '). HDX-MS מחזיק במספר יתרונות ברורים על פני גישות ביולוגיות מבניות אחרות המשמשות בדרך כלל לחקר הדינמיקה הקונפורמית. בעיקר, רק כמויות קטנות של חלבון נדרשים. באמצעות זרימת העבודה המתוארת במסמך זה, מדגם של 1 מ"ל של חלבון μM אחד מספק מספיק חומר לתגובות HDX משולשות שכל אחת מהן מכילה 5 נקודות זמן החלפה. יתר על כן, אין כמעט מגבלת גודל על החלבון של עניין, קומפלקסים חלבון נוחים באותה מידה לגישה HDX-MS. מגבלת הגודל מוגבלת רק על ידי המידה שבה פפטידים פפטיים ניתן לפתור כרומטוגרפית, ובממדי ניידות m /z ו ion. לכן, עבור מתחמי חלבונים/חלבונים רבים, HDX-MS יספק מידע רב ערך על ממשקי אינטראקציה בין חלבונים לחלבון, אתרי קשירה ליגנד, דינמיקה קונפורמטיבית ורשתות אלוסטריות. לבסוף, תגובת HDX מבוצעת בתנאים עדינים וכמעט מקוריים ללא צורך בתיוג/הנדסה ספציפיים לאתר של החלבון, מה שאמור לסייע להבטיח שהפעילות האנדוגנית תישמר. המגבלה העיקרית של הגישה (במונחים של המידע המכניסטי שהיא מספקת על החלבון המעניין) היא שנתוני HDX ברמת הפפטיד הם ברזולוציה מרחבית נמוכה מטבעה. לפיכך, הנתונים מספיקים כדי להסיק כי מתרחש שינוי במבנה המשני, אך ההשפעות המכניסטיות של ההפרעה המבנית דורשות רזולוציה גבוהה יותר (למשל, NMR, cryoEM או גביש רנטגן), מחקרי חישוב ו/או מחקרים ביוכימיים כדי לפרש באופן מלא.

על מנת להבטיח את הרבייה והאמינות של התוצאות, יש לזכור מספר היבטים קריטיים של הפרוטוקול. ראשית, היקף חילופי דיטריום במהלך תגובת HDX והיקף חילופי הגב במהלך העבודה והניתוח תלויים מאוד ב- pH, זמן וטמפרטורה. לכן, ההליכים להכנת מאגרים, תגובות HDX ושיטות LC-MS חייבים להיות שיטתיים ככל האפשר כדי למזער את השונות בפרמטרים פיזיים אלה על פני ערכות נתונים. במידת האפשר, תגובות HDX למצבים ביוכימיים שיש להשוות צריך להתבצע על ידי אותו חוקר באותו יום, ואת הנתונים LC-MS עבור דגימות אלה צריך להיאסף במשך ימים רצופים עם אותה אצווה של ממס. עם הזמן, גם יעילות עיכול הפפסין תקטן, ולכן היא אופטימלית לדגימות שיושוו לעיכול וניתוח בתוך חלון זמן צר יחסית - במיוחד אם עמודת הפפסין משמשת לעיכול סוגים רבים אחרים של דגימות. מומלץ לבדוק מעת לעת את יעילות העיכול של עמוד הפפסין באמצעות חלבון סטנדרטי. כדי להשיג זאת, ניתן להגדיר פרויקט תוכנה ייעודי לעיבוד HDX שבו ניתן להשוות דגימות שעוכלו לאחרונה עם דגימות ישנות יותר כדי להבטיח כי אותה קבוצה של פפטידים היעד מזוהים עם עוצמות דומות.

בעוד שזרימת העבודה המוצגת בפרוטוקול זה אמורה לספק נתונים נאותים עבור מערכות אנזימים/חלבונים רבות, ישנן מספר נקודות פוטנציאליות של אופטימיזציה. ראשית, ניתן לשנות את סרגל הזמן של תגובת HDX כדי ללכוד דינמיקה מהירה יותר/איטית יותר. בעיקר, אנזימים רבים יכילו אלמנטים דינמיים מאוד כי להיות מוחלף באופן מלא בתוך מספר שניות. אם אלה אלמנטים דינמיים מאוד הם עניין, שיטות למצב יציב מראש, חילופי מתמשך HDX-MS דווחו בספרות31. שנית, ניתן לשנות בקלות את תנאי שיטת LC כדי לשנות את יעילות העיכול (אשר בסופו של דבר קובע כיסוי רצף) ואת שימור deuterium (אשר בסופו של דבר קובע את הרגישות של השיטה). בהתחשב משך וטמפרטורה של עיכול פפסין, קצב זרימה איטי יותר וטמפרטורה גבוהה יותר יעדיפו עיכול יסודי יותר של החלבון. ריכוז החלבון ב-HDX יכול גם להיות מוגבר אם עוצמת האות נמוכה מדי, או מופחתת אם עיכול הפפסין אינו יעיל מדי. בהתחשב בשיפוע האצטוניטריל המשמש להפרדת הפפטידים הפפטיים בעמודה C18 האנליטית, שיפוע מהיר יותר ישמור על תווית הדיאוטריום, אך על חשבון הרזולוציה הכרומטוגרפית של הפפטידים הפפטיים הקיימים בתערובת התגובה המתעכלת. עבור חלבונים קטנים יותר (~ 200 חומצות אמינו) שבהם פחות פפטידים פפטיים נמצאים בתקציר, שיפוע LC מהיר יותר עשוי להיות קל יותר ליישום. עבור חלבונים גדולים יותר כגון HalM2 (~ 1,000 חומצות אמינו), שיפוע ארוך יותר יש צורך לפתור את המורכבות הספקטרלית הנוספת שנוצרת על ידי מספר גדול יותר של פפטידים בתערובת. בתרחיש זה האחרון, הכללת הפרדת ניידות יון שלב גז יכול לעזור לשפר באופן דרמטי את קיבולת השיא של הניתוח. ההכללה של הפרדת ניידות היונים מגיעה במחיר של אות מעט מופחת ליחס רעש. לבסוף, יש לציין כי אין צורך לאסוף את נתוני MS עבור דגימות HDX במצב MSE. חלק MSMS של מחזור החובה MSE (כלומר, מקטע אנרגיית התנגשות גבוהה, שלב 3.3.7.2) נדרש רק עבור דגימות הייחוס כדי להגדיר את רשימת הפפטיד (סעיף פרוטוקול 4). לכן, דגימות HDX יש לנתח במצב MS בלבד כדי להגדיל את האות:יחס רעש.

אם זרימת העבודה המתוארת בפרוטוקול זה פועלת כראוי, פפטידים להחלפה מלאה צריכים להציג ערך ספיגת דיטריום יחסי של 60%-70%. אם ספיגת deuterium נמצאה נמוכה משמעותית מזה (עבור פפטיד חשוף ממס, לא מוגן), ההסבר הסביר ביותר הוא כי ה- pH של המדגם משתנה במהלך חלק כלשהו של הבדיקה / ניתוח. בתרחיש זה, אלקטרודה microtip יש להשתמש כדי לפקח בזהירות על ה- pH של ה-HDX assay ושל aliquot תגובה מרווה. יש לבדוק גם את רמת ה- pH של ממיסים LC-MS. כדי למזער את התרחשותה של בעיה זו, מומלץ מאוד להכין ולאחסן פתרונות מלאי מרוכזים של כל המאגרים והריאגנטים הדרושים לבדיקה (כמתואר בסעיף פרוטוקול 1).

בשנים האחרונות, HDX-MS התפתח ככלי אנליטי רב עוצמה לחקור דינמיקה מבנית של חלבונים. הפיתוח של מערכות LC-MS הזמינות מסחרית שתוכננו וממוטבות לניסויים HDX (כגון המערכת המשמשת במחקר זה ומפורטת בחומרים) יחד עם חבילות תוכנה רבות עוצמה, הרחיב את גישת HDX-MS למעבדות אקדמיות ותעשייתיות רבות, והפך את מה שהיה פעם טכניקת נישה לפני 15 שנה לפלטפורמה אנליטית ידידותית יותר למשתמש. למרות המגבלות ברזולוציה המרחבית, HDX-MS מספק מדידות כמותיות ושחזוריות מאוד בתנועות חלבון ומתאים באופן אידיאלי לחקר אנזימים דינמיים קונפורמיים שקשה לחקור בגישות אחרות. בשל מאפיינים אלה, HDX-MS ממלא נישה חיונית בביולוגיה המבנית של מערכות חלבון מופרעות ודינמיות שיש להן רלוונטיות בתחומים בסיסיים רבים של ביולוגיה ורפואה. לפיכך, ניתוחי HDX-MS צפויים להישאר כלי חשוב בארסנל של הביולוג המבני בעתיד הנראה לעין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה לחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה, פונדס דה Recherche du Quebec Nature et Technologie, הקרן הקנדית לחדשנות, וקרנות הזימון של אוניברסיטת מקגיל.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) BioBasic NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) Milipore Sigma UFC501096
acetonitrile Fisher A955-1
AMP-PNP SIGMA A2647-25MG
ATP SIGMA a2383-5G
D2O ALDRICH 435767-100G
formic acid Thermo Fisher 28905
guanidine-HCl VWR 97063-764
HEPES Fisher BP310-1
Magnesium chloride SiGMA-Aldrich 63068-250G
Potassium chloride BioBasic PB0440
potassium phosphate BioBasic PB0445
TCEP Hydrochloride TRC Canada T012500 peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
software
Deuteros Andy M C Lau, et al version 1.08
DynamX Waters version 3.0
MassLynx Waters version 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		 Waters version 3.0.3
PyMOL Schrödinger version 2.2.2
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column Waters 186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column Waters 186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System Waters
HDX Manager Waters
microtip pH electrode Thermo Fisher 13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn Waters 186007233
Waters Synapt G2-Si Waters

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224 (2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214 (1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522 (1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883 (2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).
  30. Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

Tags

ביוכימיה גיליון 159 ספקטרומטריית מסה חילופי מימן-דיטריום ביוכימיה אנזימולוגיה ביוסינתזה מוצרים טבעיים פפטידים
פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A… More

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes. J. Vis. Exp. (159), e61053, doi:10.3791/61053 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter