Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Uma plataforma de espectrometria de massa de troca de hidrogênio (HDX-MS) para investigar enzimas biossintéticas de peptídeos

Published: May 4, 2020 doi: 10.3791/61053
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, McGill University

Summary

As sintetizações lanthipeptide catalisam reações multistep durante a biossíntese de produtos naturais de peptídeos. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho contínuo, de baixo para cima, de espectrometria de massa de troca de hidrogênio -deutério (HDX-MS) que pode ser empregado para estudar a dinâmica conformacional das sintetizações de lanthipeptídeo, bem como outras enzimas semelhantes envolvidas na biossíntese de produtos naturais peptídeos.

Abstract

Espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério (HDX-MS) é um método poderoso para a caracterização biofísica de alterações conformacionais enzimáticos e interações entre enzimas enzimistas. Entre seus muitos benefícios, o HDX-MS consome apenas pequenas quantidades de material, pode ser realizado em condições próximas de nativos sem a necessidade de rotulagem enzimada/substrato, e pode fornecer informações espacialmente resolvidas sobre a dinâmica conformacional enzimático– mesmo para grandes enzimas e complexos multiproteínas. O método é iniciado pela diluição da enzima de interesse em tampão preparado em D2O. Isso desencadeia a troca de protium em peptídeos (N-H) com deutério (N-D). Nos pontos de tempo de troca desejados, as alíquotas de reação são saciadas, a enzima é proteolisada em peptídeos, os peptídeos são separados por cromatografia líquida de ultra-desempenho (UPLC), e a mudança na massa de cada peptídeo (devido à troca de hidrogênio por deutério) é registrada pela MS. A quantidade de absorção de deutério por cada peptídeo depende fortemente do ambiente local de ligação de hidrogênio desse peptídeo. Peptídeos presentes em regiões muito dinâmicas do deutério de troca de enzimas muito rapidamente, enquanto peptídeos derivados de regiões bem ordenadas passam por troca muito mais lentamente. Desta forma, a taxa HDX relata a dinâmica conformacional da enzima local. Perturbações aos níveis de absorção de deutério na presença de diferentes ligantes podem então ser usadas para mapear sites de ligação de ligantes, identificar redes alusicais e entender o papel da dinâmica conformacional na função enzimática. Aqui, ilustramos como usamos o HDX-MS para entender melhor a biossíntese de um tipo de peptídeos naturais chamados lanthipeptides. Lanthipeptídeos são peptídeos geneticamente codificados que são modificados pós-translacionalmente por enzimas grandes, multifuncionais e conformacionalmente dinâmicas que são difíceis de estudar com abordagens tradicionais de biologia estrutural. O HDX-MS fornece uma plataforma ideal e adaptável para investigar as propriedades mecanicistas desses tipos de enzimas.

Introduction

Proteínas são moléculas estruturalmente dinâmicas que amostram diferentes conformações em escalas de tempo que vão desde vibração de ligação em escala femtosegundo até rearranjos de domínios proteicos inteiros que podem ocorrer ao longo de muitos segundos1. Estas flutuações conformais são frequentemente aspectos críticos da função enzima/proteína. Por exemplo, alterações conformais induzidas pela ligação de ligasão são muitas vezes criticamente importantes para a modulação da função enzimática, seja organizando resíduos ativos do local necessários para a catálise, definindo locais de ligação de substrato em mecanismos cinéticos sequenciais, protegendo intermediários reativos do ambiente ou modulando a função enzimática através de redes alostêmicas. Estudos recentes também mostraram que a dinâmica conformacional pode ser conservada ao longo da evolução e que perturbações a movimentos moleculares conservados podem ser correlacionadas com mudanças na especificidade do substrato e no surgimento de novas funções enzimárias2,3.

Nos últimos anos, a espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério (HDX-MS) tem emergido rapidamente como uma técnica poderosa para sondar como as paisagens conformais da proteína respondem a perturbações como ligadura ou mutagênese4,5,6,7. Em um experimento típico hdx-ms(Figura 1), uma proteína de interesse é colocada em tampão preparado em D2O, que desencadeia a substituição de prótons trocaveis de solventes por deuteria. A taxa de troca da moiety amida dos títulos de peptídeo depende fortemente do pH, da sequência local de aminoácidos, e do ambiente estrutural local da amida8. Amidas que estão engajadas em interações de ligação de hidrogênio (como as presentes em α-helices e β-folhas) trocam mais lentamente do que em meios em regiões não estruturadas da proteína que são expostas a solventes a granel. Assim, a extensão da captação do deutério é um reflexo da estrutura da enzima. Enzimas que são conformamente dinâmicas, ou que passam por transições estruturais sobre ligação ligante, seriam esperadas para produzir uma resposta HDX mensurável.

A base mecanicista para a taxa de câmbio lenta de uma amida estruturada é mostrada na Figura 25,8,9. Para se submeter ao HDX, a região estruturada deve primeiro amostrar transitoriamente uma conformação desdobrada, de tal forma que as moléculas de solvente que catalisam a troca de HDX através de um mecanismo químico ácido/base específico, tenham acesso ao amide tromável. Em última análise, as magnitudes relativas da taxa de câmbio química (kchem) e as taxas de dobra e reagem(kopen e kclose) determinam a taxa HDX medida no experimento5,8. A partir deste modelo cinético simples, é claro que a extensão da absorção do deutério refletirá a dinâmica conformacional subjacente (definida por kopen e kclose). A maioria dos experimentos HDX-MS são realizados em um fluxo de trabalho de baixo para cima onde, após a reação de troca, a proteína de interesse é digerida em peptídeos e a absorção do deutério por cada peptídeo é medida como um aumento na massa7. Dessa forma, o HDX-MS permite que perturbações para a dinâmica conformacional enzimária sejam mapeadas na escala espacial local dos peptídeos, permitindo que o pesquisador avalie como a perturbação altera a dinâmica em diferentes regiões da enzima de interesse.

As vantagens da abordagem HDX-MS para a dinâmica estrutural proteica elucidação são inúmeras. Em primeiro lugar, o método pode ser realizado com pequenas quantidades de proteína nativa ou em complexos proteicos em sistemas com estrutura quaternária10. Não é mesmo necessário que a preparação da enzima usada no ensaio seja altamente purificada11,12, desde que o fluxo de trabalho HDX-MS de baixo para cima forneça um número suficiente de peptídeos confiantemente identificados que cobrem a sequência proteica de interesse. Além disso, o HDX-MS pode fornecer informações sobre a dinâmica conformacional em condições próximas de nativos sem a necessidade de rotulagem de proteínas específicas do local, como seria usado em estudos de fluorescência de moléculas únicas13, e não há limite de tamanho para o complexo proteico ou proteico que possa ser investigado (o que torna desafiadoras abordagens como ressonância magnética nuclear [NMR] espectroscopia)7,14. Finalmente, métodos HDX-MS resolvidos pelo tempo podem ser empregados para estudar proteínas intrinsecamente desordenadas, que são difíceis de estudar com cristalografia de raios-X15,16,17,18. A principal limitação do HDX-MS é que os dados são de baixa resolução estrutural. Os dados HDX-MS são úteis para apontar para onde a dinâmica conformacional está mudando e para revelar alterações conformais acopláveis, mas muitas vezes não fornecem muita visão do mecanismo molecular preciso que conduz a mudança observada. Avanços recentes na combinação de métodos de dissociação de captura de elétrons com dados de proteína HDX-MS mostraram-se promissores para mapear locais de troca para resíduos de aminoácidosúnicos 19,mas estudos bioquímicos e estruturais de acompanhamento ainda são frequentemente necessários para fornecer clareza aos modelos estruturais encaminhados pelos dados hdx-MS.

Abaixo, um protocolo detalhado para o desenvolvimento de um ensaio HDX-MS é apresentado20. Os protocolos de preparação da amostra apresentados abaixo devem ser geralmente aplicáveis a qualquer proteína que exaque boa solubilidade em tampões aquosos. Métodos de preparação de amostras mais especializados e fluxos de trabalho HDX-MS estão disponíveis para proteínas do que precisam ser avaliados na presença de detergentes ou fosfolipídios21,22,23,24. As configurações instrumentais para a coleta de dados HDX-MS são descritas para um espectrômetro de massa quadrúpole de alta resolução acoplado ao sistema de cromatografia líquida. Dados de complexidade e resolução semelhantes poderiam ser coletados em qualquer um dos vários sistemas de espectrometria de massa líquida (LC-MS) disponíveis comercialmente. Aspectos-chave do processamento de dados usando um pacote de software comercialmente disponível também são fornecidos. Também apresentamos diretrizes para coleta e análise de dados que são consistentes com as recomendações feitas pela comunidade HDX-MS mais ampla12. O protocolo descrito é usado para estudar as propriedades estruturais dinâmicas do HalM2, uma sintetização lanthipeptide que catalisa a maturação multistep de um produto natural de peptídeo antimicrobiano20. Ilustramos como o HDX-MS pode ser usado para revelar sites de ligação de substratos e propriedades alotésicas que iludiram a caracterização anterior. Vários outros protocolos sobre proteína HDX-MS foram publicados nos últimos anos25,26. Juntamente com o presente trabalho, essas contribuições anteriores devem proporcionar ao leitor alguma flexibilidade no design experimental.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparação de reagentes deuterados e soluções de estoque de enzimas

  1. Prepare os reagentes necessários para as reações HDX (incluindo quaisquer buffers, sais, substratos, ligantes, etc.) como soluções de estoque concentradas de 100-200x em D2O (99,9% fração de átomo D). Prepare pelo menos 50 mL de solução de estoque tampão.
    NOTA: Para caracterização do HalM2, foram preparadas as seguintes soluções: 500 mM MgCl2, 100 mM tris (2 carboxyethyl)fospfina (TCEP), ATP de 750 mM (em tampão HEPES), 800 mM HEPES pD 7.1, 500 μM HalA2 e 500 mM AMPP.
  2. Congele e liofilize as soluções de estoque para o ressecamento.
  3. Ressulimação em D2O, e ciclo de liofilização repetido pelo menos um tempo adicional para substituir o maior número possível de prótons trocaveis por deuterons.
  4. Ajuste o pD do estoque tampão HEPES desuterado ao valor desejado com NaOD/DCl concentrado, tendo em mente a seguinte relação27:
    Equation 1
    NOTA: A taxa de AMIDE HDX é fortemente dependente do pL da solução (pL = pH ou pD)5. Diferentes lotes de soluções de estoque tampão precisam ser preparados, armazenados e usados de forma idêntica para evitar uma leve deriva de pL entre os experimentos.
  5. Calcule a quantidade de cada reagente necessário para um ensaio HDX de 300 μL e armazene como alíquotas de uso único a -80 °C.
  6. Prepare uma solução concentrada de estoque de enzimas (~100-200 μM) em um tampão de armazenamento de enzimas protiado usando um filtro centrífuga(Tabela de Materiais) ou dispositivo equivalente.
    NOTA: O tampão exato e o corte de peso molecular do filtro centrífuga dependerão da proteína/enzima de interesse. O HalM2 é armazenado em HEPES de 50 mM, pH 7,5, 100 mM KCl e 10% glicerol. Foram utilizados filtros de 10 kDa para preparar a enzima concentrada.
  7. Aliquotar a enzima em porções de uso único e armazenar a -80 °C.
    NOTA: Este pode ser um ponto de parada. Todas as soluções de estoque descritas na seção 1 podem ser preparadas antes das reações HDX. Se armazenado a -80 °C, a maioria das enzimas/soluções de estoque desuterados ficará estável por muitos meses.

2. Calibração do volume de saciecia HDX

  1. Prepare uma reação HDX de 300 μL em D2O usando os reagentes deuterados e estoques concentrados de enzimas preparados na seção 1.
    1. Use uma concentração enzimática final de 1-5 μM.
    2. Use uma concentração final de buffer HEPES desuterada de pelo menos 50-100 mM.
    3. Certifique-se de que as concentrações de outros componentes são suficientes para manter a atividade/função da enzima desejada.
  2. Prepare 1 L de solução de sátdia HDX (fosfato de 100 mM, 0,8 M guanidine-HCl, pH 1.9). Congele e armazene em ambas as porções de 50 mL (para estoque de longo prazo) e 1 mL (para alíquotas de uso único).
    NOTA: A composição exata do tampão de saciamento dependerá da enzima que é usada na etapa de proteólise do fluxo de trabalho HDX-MS de baixo para cima (etapa 3.3.3). O tampão de sumosa dado aqui é compatível com pepsina, o protease mais usado para HDX-MS. Se for usada uma protease diferente, verifique com o fornecedor protease para garantir a compatibilidade com o buffer.
  3. Calibrar o volume de tampão de sutura necessário para ajustar o pL final da mistura de reação HDX saciada a um valor de leitura do medidor de pH de 2,3.
    NOTA: A taxa de câmbio H/D solvente do vínculo peptídeo amide N-H é um processo dependente de pH que está sujeito tanto à catalise ácido quanto à base-catálise. A taxa de câmbio mínima ocorre a um valor de pH 2,5 (leitura do medidor de pH = 2,3 para uma mistura de 50:50 H2O:D2O). Assim, um valor de pL final perto de 2,5 minimizará a troca de recuo de hidrogênio que ocorre durante a análise de LC-MS de baixo para cima, preservando assim o rótulo de deutério nos peptídeos.
    1. Misture 50 μL da mistura de reação HDX da etapa 2.1 com 50 μL de tampão de saciar e meça o pL da mistura saciada com um eletrodo de micropéia.
    2. Aumente o volume da solução de saciar conforme necessário para ajustar a leitura final do medidor de pH a um valor de 2,3.
    3. Uma vez determinado o volume de saciamento apropriado, repita o processo de saciamento várias vezes usando alíquotas frescas de 50 μL da reação HDX (etapa 2.1) para garantir que um pL final consistente seja alcançado após a adição de uma quantidade fixa de tampão de saciamento.

3. Elaboração de amostras de referência e otimização do fluxo de trabalho LC-MS de baixo para cima

  1. Prepare amostras de referência não deuteradas para a proteína de interesse em triplicado em tubos de 0,5 mL. Certifique-se de que as condições finais da mistura de reação são idênticas às usadas nas autênticas reações HDX (etapa 2.1), exceto que as reações são preparadas em H2O usando soluções de estoque de reagente também preparadas em H2O.
  2. Sacie as amostras como na etapa 2.3 adicionando o volume apropriado de tampão de saciar para ajustar o pH final para 2,5. O flash congele as amostras em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C até ficar pronto para análise.
  3. Analise as amostras de referência de enzimas protiadas usando um fluxo de trabalho LC-MS de baixo para cima.
    NOTA: Antes de executar estas etapas, o sistema LC-MS a ser utilizado para aquisição de dados deve ser devidamente calibrado e pronto para uso. O tempo e a temperatura de todas as etapas do fluxo de trabalho LC-MS inferior para cima devem ser rigorosamente controlados, a fim de minimizar as diferenças na troca de volta entre as amostras. Com a instrumentação MS utilizada neste protocolo (Tabela de Materiais e Informações de suporte), a maioria das etapas pode ser controlada através do software de instrumentos. Para garantir a coleta de réplicas precisas, recomenda-se automatizar o maior número possível de etapas no fluxo de trabalho.
    1. Remova uma amostra de referência de enzima individual (preparada como na etapa 3.2) do congelador e descongele a 37 °C por 1 min em banho-maria.
    2. Precisamente 2 minutos após a remoção da amostra do congelador e do descongelamento, injete uma porção de 40 μL da amostra de referência saciada em uma coluna de cromatografia líquida de ultra-desempenho (UPLC) (2,1 x 30 mm, 300 Å, 5 μM) contendo uma fase estacionária funcionalizada com pepsina (protease ácido-estável).
    3. Digerir a amostra a uma taxa de fluxo de 100 μL/min por 3 min a 15 °C usando ácido fórmico de 0,1% em H2O (pH = 2,5) como solvente.
    4. Colete os peptídeos peptic enquanto se eluem da coluna pepsina em uma coluna de armadilha C18 mantida a 0,4 °C para minimizar a troca de costas.
    5. Passe os peptídeos péticos dessatados da coluna armadilha para uma coluna analítica C18 (1 mm x 100 mm, 1,7 μM, 130 Å) realizada e operada a 0,4 °C para separação dos peptídeos pepéticos.
      NOTA: As etapas 3.3.3-3.3.5 podem ser automatizadas por certos sistemas LC-MS usados para aquisição de dados HDX-MS. Alternativamente, essas etapas podem ser executadas de forma independente, tendo em mente que o tempo e a temperatura de cada etapa precisam ser cuidadosamente controlados para alcançar uma troca traseira consistentemente baixa.
    6. Elute a coluna C18 com um sistema de solvente de ácido fórmico/acetonitrilo/água/0,1% paramórico. Otimize o gradiente LC para a proteína de interesse, a fim de maximizar a separação e preservar o rótulo de deutério nos peptídeos pepticos.
      NOTA: Os detalhes de elução de gradiente são fornecidos nas informações de suporte.
    7. Sujeito o digestor peptic à espectrometria de massa de eletroprai (ESI).
      NOTA: As condições de origem fornecidas nas Informações de Suporte fornecerão ionização suficiente para a maioria dos peptídeos pepticos.
      1. Uma vez ionizado no instrumento MS, realize uma separação de mobilidade de íons de fase gasosa usando nitrogênio como gás tampão para melhorar a capacidade máxima do método.
      2. Após a separação da mobilidade de íons, sujeitos aos íons precursores do peptídeos a um fluxo de trabalho MSE envolvendo ciclos alternados de baixa energia de colisão (4 V) e alta energia de colisão (21-40 V).
        NOTA: Os regimes alternados de energia de baixa e alta colisão permitem a coleta de dados de MS (baixa energia de colisão) simultaneamente com dados MSMS (alta energia de colisão). Isso, por sua vez, permite a correlação temporal dos íons precursores com seus respectivos íons fragmentado. Esta correlação é essencial para a identificação confiante de peptídeos descritas na seção 4.
      3. Detecte o precursor do peptídeo e íons fragmentado usando um analisador de massa com um poder de resolução de pelo menos 20.000.
      4. Simultaneamente à aquisição de dados, adquira dados MS para um padrão externo [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib).
        NOTA: O fluxo de trabalho MS descrito na etapa 3.3.7 é referido como um protocolo MSE. Configurações instrumentais completas para um protocolo MSE adequado para HDX-MS de baixo para cima são fornecidas nas Informações de Suporte.
    8. Avalie a qualidade dos dados LC-MS.
      NOTA: Utilizando o protocolo descrito acima e as configurações instrumentais fornecidas nas Informações de Suporte,as amostras de referência devem produzir um cromatógrafo de íon total com uma intensidade máxima de sinal de aproximadamente 1 x 108. Deve haver muitos peptídeos pepticos eluindo entre 3-9 min (Figura 3A−C).
    9. Injete 40 μL de amostras em branco (0,1% de ácido fórmico na água) para limpar a pepsina e as colunas C18 analíticas.
      NOTA: Em geral, 2-3 espaços em branco devem ser suficientes.
    10. Repetir passos 3.3.1-3.3.9 para cada uma das amostras de proteína de referência triplicada.

4. Processar os dados de referência e definir uma lista de peptídeos

  1. Analisar os dados mse brutos (etapa 3.3.7) utilizando software de proteômica(Tabela de Materiais). Usando o software de proteômica, navegue até bibliotecas | Protein Sequence Databanks para definir o banco de dados de proteínas importando a sequência de aminoácidos da proteína de interesse.
    NOTA: O objetivo desta etapa é pesquisar os dados de MS de referência para peptídeos peptídeos derivados da proteína de interesse, e utilizar os dados MSMS (adquiridos simultaneamente com os dados de MS) para validar quaisquer identificações de peptídeos putativos.
  2. Dê um nome à sequência de proteínas de interesse. Importe a sequência proteica (em formato FASTA). O software realizará uma digestão em silico da proteína do banco de dados para gerar uma lista de peptídeos que serão usados para pesquisar os dados do LC-MS.
  3. Defina os parâmetros de processamento (localizados no menu Biblioteca). Selecione Electrospray MSE como o tipo de aquisição de dados. No campo Lock Mass for Charge 2, digite 785.8426 para o m/z para o íon 2+ de [Glu-1]-fibrinopeptídeo B (GluFib) e clique no acabamento.
  4. Defina os parâmetros de fluxo de trabalho (localizados no menu Biblioteca).
    1. Selecione Electrospray MSE para o tipo de pesquisa. Sob o | de fluxo de trabalho Título de Consulta de Pesquisa de banco de dados, selecione a proteína de banco de dados criada na etapa 4.2 no campo do Databank.
    2. Altere o reagente de digestão primário para inespecífico, e limpe o campo de reagente modificador fixo segurando o botão Ctrl enquanto clica em Carbamidomethyl C.
  5. Especifique o diretório de saída navegando para opções | configuração de automação | Identidade E. Verifique as caixas para Apex 3D e Peptide 3D Output e Ion Accounting Output e e especifique o diretório desejado.
  6. Processe os dados da amostra de referência.
    1. Na barra de ferramentas esquerda do espaço de trabalho da plataforma proteômica, crie uma nova placa clicando à direita na Placa Microtiter. Destaque três poços na placa de microtítmetro (um para cada amostra de referência coletada na seção 3). Clique esquerdo em um poço, segure e arraste para três poços.
    2. Clique com o botão direito do mouse e selecione adicionar dados brutos. Na janela que aparece, navegue até o diretório contendo os três arquivos de referência da seção 3 e selecione-os ao mesmo tempo.
    3. Clique no próximo e escolha os parâmetros de processamento definidos na etapa 4.3. Clique no próximo e selecione os parâmetros de fluxo de trabalho definidos na etapa 4.4. Em seguida, clique no acabamento.
  7. Uma vez que os dados brutos, parâmetros de processamento e parâmetros de fluxo de trabalho tenham sido atribuídos a cada poço na placa, os poços parecerão azuis. Selecione os poços, clique com o botão direito do mouse e selecione processar os dados brutos mais recentes. Clique no canto inferior direito da janela para acompanhar o processamento dos dados. Uma vez que a mensagem Nenhum trabalho a ser executado aparece, o processamento é totalmente feito.
  8. Depois que o processamento dos dados estiver concluído, os poços na placa ficarão verdes. Clique com o botão direito do mouse nos poços e selecione exibir resultados do fluxo de trabalho. Uma janela separada será aberta para cada arquivo de dados de referência.
  9. Inspecione os dados para garantir que a maioria dos sinais de MS nos dados da amostra de referência foram mapeados com sucesso para peptídeos previstos a partir da digestão in-silico da proteína de interesse. Os peptídeos combinados serão coloridos de azul no espectro de saída(Figura 4). Clique duas vezes no filtro OK e verifique se a cobertura percentual é superior a 99%.
    NOTA: Após o processamento, a saída de dados será salva automaticamente com a extensão do arquivo (raw_data_file_name_IA_final_peptide) no diretório especificado na etapa 4.5.
  10. Importe a saída do software de proteômica para o software de processamento HDX(Tabela de Materiais)para limiares adicionais.
    1. Clique em Data no canto esquerdo da janela de software de processamento HDX. Clique em importar os resultados do PLGS e clique no ícone adicionar. Escolha os arquivos de dados processados a partir da etapa 4.9 navegando até o diretório apropriado.
    2. Clique em Next e especifique os seguintes parâmetros: íons consecutivos mínimos ≥ 2, erro de massa = 5 ppm e limiar de arquivo = 3. Clique no acabamento.
  11. Uma vez satisfeito com os parâmetros de limiar, salve o projeto HDX. Todos os dados HDX serão importados para este projeto para análise e exibição.
    NOTA: As amostras trocadas por deutério descritas na próxima seção precisarão ser processadas com um fluxo de trabalho LC-MS idêntico. Portanto, antes de prosseguir com os ensaios HDX (seção 5), certifique-se de que a preparação da amostra (seção 2), o fluxo de trabalho LC-MS de baixo para cima (seção 3) e os fluxos de trabalho de processamento de dados (seção 4) estejam fornecendo a reprodutibilidade desejada e a cobertura sequencial da proteína alvo. Se algum desses processos precisar ser alterado para melhorar a cobertura, é aconselhável retornar à etapa 2.1, preparar amostras de referência frescas em triplicado e repetir as seções 2-4 (enquanto faz os ajustes necessários ao protocolo) para garantir que cada peptídeo possa ser reproduzido e detectado.

5. Realização de reações HDX

  1. Prepare o espaço de trabalho para reações HDX.
    1. O tampão de saciar a linha de fundo pré-alíquota em tubos de 0,5 mL devidamente rotulados. Prepare um tubo diferente para cada ponto de tempo, cada réplica, e cada estado bioquímico a ser analisado. Use o volume apropriado de tampão de saciar a partir da etapa 2.2 necessária para ajustar a leitura final do medidor de pH de uma porção de 50 μL da reação HDX a um valor de 2,3.
    2. Centrifufique brevemente as banheiras de 0,5 mL para transferir todo o tampão de saciar para o fundo do tubo. Coloque os tubos no gelo.
    3. Encha um pequeno Dewar com nitrogênio líquido e mantenha-se adjacente ao espaço de trabalho.
  2. Prepare as reações do HDX. Certifique-se de que há volume de reação suficiente para coletar o número desejado de pontos de tempo de troca (uma alíquota de 50 μL para cada ponto de tempo desejado). Colete pelo menos 4-5 pontos de tempo acima de 3-4 ordens de magnitude em escala de tempo (por exemplo, saciar tempos de 15 s, 60 s, 300 s [5 min], 1.800 s [30 min], e 14.400 s [4h] fornecem cobertura adequada da dinâmica de troca para a maioria das enzimas).
    1. Pré-misture todos os componentes deutados (menos enzima) da etapa 1.1 em D2O.
    2. Para que cada estado bioquímico seja examinado (enzima livre, enzima + ligante, enzima + inibidor, etc.), prepare reações HDX em pelo menos triplicado.
    3. Incubar as misturas de reação em um banho de água controlado pela temperatura a 25 °C por 10 minutos antes da adição da enzima.
      NOTA: A enzima deve ser preparada como uma solução concentrada de estoque (~100-200 μM, passo 1.6) de modo a minimizar a adição de prótium no ensaio HDX.
    4. Ao adicionar a enzima a uma concentração final de 1-5 μM, inicie o temporizador. Misture cuidadosamente e rapidamente a solução usando uma pipeta de 200 μL para garantir que a enzima seja distribuída uniformemente na amostra.
    5. Nos pontos de tempo de troca desejados, remova 50 alíquotas de μL da reação HDX e misture de forma rápida e uniforme com o tampão de sada frio pré-aliquoted em um tubo de 0,5 mL.
      NOTA: Os volumes de mistura e o procedimento de mistura devem ser o mais precisos e reprodutíveis possíveis para garantir que a saciação final desejada pL de 2.3 seja alcançada rapidamente em todas as amostras. Manter o gelo de tampão de saciar ajudará a minimizar a troca de volta após a desnaturação da enzima.
    6. Imediatamente após a saciar a amostra HDX, cubra o tubo e o flash congele em nitrogênio líquido.
    7. Continue coletando pontos de tempo até que todos os ensaios estejam concluídos e, em seguida, transfira amostras para o congelador -80 °C para armazenamento.
      NOTA: Este pode ser um ponto de parada. Depois de coletar todos os pontos de tempo HDX, as amostras podem ser armazenadas a -80 °C até estarem prontas para análise de LC-MS. O ideal é que as reações do HDX triplicado sejam realizadas para todos os estados bioquímicos de interesse no mesmo dia. No mínimo, todas as reações de HDX para um determinado estado bioquímico devem ser executadas em paralelo no mesmo dia.
  3. Depois de coletar todos os pontos de tempo HDX saciados, submá-los ao fluxo de trabalho otimizado de baixo para cima LC-MS desenvolvido conforme descrito na etapa 3.3. Injete amostras de HDX em uma ordem aleatória com um número apropriado de espaços em branco entre as amostras para garantir que qualquer peptídeo seja mínimo.
    NOTA: Os dados HDX não precisam ser coletados no modo MSE. Assim, o segmento de energia de alta colisão (etapa 3.3.7.2) deve ser removido do ciclo de plantão de MS. Esta deve ser a única alteração feita no fluxo de trabalho descrito na etapa 3.3.
  4. Avalie a qualidade dos dados HDX como eles estão sendo coletados.
    1. Certifique-se de que os picos cromatográficos presentes no cromatograma de íon total das amostras de referência não deuteradas aparecem no mesmo tempo de retenção nas amostras desuteradas (como na Figura 3D−F).
    2. Certifique-se de que os espectros de massa somados em intervalos de tempo específicos de amostras de referência e deuterados mostram evidências de deuteração (ou seja, uma mudança no envelope isotópico de peptídeos individuais para valores mais elevados de m/z nas amostras desuteradas [Figura 6]).

6. Processamento de dados HDX

  1. Importe os dados HDX para o projeto HDX criado na etapa 4.11 clicando em Data | MS Arquivos na barra de ferramentas superior.
    1. Clique em Novo Estado e Nova Exposição conforme necessário para definir os estados bioquímicos (por exemplo, enzima livre, enzima + ligante, etc.) e tempos de exposição ao deutério, respectivamente, pertinentes à análise.
    2. Clique em New Raw para selecionar os arquivos de dados HDX a serem analisados. Atribua os tempos de troca apropriados e o estado bioquímico a cada arquivo de dados brutos importados.
      NOTA: Os dados podem ser importados e processados em lotes, ou todos de uma só vez. Adicionar dados ao projeto não desfazerá qualquer análise que tenha sido realizada anteriormente dentro desse projeto.
  2. Uma vez que os arquivos de dados tenham sido adicionados, clique em terminar para iniciar o processamento de dados. Após um curto atraso, o software perguntará se o usuário deseja salvar os dados antes de continuar. Clique em sim.
    NOTA: O processamento inicial pode levar até várias horas, dependendo de quantas amostras estão sendo analisadas, quantos peptídeos estão na lista final de peptídeos (etapa 4.10), do tamanho da janela cromatográfica e da frequência de aquisição espectral.
  3. Se desejar, altere os parâmetros de processamento no menu Configuração para alterar os parâmetros de pesquisa de íons. Certifique-se de empregar os mesmos parâmetros de pesquisa de íons para todos os dados em um determinado projeto.

7. Análise e visualização dos dados HDX

NOTA: Uma vez concluído o processamento inicial dos dados brutos (etapa 6.2), o software de processamento HDX terá peptídeos localizados da lista de peptídeos (gerados na etapa 4.10) em cada um dos arquivos de dados brutos analisados. Uma vez que a distribuição de isótopos para um peptídeo na lista está localizada em um arquivo de dados bruto, o software de processamento HDX representa cada isótopo com um "stick" (como na Figura 6C−E). As intensidades relativas das varas para um determinado peptídeo são então usadas para calcular a absorção do deutério em relação ao espectro de referência. Embora o software de processamento HDX faça um trabalho admirável de atribuir corretamente "sticks" à maioria dos peptídeos, uma curadoria manual significativa dos valores de absorção do deutério ainda será necessária.

  1. Analisando valores de absorção de peptídeos de deutério
    1. Selecione o primeiro peptídeo na lista de peptídeos e abra o enredo espectral empilhado no menu Vistas. Role para cima e para baixo na janela do enredo de espectro empilhado para ver o espectro de massa para o peptídeo selecionado em função do tempo de troca de deutério(Figura 7D,E).
    2. Atribuir e não assinar varas conforme necessário usando cliques do mouse para garantir que a distribuição adequada do isótopo tenha sido localizada nos dados e que cada pico de isótopos tenha sido atribuído (varas atribuídas aparecerão azuis). Clicar em qualquer um dos espectros na trama espectral empilhada(Figura 7D,E) permitirá que o usuário atribua/não se insignirá varas na janela do visualizador de dados ativos(Figura 7C).
    3. Verifique as atribuições de cada estado de carga, toggling o estado de carga no topo da janela de parcela espectral empilhada.
    4. Repetir as etapas 7.1.1-7.1.3 para cada estado bioquímico de interesse. O estado bioquímico também pode ser alternado no topo da janela do enredo espectral empilhado. Para as medidas de diferença de absorção de deutério mais precisas, certifique-se de que as varas sejam atribuídas para o mesmo conjunto de estados de carga para cada estado bioquímico.
    5. Repetir as etapas 7.1.1−7.1.4 para cada peptídeo na lista de peptídeos.
    6. Verifique o desvio padrão dos valores de absorção de deutério de peptídeos usando o mapa de cobertura.
      1. Acesse o mapa de cobertura do menu Views, que exibe cada peptídeo na lista de peptídeos mapeados ao longo da sequência de aminoácidos da proteína de interesse(Figura 8C). Colorir os peptídeos de acordo com o desvio padrão relativo (unidades de Da).
      2. Procure visualmente o mapa por peptídeos outlier com desvio de alto padrão relativo. Clique nos peptídeos outlier no mapa de cobertura para preencher as parcelas espectrais empilhadas (Figura 8B) e janela de visualização de dados(Figura 8A) com o peptídeo de destino.
      3. Usando o enredo espectral empilhado, verifique cuidadosamente se todos os estados de carga e todos os pontos de tempo do peptídeo outlier têm varas apropriadamente atribuídas.
        NOTA: Na maioria das vezes, peptídeos com grandes desvios padrão (>0.3 Da) têm picos isotópicos que não foram atribuídos adequadamente pelo software (como indicado na Figura 8B). A atribuição de quaisquer varas faltantes geralmente permitirá que o desvio padrão relativo de um peptídeo seja reduzido para <0.3 Da.
      4. Esconda o peptídeo da lista se o desvio padrão relativo não puder ser reduzido a menos de 0,3 Da.
  2. Exportar dados de diferença HDX entre dois estados bioquímicos para mapeamento em um modelo estrutural da proteína de interesse.
    1. Mostre a diferença de interesse no mapa de cobertura. Clique com o botão direito do mouse no mapa de cobertura para exportar os dados de diferença para um arquivo .csv. Exporte os dados estaduais (em formato .csv) navegando para Data | Exportar Dados estaduais na barra principal de ferramentas.
      NOTA: A formatação adequada dos dados de diferença e arquivos de dados estaduais é fornecida nas Informações de Suporte.
    2. Importar os dados de diferença, os dados estaduais e o arquivo pdb da proteína de interesse emDeuteronômes 28. Escolha o intervalo de confiança de 99%, selecione ativar a somae processe os dados.
      NOTA: O MATLAB deve ser instalado no PC para executar o Deuteronômes. O Deuteros usará as medidas de replicação no conjunto de dados para calcular o desvio padrão dos dados de absorção de cada peptídeo. Este desvio padrão será usado para definir o intervalo de confiança para troca significativa, que será exibido nas parcelas.
    3. Em Opções PyMOL, selecione a captação de exportação | exportar para gerar um script Pymol para mapear regiões de diferença cambial significativa na estrutura pdb da proteína de interesse usando o software PyMOL.
      NOTA: Usando o fluxo de trabalho descrito neste protocolo, o intervalo de confiança de 99% para uma diferença significativa de absorção de deutério para um determinado peptídeo em um único ponto de tempo é tipicamente 0,3-0,5 Da. O intervalo de confiança de 99% para a diferença somada em todos os pontos de tempo de câmbio é tipicamente de 0,7-1,0 Da.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

É necessário avaliar a qualidade da digestão proteolítica e a reprodutibilidade do fluxo de trabalho para cada conjunto de injeções amostrais. Assim, antes de realizar ensaios HDX-MS, é essencial estabelecer condições efetivas para a proteólise da proteína de interesse, para a separação de peptídeos utilizando cromatografia líquida de fase inversa e mobilidade de íons de fase de gás, e para a detecção de peptídeos utilizando EM. Para isso, as amostras de referência para a proteína de interesse (coletada na ausência de deutério) devem ser investigadas primeiro (seção 3). Os dados cromatográficos na Figura 3A-C mostram o total de cromatógramas de íons (TICs) para três amostras de referência da síntese de lanthipeptide HalM2. O TIC é a mudança dependente do tempo na soma de todas as contagens de íons em todos os valores m/z incluídos na varredura espectral em massa. Vistas mais próximas dos TICs entre 3 e 8 minutos são mostradas na Figura 3D−F. Os espectros de massa mostrados na Figura 3G−I representam uma soma de todos os espectros de massa durante um pequeno intervalo de tempo (de 5,0 a 5,1 min) de cada TIC. Atenção especial deve ser dada às seguintes características na Figura 3.

Primeiro, o grande pico perto de 9,3 min no final do gradiente representa fragmentos incompletos digeridos (e, portanto, grandes e mais hidrofóbicos) de Fragmentos halm2(Figura 3A−C). A digestão poderia ser mais eficiente reduzindo a concentração halm2, mas isso reduzirá a intensidade do sinal de peptídeo e a relação sinal:ruído. A digestão também poderia ser mais eficiente aumentando o tempo de contato (a partir de 3 min, protocolo passo 3.3.3) com a coluna pepsina. No entanto, o aumento do tempo de contato resultará em mais troca de volta. Em última análise, esses parâmetros precisam ser equilibrados para a proteína de interesse, a fim de fornecer a cobertura sequencial desejada, intensidade de sinal e retenção de deutério. Em segundo lugar, a forma e intensidade dos perfis TIC devem ser semelhantes (como na Figura 3D−F). Isso sugere que a digestão proteolítica do HalM2 é reprodutível e é de eficiência semelhante em todas as três amostras de referência. A expectativa é que uma digestão semelhante de uma amostra trocada por deutério produza o mesmo conjunto de peptídeos com tempos de retenção semelhantes. Em terceiro lugar, o espectro de massa sobre um determinado intervalo de tempo também deve ser semelhante (Figura 3G−I). Uma rápida comparação visual dos espectros de massa somados ao intervalo de tempo de 5,0-5,1 min da separação cromatográfica mostra que os sinais espectrais em massa em cada amostra são de fato muito semelhantes, fornecendo confiança de que peptídeos semelhantes estão presentes em cada amostra e estão eluvando em momentos semelhantes da coluna C18. Uma inspeção visual rápida semelhante deve ser realizada durante outros intervalos de tempo através do cromatograma.

Depois de verificar visualmente a semelhança nos dados LC-MS das amostras de referência, o software proteômica é usado para pesquisar os dados de MS em busca de peptídeos derivados da sequência de aminoácidos da proteína de interesse. Após a definição do banco de dados da sequência proteica (a sequência de aminoácidos da proteína de interesse), o processamento e os parâmetros de fluxo de trabalho descritos nas etapas do protocolo 4.2-4.4, cada amostra de referência individual é processada para detectar peptídeos peptáticos que correspondem aos peptídeos previstos derivados da proteína de interesse. Um exemplo da saída do software de proteômica para uma amostra de referência HalM2 não deuteada é mostrado na Figura 4. Atenção especial deve ser dada às seguintes características. Em primeiro lugar, qualquer sinal de MS que seja combinado a um peptídeo específico dentro da proteína de interesse de acordo com os valores definidos nos parâmetros de processamento e fluxo de trabalho será colorido azul no espectro inferior. Se uma amostra de referência for processada "com sucesso", a maioria dos sinais aparecerá azul (como é o caso dos dados na Figura 4). Além disso, no painel superior esquerdo, certifique-se de que o "Filtro OK" seja alternado para a marca de verificação verde. Quando isso for feito, as estatísticas na barra superior do painel superior direito (destacadas em azul na Figura 4) refletirão apenas os peptídeos que dão altas pontuações de confiança. Esses peptídeos apresentam baixa precisão de massa ppm, íons de fragmento múltiplos e boa correlação entre os tempos de retenção de fragmentos e íons parentais, e são considerados como identificações confiantes. Para a amostra de referência HalM2 mostrada, foram detectados 1.421 peptídeos com escores elevados, cobrindo 99,6% da sequência halm2. Cerca de 100% de cobertura de sequência deve ser atingível para a maioria das proteínas usando o fluxo de trabalho LC-MS de baixo para cima descrito na seção de protocolo 3. Além disso, estatísticas úteis adicionais para cada peptídeo são tabuladas no painel superior direito, incluindo o erro de massa, tempo de retenção precursor, o número de fragmentos (íons de produto), a lista completa de íons de fragmentos pelo nome e o tempo de deriva da mobilidade de íons. Essas informações são úteis para a interpretação dos resultados, que devem estar sempre focados nos peptídeos mais confiantes.

A lista final de peptídeos deve ser determinada por um limiar adicional no software de processamento HDX. Depois de analisar os dados de referência para gerar a lista de peptídeos (seção de protocolo 4), a saída deve ser importada para o software de processamento HDX para limiares adicionais. Os arquivos de saída serão armazenados em um diretório conforme definido na etapa 4.5 do protocolo com a extensão do arquivo "..._IA_final_peptide.csv". Ao carregar a saída no software de processamento HDX, a lista completa de peptídeos será mostrada no painel "visualização de peptídeos"(Figura 5),e o número de peptídeos, cobertura de sequência e redundância será exibido no canto inferior direito da janela. Esses valores mudarão em tempo real à medida que o limite adicional for aplicado. Depois de clicar em seguir,os valores de limiar podem ser definidos nos campos indicados. Os filtros mais críticos são o "limiar de arquivo" que requer que todos os peptídeos sejam localizados em cada uma das três amostras de referência, o "erro máximo de MH+ (ppm)" que deve ser definido como um valor <10 ppm, e "produtos mínimos consecutivos", que exige que o peptídeo gere pelo menos dois íons de fragmento consecutivos durante a fase MSMS (ou seja, alta energia de colisão) do fluxo de trabalho MSE (protocolo passo 3.3.7.2).

A limitação técnica mais significativa do ensaio HDX-MS é a troca traseira de deutério por prótium que ocorre assim que amostras trocadas por deutério são saciadas (com buffer protiado). A troca de costas continua durante a digestão protease e as porções de LC-MS do fluxo de trabalho. A troca de costas é inevitável, mas se o pH, a temperatura e o tempo de todas as etapas pós-extinção forem cuidadosamente controlados como descrito no protocolo, 60%-70% do rótulo de deutério podem ser mantidos. Por essa razão, é essencial verificar durante os estágios iniciais do desenvolvimento do ensaio que a maioria dos peptídeos estão retendo deutério. Isso pode ser alcançado rapidamente comparando os dados brutos de uma amostra deuterada com a de uma amostra de referência. Como foi feito para garantir a reprodutibilidade das amostras de referência(Figura 3),comparar os TICs das amostras de referência trocadas e não deuteradas, garantindo que as formas dos perfis se assemelham entre si. Além disso, somam os espectros de massa sobre o mesmo intervalo de tempo cromatográfico em ambas as amostras. A maioria dos peptídeos na amostra trocada por deutério deve apresentar mudanças óbvias em suas distribuições isotópicas para valores mais elevados de m/z (como na Figura 6). Esses dados indicam que uma fração substancial do rótulo de deutério está sendo mantida ao longo do curso da sacieda ácida, digestão de pepsina e coleta de dados LC-MS.

Depois de verificar se o fluxo de trabalho está fornecendo retenção suficiente de deutério, a captação de deutério precisa ser quantificada. Assim, os dados brutos para amostras trocadas por deutério são importados para o software de processamento HDX. Usando as amostras de referência e a lista de peptídeos finalizados, o software de processamento HDX localizará os peptídeos da lista de peptídeos em cada um dos arquivos de dados brutos e atribuirá "sticks" a cada um dos picos isotópicos. Nos dados representativos de HalM2 mostrados na Figura 7,as varas atribuídas com sucesso são coloridas de azul em todos os espectros. Após a atribuição de varas, o valor centroide m/z para a distribuição isotópica será determinado pelo software e usado para calcular a absorção de deutério em relação à amostra de referência não deuterada. O valor de troca de deutério para cada peptídeo deve ser verificado manualmente. Na Figura 7,o peptídeo atualmente selecionado (HIDKLTVGL, abrangendo resíduos HalM2 110-118) é mostrado no painel esquerdo do visualizador de dados principal(Figura 7A). Os outros painéis mostram dados HDX associados a este peptídeo. Clicar em qualquer peptídeo na lista de peptídeos irá preencher os outros painéis com dados HDX desse peptídeo. A Figura 7B mostra os lotes de captação de deutério para peptídeos 110-118. Este conjunto de dados contém quatro pontos de tempo de troca: 0,5, 5, 30 e 240 min (coletados em triplicado). Os dados de troca foram coletados para dois estados bioquímicos: enzima HalM2 livre (vermelho) e enzima HalM2 complexa a AMPPNP e seu peptídeo substrato HalA2 (azul). Observe a diferença significativa de absorção do deutério no peptídeo 110-118 durante todo o curso de tempo e a alta precisão das medidas de replicação (barras de erro são mostradas na trama na Figura 7B). Em geral, será obtida precisão semelhante na medição de captação para a maioria dos peptídeos, ressaltando a reprodutibilidade do fluxo de trabalho apresentado neste protocolo. Após a ligação de ligante (curva azul na Figura 7B), o laço de peptídeos na região 110-118 do HalM2 aparentemente sofre proteção significativa da troca de deutério, sugerindo que os aminoácidos na região 110-118 estão se tornando mais estruturados em ligas. Mutagênese subsequente desta região indicou um papel na ligação ao peptídeo precursor, HalA220. Também estão na Figura 7 as parcelas espectrais empilhadas para o estado HalM2(Figura 7D) e o estado halm2:AMPPNP:HalA2(Figura 7E). Nessas parcelas, o tempo de troca aumenta de baixo para cima. O aumento em massa do peptídeo 110-118 após a troca de deutério em pontos de tempo mais longos é evidente a partir da inspeção visual. Também é evidente que o peptídeo 110-118 capta mais deutério no estado HalM2(Figura 7D) do que no estado totalmente ligante(Figura 7E). Se necessário, clicar em qualquer uma das subtramas na Figura 7D ou Figura 7E,permitirá que o usuário modifique manualmente a atribuição de sticks no visualizador de dados principal(Figura 7C). Após a cessão/não-assinatura de vara, o software de processamento HDX recalculará os valores de captação do deutério, e todas as parcelas serão atualizadas em tempo real. Da mesma forma, clicar em pontos de dados individuais no painel B irá preencher o visualizador de dados no painel C para atribuição manual de vara.

Após a atribuição de varas para cada peptídeo e ponto de tempo de troca para todos os estados bioquímicos, o desvio padrão dos valores de absorção medidos deve ser verificado. Isso é mais fácil de realizar com o mapa de cobertura e enredo espectral empilhado(Figura 8). No mapa de cobertura(Figura 8C),selecione o estado e o tempo de troca de juros e selecione o desvio padrão de absorção relativa. Os peptídeos no mapa de cobertura serão coloridos de acordo com o desvio padrão no valor de absorção de deutério medido. Desta forma, será muito fácil identificar visualmente peptídeos que têm erros de isótopos. Clicar no peptídeo outlier (com desvio de alto padrão) no mapa de cobertura irá preencher o visualizador de dados principal e o gráfico de espectro empilhados com dados HDX do peptídeo outlier. As atribuições de vara para cada ponto de tempo e estado de carga podem então ser modificadas conforme necessário para corrigir o valor de absorção medido. Mais uma vez, o software de processamento HDX atualizará todos os displays de dados em tempo real à medida que as atribuições do stick forem alteradas.

Após a curadoria completa do conjunto de dados HDX, a significância da medição da diferença de absorção de deutério para cada peptídeo precisa ser considerada antes da interpretação dos dados. Utilizando uma abordagem descrita pela Engen e pelos colegas de trabalho29,estimamos um valor médio de absorção de 0,1 ± 0,1 Da para a proteína HalM2 usando o fluxo de trabalho descrito no protocoloacima 20. Esse valor é consistente com os erros relatados por outros para fluxos de trabalho HDX de câmbio contínuos semelhantes29,30. Recentemente, Politis e colegas de trabalho desenvolveram o Deuteteros, uma ferramenta de código aberto útil (implementada no MATLAB) para determinar rapidamente diferenças significativas de absorção nos conjuntos de dados HDX28. Os arquivos de entrada representativos de Deuteros ("State_Data_for_Deuteros" e "Difference_Data_for_Deuteros") estão incluídos nas Informações de Suporte. Se exportada diretamente do software de processamento HDX descrito neste protocolo(Tabela de Materiais),a diferença e os arquivos de dados estaduais terão o formato apropriado para leitura de arquivos por Deuteros. Se os dados HDX forem gerados em um sistema LC-MS diferente, os arquivos de dados semelhantes aos fornecidos nas Informações de Suporte terão que ser construídos manualmente.

O espaço de trabalho dueteros é mostrado na Figura 9. Uma vez que os dados são importados para Deuteteros, o usuário seleciona o limite de confiança desejado (>98% recomendado) e clica em Importar e Calcular. Para o mapa de dados achatado, selecione a cobertura para tipo de dados e absoluta para escala de cores. Clique em plot. Para os gráficos de madeira, selecione o filtro binário como tipo de dados, o filtro de confiança desejado e habilite a soma. Ao clicar na trama,Deuteros irá traçar todos os peptídeos a cada ponto de troca em função de sua posição na sequência de aminoácidos e seus valores de absorção de deutério. Os peptídeos que apresentarem troca significativa serão coloridos vermelho ou azul, dependendo se o peptídeo ocupa mais ou menos deutério, respectivamente, de acordo com a diferença que está sendo calculada. O valor de significância relatado em cada parcela (variando de 0,39 a 0,72 Da nos dados traçados na Figura 9) é calculado a partir dos desvios padrão das diferenças de absorção medidas para cada peptídeo conforme determinado a partir das medições de replicação presentes no conjunto de dados. Os intervalos de confiança são mostrados como barras tracejadas em cada parcela individual. Se ativado, a "Soma" simplesmente adiciona a diferença de absorção medida em cada ponto de tempo para cada peptídeo. Finalmente, para visualização dos dados de captação sobre a estrutura tridimensional da proteína de interesse, selecione a captação de exportação sob as opções pyMOL e, em seguida, exporte. Deuteros vai gerar um script PyMOL que pode ser arrastado e jogado no espaço de trabalho PyMOL contendo o arquivo pdb aberto da proteína de interesse.

O fluxo de trabalho HDX-MS apresentado neste protocolo foi usado para caracterizar as propriedades bioquímicas de uma enzima (HalM2) que catalisa uma série de modificações pós-translacionais em um peptídeo geneticamente codificado (HalA2)20. Na Figura 10,os resultados representativos do HDX-MS são mostrados para a vinculação do peptídeo precursor HalA2 ao complexo HalM2:AMP-PNP. O painel A mostra o mapa de cobertura HalM2, onde a cor indica a diferença relativa de absorção entre o estado bioquímico [HalM2:AMPPNP] e o estado [HalM2:AMPPNP:HalA2]. Deuteros foi usado para mapear essas diferenças de absorção em um modelo de ecologia da enzima HalM2 (Figura 10B,C). Peptídeos coloridos de vermelho indicam uma diminuição na absorção de deutério na ligação HalA2, sugerindo que essas regiões de HalM2 podem estar envolvidas diretamente na ligação do peptídeo precursor. Para investigar essa hipótese, foram investigadas as regiões I-III e investigadas as propriedades cinéticas das enzimas variantes. Mutações nas regiões I e III levaram a perturbações significativas na afinidade de ligação de peptídeo HalA2, sugerindo que essas regiões de HalM2 estão interagindo diretamente com o substrato peptídeo, ou são obrigadas a formar estruturas que permitam a ligação HalA2. Em contraste, a mutação da região II não teve efeito na afinidade vinculante HalA2, mas este mutante era quase desprovido de atividade catalítica. Uma explicação para este achado é que a organização da região II observada na ligação HalA2 desencadeia uma mudança conformacional que ativa a enzima. Deve-se notar que, antes deste estudo, não havia informações disponíveis no modo de ligação HalM2-HalA2 ou nas mudanças conformais catalíticamente relevantes no sistema, principalmente porque o grande tamanho e a natureza flexível tanto do HalM2 quanto do HalA2 impediram estudos estruturais. Assim, esses dados representativos sobre a sintetase de lanthipeptide HalM2 ilustram como o HDX-MS pode ser usado para localizar rapidamente regiões funcionalmente relevantes de sistemas enziméticos estruturalmente dinâmicos — mesmo na ausência de dados estruturais de alta resolução.

Figure 1
Figura 1: Uma troca contínua, fluxo de trabalho HDX-MS de baixo para cima. Consulte o texto para obter detalhes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: A taxa HDX depende da dinâmica conformacional da proteína(kopen e kclose) e da taxa dependente de pH de troca química das ligações N-H na espinha dorsal da proteína para ligações N-D(kchem). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Dados representativos da LC-MS para as amostras de referência do HalM2 triplicado. O número no canto superior direito de cada painel representa a contagem total de íons. Cada linha mostra dados para uma amostra de referência diferente. A primeira coluna(A−C)mostra o total de cromatogramas de íons (TICs). O grande pico de 9,3 min representa peptídeos grandes e não digeridos. A coluna do meio(D−F)mostra uma visão mais próxima dos TICs entre 3 e 8 minutos. Observe a boa concordância das formas dos perfis, o que indica uma mistura subjacente semelhante de sinais de peptídeos em cada amostra de referência em todo o cromatograma. A terceira coluna (G−I) mostra espectros de massa para cada amostra de referência gerada somando todos os espectros de massa registrados entre o ponto de tempo 5.0 e 5,1 min da corrida cromatográfica. A inspeção visual desses dados indica que muitos dos mesmos peptídeos estão sendo detectados em cada amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Saída de software de proteômica representativa para uma amostra de referência HalM2. O painel superior esquerdo mostra a lista completa de peptídeos peptídeos derivados do HalM2 detectados nos dados de MS. Observe que o "Filtro OK" está mostrando a marca de verificação verde. Isso filtra os dados de acordo com o escore de confiança e remove as identificações de peptídeos de baixa confiança. A barra superior do painel direito (destacada em azul) mostra estatísticas cumulativas para o conjunto de peptídeos com pontuações altas. As estatísticas mais importantes são o número de peptídeos detectados (neste caso 1.421) e a cobertura de sequência (neste caso 99,6%). Estatísticas adicionais para cada peptídeo também são mostradas no painel superior direito. Cada coluna nesta tabela de dados é classificada. O painel inferior mostra todos os sinais de MS que foram combinados com um peptídeo peptic derivado do HalM2 previsto. Observe que a maioria dos sinais de MS foram atribuídos e são coloridos de azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Limiar adicional no software de processamento HDX. A saída do software proteômico para cada uma das três amostras de referência HalM2 é importada para o software de processamento HDX (painel esquerdo). Após a importação de dados, é realizado um limiar adicional (painel direito). O campo "produtos mínimos consecutivos" refere-se a íons fragmentados gerados pelo decote de ligações de peptídeos adjacentes no peptídeo. O parâmetro "erro MH+ mínimo" permite que o usuário defina a precisão de massa aceitável, e o "limiar de arquivo" permite que o usuário restrinja peptídeos apenas aos peptídeos detectados nos três arquivos de referência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Dados representativos para uma amostra de referência HalM2 (vermelho) e uma amostra HalM2 incubada em buffer D2O por 5 min (verde). Ambas as amostras foram submetidas ao fluxo de trabalho LC-MS de baixo para cima descrito na seção de protocolo 3. A coluna esquerda mostra espectros de massa somados ao longo da janela do tempo de 6,0-6,1 min. As três colunas direitas mostram visões mais próximas do mesmo espectro de massa, onde a mudança para valores mais elevados de m/z na amostra deuterada (verde, topo) é óbvia para a maioria dos sinais de peptídeos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Captura de tela do espaço de trabalho no software de processamento HDX. (A) A lista de peptídeos derivados do HalM2 obtidas a partir da análise de amostras de referência HalM2 com o software de proteômica(Figura 3) e posterior limiar no software de processamento HDX(Figura 4). O peptídeo atualmente selecionado (HIDKLTVGL, abrangendo resíduos HalM2 110-118) é destacado em azul. (B) As curvas de absorção do deutério (em função do tempo de troca) para os dois estados bioquímicos de interesse: a enzima HalM2 livre, e a enzima HalM2 ligada ao AMPPNP e ao precursor lanthipeptide, HalA2. (C) Espectro de massa da amostra ativamente selecionada (neste caso, uma das amostras de referência HalM2 não deuteminadas). Os bastões azuis do painel C podem ser atribuídos manualmente/não atribuídos conforme necessário se não forem atribuídos adequadamente pelo software de processamento HDX durante o processamento inicial de dados. (D,E) Parcelas espectrais empilhadas para o estado HalM2(D)e o estado halm2:AMPPNP:HalA2(E). O aumento dependente do tempo na absorção do deutério é facilmente visível, assim como a diferença de absorção entre os dois estados bioquímicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Minimização do desvio padrão nos valores de absorção medidos. O mapa de cobertura do software de processamento HDX (painel C) fornece um meio conveniente para identificar rapidamente peptídeos com grandes desvios padrão em seus valores de absorção de deutério medidos. Neste caso hipotético, alguns dos picos de isótopos (varas azuis) para o peptídeo derivado halm2 que abrange resíduos 110-118 são não assinados para os 5 minutos de tempo de troca (as varas cinza no painel B). Isso está levando a um grande desvio padrão no valor de absorção do deutério medido para o ponto de tempo de troca de 5 minutos. O grande desvio padrão é facilmente óbvio da cor azul do peptídeo 110-118 no mapa de cobertura (painel C) e da dispersão do ponto de dados e grande barra de erro no gráfico de absorção (painel A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: O espaço de trabalho deuteros. Neste exemplo, os valores de diferença de absorção foram calculados no software de processamento HDX, subtraindo a absorção de deutério do estado HalM2:AMPPNP:HalA2 do estado halm2:AMPPNP. O objetivo da comparação foi visualizar como a ligação peptídeo (HalA2) alterou a dinâmica estrutural do complexo HalM2:AMPPNP. O conjunto de dados continha 4 pontos de tempo de troca (0,5, 5, 30 e 240 min). A diferença de absorção para cada peptídeo em cada ponto de troca é ilustrada nas tramas de Woods. Os peptídeos coloridos nas parcelas de Woods indicam peptídeos que apresentam uma diferença significativa de absorção, conforme definido pelo desvio padrão das medidas de replicação presentes no conjunto de dados e pelos limites de confiança definidos pelo usuário selecionados em Deuteróteros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: Os dados HDX-MS orientam a análise funcional da ligação de peptídeos e da ativação alusicana no sintetizador de lanthipeptídeo HalM2. A mudança de absorção do deutério após a ligação do peptídeo precursor HalA2 à sintetetagem de lanthipeptide HalM2 foi investigada. A diferença de absorção para cada peptídeo após uma reação de troca de 5 minutos é traçada(A). Este enredo foi gerado no software de processamento HDX. Peptídeos coloridos vermelho e azul sofrem cada vez mais captação de deutério, respectivamente, na presença do peptídeo HalA2. Esses "pontos quentes" HDX são mapeados em um modelo de homologia HalM2(B,C). A identificação de peptídeos submetidos a diferenças significativas de troca foi determinada em Deuteronômes. O script PyMOL usado para mapear os valores de diferença no modelo de homologia foi gerado em Deuteronômes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O fluxo de trabalho HDX-MS apresentado neste protocolo fornece uma plataforma notavelmente robusta para mapear a distribuição espacial de elementos estruturalmente dinâmicos em proteínas e para investigar como essas dinâmicas mudam em resposta à perturbação (ligação de ligante, mutagênese enzimática, etc.). O HDX-MS possui várias vantagens distintas sobre outras abordagens de biologia estrutural que são comumente usadas para investigar a dinâmica conformacional. Mais notavelmente, apenas pequenas quantidades de proteína são necessárias. Usando o fluxo de trabalho descrito aqui, uma amostra de 1 mL de proteína de 1 μM fornece material suficiente para reações de HDX triplicado cada uma contendo 5 pontos de tempo de troca. Além disso, praticamente não há limite de tamanho na proteína de interesse, e os complexos proteicos são igualmente favoráveis à abordagem HDX-MS. O limite de tamanho só é restrito na medida em que os peptídeos pepáticos podem ser resolvidos cromatograficamente, e nas dimensões de mobilidade m/z e íon. Assim, para muitos complexos proteicos/proteínas, o HDX-MS fornecerá informações valiosas sobre interfaces de interação proteína-proteína, sítios de ligação ligante, dinâmica conformacional e redes aterotéricas. Finalmente, a reação HDX é realizada em condições suaves e quase nativas sem a necessidade de rotulagem/engenharia específica do local da proteína, o que deve ajudar a garantir que a atividade endógena seja preservada. A principal limitação da abordagem (em termos das informações mecanicistas que fornece sobre a proteína de interesse) é que os dados hdX do nível de peptídeo são de resolução espacial inerentemente baixa. Assim, os dados são suficientes para inferir que uma mudança na estrutura secundária está ocorrendo, mas os impactos mecanicistas da perturbação estrutural exigem estruturas de maior resolução (por exemplo, NMR, crioEM ou cristal de raios-X), estudos de computação e/ou estudos bioquímicos para interpretar plenamente.

Para garantir a reprodutibilidade e a confiabilidade dos resultados, vários aspectos críticos do protocolo devem ser mantidos em mente. Primeiro, a extensão da troca de deutério durante a reação HDX e a extensão da troca traseira durante o trabalho e análise são fortemente dependentes do pH, tempo e temperatura. Assim, os procedimentos para a preparação de buffers, reações HDX e métodos LC-MS devem ser o mais sistemáticos possível para minimizar a variação desses parâmetros físicos em conjuntos de dados. Sempre que possível, as reações de HDX para estados bioquímicos a serem comparados devem ser realizadas pelo mesmo pesquisador no mesmo dia, e os dados de LC-MS para essas amostras devem ser coletados ao longo de dias consecutivos com o mesmo lote de solvente. Com o tempo, a eficiência da digestão da pepsina também diminuirá, por isso é ideal para amostras que serão comparadas a serem digeridas e analisadas dentro de uma janela de tempo relativamente estreita – especialmente se a coluna pepsina estiver sendo usada para digerir muitos outros tipos de amostras. É uma boa prática verificar periodicamente a eficiência de digestão da coluna pepsina usando uma proteína padrão. Para isso, um projeto de software dedicado de processamento HDX pode ser criado onde amostras recém-digeridas podem ser comparadas com amostras mais antigas para garantir que o mesmo conjunto de peptídeos-alvo sejam detectados com intensidades semelhantes.

Embora o fluxo de trabalho apresentado neste protocolo deva fornecer dados adequados para muitos sistemas de enzimas/proteínas, existem vários pontos potenciais de otimização. Primeiro, a escala de tempo da reação HDX pode ser modificada para capturar dinâmicas mais rápidas/lentas. Mais notavelmente, muitas enzimas conterão elementos altamente dinâmicos que se tornam totalmente trocados em vários segundos. Se esses elementos extremamente dinâmicos são de interesse, métodos para estado pré-estável, troca contínua HDX-MS foram relatados na literatura31. Em segundo lugar, as condições do método LC podem ser prontamente alteradas para alterar a eficiência de digestão (que em última análise determina a cobertura sequencial) e a retenção do deutério (que, em última análise, determina a sensibilidade do método). Considerando a duração e temperatura da digestão da pepsina, taxas de fluxo mais lentas e temperatura mais alta favorecerão uma digestão mais completa da proteína. A concentração de proteína no ensaio HDX também pode ser aumentada se a intensidade do sinal for muito baixa, ou diminuída se a digestão da pepsina for muito ineficiente. Considerando o gradiente de acetonitrilo usado para separar os peptídeos pepticos na coluna C18 analítico, um gradiente mais rápido preservará o rótulo de deutério, mas em detrimento da resolução cromatográfica dos peptídeos pepáticos presentes na mistura de reação digerida. Para proteínas menores (~200 aminoácidos) onde menos peptídeos pepéticos estão presentes na digestão, um gradiente LC mais rápido pode ser mais fácil de implementar. Para proteínas maiores como halm2 (~1.000 aminoácidos), um gradiente mais longo é necessário para resolver a complexidade espectral adicional gerada pelo maior número de peptídeos na mistura. Neste último cenário, a inclusão de uma separação da mobilidade de íons de fase gasosa pode ajudar a melhorar drasticamente o pico de capacidade da análise. A inclusão da separação da mobilidade de íons tem um custo de uma relação sinal ligeiramente reduzida para ruído. Finalmente, deve-se notar que os dados de MS para as amostras de HDX não precisam ser coletados no modo MSE. A porção MSMS do ciclo de plantão MSE (ou seja, o segmento de alta energia de colisão, etapa 3.3.7.2) só é necessária para as amostras de referência, a fim de definir a lista de peptídeos (seção protocolo 4). Assim, as amostras de HDX devem ser analisadas no modo MS somente para aumentar a relação sinal:ruído.

Se o fluxo de trabalho descrito neste protocolo estiver funcionando corretamente, os peptídeos de troca total devem exibir um valor relativo de absorção de deutério de 60%-70%. Se a absorção do deutério for substancialmente menor do que isso (para um peptídeo exposto e desprotegido), a explicação mais provável é que o pH da amostra esteja mudando durante alguma parte do trabalho/análise. Neste cenário, um eletrodo de micropédia deve ser usado para monitorar cuidadosamente o pH do ensaio HDX e da alíquota de reação saciada. O pH dos solventes LC-MS também deve ser verificado. Para minimizar a ocorrência deste problema, recomenda-se preparar e armazenar soluções concentradas de estoque de todos os buffers e reagentes necessários para o ensaio (conforme descrito no protocolo seção 1).

Nos últimos anos, a HDX-MS surgiu como uma poderosa ferramenta analítica para investigar a dinâmica estrutural proteica. O desenvolvimento de sistemas LC-MS comercialmente disponíveis projetados e otimizados para experimentos HDX (como o sistema usado neste estudo e listado nos materiais) juntamente com poderosos pacotes de software, ampliou a abordagem HDX-MS em muitos laboratórios acadêmicos e industriais, e transformou o que já foi uma técnica de nicho há 15 anos em uma plataforma analímola mais fácil de usar. Apesar das limitações na resolução espacial, o HDX-MS fornece medições altamente quantitativas e reprodutíveis sobre movimentos proteicos e é idealmente adequado para estudar enzimas conformais dinâmicas que são difíceis de investigar com outras abordagens. Por causa dessas características, o HDX-MS preenche um nicho essencial na biologia estrutural de sistemas proteicos desordenados e dinâmicos que têm relevância em muitas áreas fundamentais da biologia e da medicina. Como tal, espera-se que as análises do HDX-MS continuem sendo uma ferramenta importante no arsenal do biólogo estrutural para o futuro previsível.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Não temos nada para revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá, pela Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, pela Canadian Foundation for Innovation e pela McGill University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) BioBasic NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) Milipore Sigma UFC501096
acetonitrile Fisher A955-1
AMP-PNP SIGMA A2647-25MG
ATP SIGMA a2383-5G
D2O ALDRICH 435767-100G
formic acid Thermo Fisher 28905
guanidine-HCl VWR 97063-764
HEPES Fisher BP310-1
Magnesium chloride SiGMA-Aldrich 63068-250G
Potassium chloride BioBasic PB0440
potassium phosphate BioBasic PB0445
TCEP Hydrochloride TRC Canada T012500 peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
software
Deuteros Andy M C Lau, et al version 1.08
DynamX Waters version 3.0
MassLynx Waters version 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		 Waters version 3.0.3
PyMOL Schrödinger version 2.2.2
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column Waters 186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column Waters 186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System Waters
HDX Manager Waters
microtip pH electrode Thermo Fisher 13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn Waters 186007233
Waters Synapt G2-Si Waters

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224 (2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214 (1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522 (1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883 (2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).
  30. Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

Tags

Bioquímica Edição 159 Espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deuterio bioquímica enzima biossíntese produtos naturais peptídeos
Uma plataforma de espectrometria de massa de troca de hidrogênio (HDX-MS) para investigar enzimas biossintéticas de peptídeos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A… More

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes. J. Vis. Exp. (159), e61053, doi:10.3791/61053 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter