Summary
يوضح هذا البروتوكول 1) عزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية من عضلة الساق الفأر البالغة وكذلك 2) تنقية وتوصيف الإكسوسومات باستخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي جنبا إلى جنب مع تدرجات كثافة السكروز تليها تحليلات اللطخة الغربية.
Abstract
الإكسوسومات هي حويصلات صغيرة خارج الخلية تفرزها جميع الخلايا تقريبا وتفرز في جميع السوائل الحيوية. تم تطوير العديد من الطرق لعزل هذه الحويصلات ، بما في ذلك الطرد المركزي الفائق والترشيح الفائق وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. ومع ذلك ، ليست كلها مناسبة لتنقية وتوصيف exosome على نطاق واسع. يوضح هنا بروتوكول لإنشاء مزارع الخلايا الليفية الأولية المعزولة من عضلات الهيكل العظمي للفأر البالغ ، يليه تنقية وتوصيف الإكسوسومات من وسائط زراعة هذه الخلايا. تعتمد الطريقة على استخدام خطوات الطرد المركزي المتسلسلة متبوعة بتدرجات كثافة السكروز. ثم يتم التحقق من نقاء المستحضرات الخارجية من خلال تحليلات اللطخة الغربية باستخدام بطارية من العلامات الكنسية (مثل Alix و CD9 و CD81). يصف البروتوكول كيفية عزل وتركيز الإكسوسومات النشطة بيولوجيا للمجهر الإلكتروني ، وقياس الطيف الكتلي ، وتجارب الامتصاص للدراسات الوظيفية. يمكن بسهولة توسيع نطاقه أو تقليله وتكييفه لعزل الإكسوسوم من أنواع الخلايا والأنسجة والسوائل البيولوجية المختلفة.
Introduction
Exosomes هي حويصلات خارج الخلية غير متجانسة يتراوح حجمها من 30-150 نانومتر. يتم تأسيسها لاعبين رئيسيين في العمليات الفسيولوجية والمرضية ، بالنظر إلى توزيعها في كل مكان في الأنسجة والأعضاء 1,2. تحمل الإكسوسومات شحنة معقدة من البروتينات والدهون وأنواع الحمض النووي وأنواع الحمض النووي الريبي ، والتي تختلف وفقا لنوع الخلايا التي اشتقت منها1،2،3. يتم إثراء الإكسوسومات في البروتينات التي لها وظائف مختلفة (أي أن التتراسبانين ، بما في ذلك CD9 و CD63) هي المسؤولة عن أحداث الاندماج. على سبيل المثال ، تشارك بروتينات الصدمة الحرارية HSP70 و HSP90 في ربط المستضد وعرضه. بالإضافة إلى ذلك ، يشارك Alex و Tsg101 والأسطول في التكوين الحيوي للإكسوسوم وإطلاقه ويستخدم على نطاق واسع كعلامات لهذه الحويصلاتالنانوية 2،3،4.
تحتوي الإكسوسومات أيضا على مجموعة متنوعة من الحمض النووي الريبي (مثل الحمض النووي الريبي الميكروي ، والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر ، والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي) التي يمكن نقلها إلى الخلايا المتلقية ، حيث تؤثر على إشارات المصب3. نظرا لكونه محاطا بغشاء وحدة واحدة ، فإن النشاط الحيوي الخارجي لا يعتمد فقط على شحنة البروتينات والأحماض النووية ، ولكن أيضا على المكونات الدهنية للغشاء المحدد1. يتم إثراء الأغشية الخارجية بالفوسفاتيديل سيرين وحمض الفوسفاتيديك والكوليسترول والسفينغوميلين وحمض الأراكيدونيك والأحماض الدهنية الأخرى ، وكلها يمكن أن تؤثر على استقرار الإكسوسوم وطوبولوجيا الغشاء 2,3. نتيجة لترتيب الشحن والدهون ، تبدأ الإكسوسومات مسارات الإشارات في الخلايا المستقبلة وتشارك في الحفاظ على فسيولوجيا الأنسجة الطبيعية1،2،4،5. في ظل ظروف مرضية معينة (مثل التنكس العصبي والتليف والسرطان) ، فقد ثبت أنها تحفز وتنشر المحفزات المرضية4،6،7،8،9،10،11.
نظرا لقدرتها على نشر الإشارات إلى المواقع المجاورة أو البعيدة ، أصبحت exosomes مؤشرات حيوية قيمة لتشخيص أو تشخيص حالات المرض. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام exosomes تجريبيا كمركبات للمركبات العلاجية 2,12. إن التطبيق المحتمل لهذه الحويصلات النانوية في العيادة يجعل طريقة العزل ذات أهمية متزايدة من أجل تحقيق أقصى قدر من الغلة والنقاء والتكاثر. تم تطوير وتنفيذ تقنيات مختلفة لعزل الإكسوسومات. بشكل عام ، يمكن عزل الإكسوسومات من وسائط زراعة الخلايا المكيفة أو سوائل الجسم عن طريق الطرد المركزي التفاضلي ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، والتقاط المناعة (باستخدام المجموعات المتاحة تجاريا). كل نهج له مزايا وعيوب فريدة تمت مناقشتها سابقا1،2،13،14.
يركز البروتوكول المبين على 1) عزل وزراعة الخلايا الليفية الأولية من عضلة الساق الفأر البالغة و 2) تنقية وتوصيف الإكسوسومات التي تطلقها هذه الخلايا في وسط الثقافة. لا يوجد حاليا بروتوكول راسخ لعزل الإكسوسومات من الخلايا الليفية الأولية للدراسات الوظيفية. لا تفرز الخلايا الليفية الأولية كميات كبيرة من الإكسوسومات ، مما يجعل عملية العزل والتنقية صعبة. يصف هذا البروتوكول تنقية كميات كبيرة من الإكسوسومات النقية من أحجام كبيرة من الثقافة مع الحفاظ على سلامتها المورفولوجية ونشاطها الوظيفي. تم استخدام الإكسوسومات المنقاة التي تم الحصول عليها من وسط مكيف بنجاح في تجارب الامتصاص في المختبر للحث على مسارات إشارات محددة في الخلايا المتلقية. كما تم استخدامها للتحليلات البروتينية المقارنة للشحنات الخارجية من عينات بيولوجية متعددة4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات في الفئران وفقا لبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال وإرشادات المعاهد الوطنية للصحة.
1. إعداد الحلول والوسائط
- تحضير محلول الهضم عن طريق خلط 15.4 مل من PBS مع 2.5 مل من 20 مجم / مل كولاجيناز P (5 مجم / مل تركيز نهائي) ، 2 مل من 11 وحدة / مل ديسباز II (1.2 وحدة / مل تركيز نهائي) ، و 100 ميكرولتر من 1.0 M CaCl2 (تركيز نهائي 5 mM).
- تحضير 500 مل من وسط الخلايا الليفية الأولية (DMEM كاملة) عن طريق خلط 440 مل من DMEM مع 50 مل من FBS (10٪) ، 5.0 مل من القلم / البكتيريا (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل ، على التوالي) و 5.0 مل من مكمل الجلوتامين (2 مللي مول). قم بتصفية وتعقيم الوسط باستخدام مرشح فراغ بحجم المسام 0.22 ميكرومتر.
- قم بإعداد مصل خال من الإكسوسوم عن طريق الطرد المركزي الفائق ل FBS طوال الليل في أنابيب البولي بروبلين سعة 38.5 مل عند 100000 × جم عند 4 درجات مئوية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
- تحضير 500 مل من الوسط الخالي من الإكسوسوم عن طريق خلط 440 مل من DMEM مع 50 مل من المصل الخالي من الإكسوسوم (10٪) ، 5 مل من القلم / البكتيريا (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل) ، و 5 مل من مكمل الجلوتامين (2 ملليمول). قم بتصفية وتعقيم الوسط باستخدام مرشح فراغ بحجم المسام 0.22 ميكرومتر.
- تحضير 0.5 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) عن طريق إذابة 6.057 g من قاعدة Tris في 90 mL من dH 2 O وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك. اضبط مستوى الصوت على 100 مل باستخدام dH2O.
- تحضير محلول 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) / 1 mM Mg (Ac) 2 (محلول عمل السكروز) عن طريق خلط 97.9 مل من dH 2 O مع 2 مل من 0.5 M Tris-HCl (درجة الحموضة = 7.4) و 100 ميكرولتر من 1 M Mg (Ac)2. أضف مثبطات الأنزيم البروتيني إلى المحلول قبل الاستخدام مباشرة واحتفظ بالمحلول على الجليد.
- تحضير محاليل تدرج كثافة السكروز على الجليد وفقا للجدول 1. هذه المحاليل كافية لإعداد أنبوبين متدرجين للسكروز.
- تحضير 100٪ TCA عن طريق إضافة 40 مل من dH2O إلى 100 غرام من مسحوق TCA وتخلط حتى يذوب تماما. اضبط مستوى الصوت النهائي باستخدام dH2O إلى 100 mL.
- تحضير 80٪ إيثانول عن طريق خلط 20 مل من dH2O مع 80 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
- قم بإعداد المخزن المؤقت لتشغيل اللطخة الغربية عن طريق خلط 1.8 لتر من dH2O مع 200 مل من المخزن المؤقت للتشغيل 10x.
- قم بإعداد المخزن المؤقت لنقل اللطخة الغربية عن طريق خلط 1.4 لتر من dH2O مع 200 مل من محلول نقل 10x و 400 مل من الميثانول. قم بتبريد المخزن المؤقت للنقل إلى 4 درجات مئوية.
- تحضير 20x محلول ملحي مخزن تريس (TBS) عن طريق إذابة 122 جم من قاعدة تريس و 180 جم من كلوريد الصوديوم في 850 مل من dH2O (درجة الحموضة 8.0). اضبط مستوى الصوت على 1 لتر باستخدام dH2O.
- تحضير المخزن المؤقت المانع عن طريق إذابة 5 جم من الحليب الجاف الخالي من الدسم مع 1 مل من 10٪ توين -20 ، 5 مل من 20x TBS ، و 94 مل من dH2O.
- تحضير المخزن المؤقت للأجسام المضادة عن طريق إذابة 3 جم من BSA مع 1 مل من 10٪ Tween-20 ، و 5 مل من 20x TBS ، و 94 مل من dH2O.
- تحضير المخزن المؤقت للغسيل عن طريق خلط 100 مل من 20x TBS و 20 مل من 10٪ Tween-20 (10x) مع 1.88 لتر من dH2O.
- تحضير محلول تطوير عن طريق خلط 1 حجم من اللومينول / تعزيز مع حجم واحد من العازلة بيروكسيد مستقرة.
2. تشريح عضلة الفأر الساقي (GA)15,16
- تحضير أنابيب 50 مل تحتوي على 10 مل PBS على الجليد.
- القتل الرحيم للفئران في غرفة CO2 تليها خلع عنق الرحم.
- إزالة عضلة gastrocnemius من كلا الساقين ونقلها إلى الأنبوب مع برنامج تلفزيوني على الجليد.
ملاحظة: قم بإزالة العضلة الوحيدة من عضلة GA قبل نقل عضلة GA إلى PBS.
3. عزل الخلايا الليفية الأولية للفأر والثقافة
- وزن العضلات ونقلها إلى طبق 10 سم تحت غطاء السلامة الحيوية. فرم العضلات بالمشارط حتى تصبح عجينة ناعمة.
- انقل معجون العضلات المفروم ناعما إلى أنبوب سعة 50 مل وأضف 3.5x حجم / مجم من محلول الهضم إلى الأنبوب واحتضانه لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. امزج التعليق جيدا باستخدام ماصة سعة 5 مل كل 10 دقائق (سيساعد ذلك في التفكك التام).
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مفكك الأنسجة لهذه الخطوة. - أضف 20 مل من DMEM كاملة إلى تعليق الخلية لتعطيل محلول الهضم. نقل إلى مصفاة خلية نايلون 70 ميكرومتر وضعت على أنبوب 50 مل. اجمع التدفق واغسل مصفاة الخلية ب 5 مل إضافية من DMEM كاملة.
- جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق وإزالة المادة الطافية بعناية.
- أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من DMEM كاملة وزرع الخلايا في طبق 10 سم.
- استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O2 (المقطع 0 أو P0).
ملاحظة: 1) يجب الحفاظ على هذه الثقافات عند مستوى أكسجين منخفض لضمان ظروف شبيهة بالفسيولوجية (مستوى O 2 في العضلات الهيكلية حوالي2.5٪) 17. 2) رقم المرور (على سبيل المثال ، P0) لمزرعة الخلية هو سجل لعدد المرات التي تم فيها زراعة المزرعة الفرعية. 3) يتم استزراع الخلايا الليفية الأولية في P0 بشكل روتيني حتى التقاء 100٪ بالإضافة إلى يوم واحد (وفقط ل P0). هذا لتطهير أنواع أخرى من الخلايا والتأكد من أن الخلايا الموجودة في المزرعة ليست سوى خلايا ليفية ، مستنفدة من الخلايا العضلية على أساس الفحص المجهري. تحتوي العضلات الهيكلية من بالغ في عمر شهرين على حوالي 2٪ من الأسلاف العضلية4. بالإضافة إلى ذلك ، لا تعلق الأسلاف العضلية عادة على الأطباق غير المطلية ؛ لذلك ، يتم فقدها أثناء الاستزراعالفرعي 18،19،20. تتطلب الخلايا العضلية وسيطا مختلفا (F10) مكملا ب 20٪ FBS وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) 18. في DMEM الكامل ، يكون للخلايا الليفية المتوسطة معدل تكاثر أعلى من الخلايا العضلية ، مما يؤدي إلى القضاء على هذه الخلايا الملوثة قبل الممر الأول. - شطف خلايا P0 مع برنامج تلفزيوني عندما 100٪ متقاربة بالإضافة إلى 1 يوم. أضف 1 مل من محلول التربسين واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O2 لفصل الخلايا. إيقاف النشاط الأنزيمي باستخدام 10 مل من DMEM كاملة.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 10 دقائق في RT وإعادة تعليق بيليه في 20 مل من DMEM كاملة والبذور في طبق 15 سم (الممر 1 أو P1). تنمو الخلايا حتى التقاء 80٪ -90٪ ويمكن توسيعها حتى المرور 3.
ملاحظة: اعتمادا على تجارب المصب ، يمكن استخدام المقطع 1 أو المقطع 2 (P2) أو المقطع 3 (P3).
4. بذر الخلايا وجمع الوسط المشروط
- اغسل الخلايا الليفية (P1 أو P2 أو P3) ب 10 مل من PBS ، وأضف 2.5 مل من محلول التربسين إلى الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O2. إيقاف النشاط الأنزيمي باستخدام 10 مل من DMEM كاملة.
ملاحظة: بعد المرور 4 ، يتم التخلص من الخلايا الأولية ويجب عدم استخدامها لإجراء مزيد من التجارب ، لأنها تغير الخصائص. - جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام في RT لمدة 10 دقائق.
- إعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من الوسط الخالي من الإكسوسوم وعد الخلايا.
- بذر الخلايا في 1.5-2.0 × 106 خلايا لكل طبق (15 سم) واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O2.
- اجمع الوسط المكيف بين 16-24 ساعة في أنابيب سعة 50 مل على الجليد.
ملاحظة: إذا لم تكن الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ ، فيمكن إضافة وسط جديد خال من الظواهر الخارجية مرة أخرى وجمعها بعد فترة 16-24 ساعة إضافية. يمكن الجمع بين المجموعتين لمزيد من المعالجة.
5. تنقية الإكسوسومات باستخدام الطرد المركزي التفاضلي والفائق
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات عند 4 درجات مئوية أو على الجليد. وازن الأنبوب بأنبوب مملوء بالماء عند الحاجة.
- جهاز طرد مركزي الوسط المكيف عند 300 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا الحية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.
- قم بإزالة الخلايا الميتة عن طريق الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق ونقل المادة الطافية إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 38.5 مل.
- جهاز طرد مركزي للطاف عند 10000 × جم لمدة 30 دقيقة لإزالة العضيات والأجسام المبرمج وشظايا الغشاء. انقل المادة الطافية إلى أنبوب فائق الوضوح سعة 38.5 مل.
- أجهزة الطرد المركزي الفائقة الطافية عند 100000 × جم لمدة 1.5 ساعة لتكوير الإكسوسومات.
- تخلص بعناية من المادة الطافية ، واترك حوالي 1 مل من الوسط المكيف ، واغسل الحبيبات الخارجية بحجم إجمالي قدره 30 مل من برنامج تلفزيوني بارد مثلج.
- جهاز طرد مركزي عند 100000 × جم لمدة 1.5 ساعة وتخلص بعناية من المادة الطافية عن طريق السحب ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات الخارجية.
- أعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني بارد (~ 25 ميكرولتر لكل طبق 15 سم) وقم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA وقارئ الصفائح الدقيقة عند 562 نانومتر.
ملاحظة: يتم قياس تركيز البروتين بتخفيف 1: 2 مع 0.1٪ Triton-X100 في dH2O. إن ناتج الإكسوسومات من طبق 15 سم (20 مل من الوسط المكيف) من الخلايا الليفية الأولية عند التقاء 80٪ هو ~ 3-4 ميكروغرام.
6. توصيف الإكسوسومات بواسطة تدرج كثافة السكروز
- قم بتحميل تدرج السكروز في أنبوب فائق الوضوح سعة 13 مل عن طريق سحب (من الأسفل إلى الأعلى) ما يلي: 1.5 مل من 2.0 م ، 2.5 مل من 1.3 م ، 2.5 مل من 1.16 م ، 2.0 مل من 0.8 م ، و 2.0 مل من 0.5 م محاليل السكروز.
- امزج 30-100 ميكروغرام من الإكسوسومات بمحلول السكروز 0.25 متر واضبط الحجم على 1 مل.
- قم بتحميل الإكسوسومات الموجودة أعلى التدرجات بعناية وأجهزة الطرد المركزي الفائقة العينات لمدة 2.5 ساعة عند 100000 × جم و 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الفائق وضعها على الجليد واجمع 1.0 مل من الكسور بدءا من أعلى الانحدار. نقلها إلى أنابيب 1.7 مل على الجليد.
- أضف 110 ميكرولتر من TCA بنسبة 100٪ إلى كل أنبوب ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لمدة 10 دقائق في RT.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 10000 × g و RT وتخلص بعناية من المادة الطافية.
- أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من الإيثانول المبرد مسبقا بنسبة 80٪ واترك العينات تغسل لمدة 10 دقائق عند -20 درجة مئوية.
- جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 10000 × جم و 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
- جفف الحبيبات لمدة 10-15 دقيقة في RT وأعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني للتجارب في المختبر. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة بروتين BCA أو أعد تعليق الحبيبات مباشرة في 14.5 ميكرولتر من dH2O ، و 5 ميكرولتر من 4x Laemmli buffer ، و 0.5 ميكرولتر من 1 M DTT لتحليلات اللطخة الغربية.
7. الكشف عن Exosome عن طريق تحليل اللطخة الغربية
- امزج 5-10 ميكروغرام من الإكسوسومات من الخطوة 5.7 مع 5 ميكرولتر من 4x Laemmli buffer ، و 0.5 ميكرولتر من 1 M DTT ، ثم اضبط الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر مع dH2O. سخني جميع العينات ، بما في ذلك تلك الموجودة في الخطوة 6.9 ، لمدة 5 دقائق عند 98 درجة مئوية.
- قم بتحميل العينات في جل خال من البقع بنسبة 10٪ TGX وقم بتحميل سلالم البروتين وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
ملاحظة: اختر النسبة المئوية للهلام وفقا للوزن الجزيئي للبروتين محل الاهتمام. - قم بتشغيل الجل عند 100 فولت لمدة ~ 1 ساعة في تشغيل المخزن المؤقت حتى تصبح صبغة التحميل في الجزء السفلي من الجل.
ملاحظة: قد يختلف وقت التشغيل وفقا للمعدات المستخدمة أو نوع الجل ونسبته. - صورة الجل. تستخدم صور المواد الهلامية الخالية من البقع كعنصر تحكم في تحميل البقع المناعية.
- انقل الجل باستخدام غشاء PVDF لمدة 1.5 ساعة عند 80 فولت أو طوال الليل عند 30 فولت عند 4 درجات مئوية.
- سد الأغشية في سد العازلة لمدة 1 ساعة في RT.
- احتضان الأغشية لأجسام مضادة محددة (الجدول 2) في مخزن الأجسام المضادة طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع التقليب.
- غسل الأغشية في العازلة الغسيل واحتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (الجدول 2) لمدة 1 ساعة في RT مع الإثارة.
- اغسل الأغشية في المخزن المؤقت للغسيل وصور الأغشية باستخدام محلول تطوير وتصوير قائم على الكاميرا. بدلا من ذلك ، استخدم فيلم الأشعة السينية لتطوير الأغشية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول مناسب لتنقية الإكسوسومات من كميات كبيرة من الوسط المكيف بطريقة فعالة من حيث التكلفة. الإجراء قابل للتكرار للغاية ومتسقة. يوضح الشكل 1 صورة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) للإكسوسومات المنقاة من وسط زراعة الخلايا الليفية الأولية للفأر. يوضح الشكل 2 نمط التعبير البروتيني للعلامات الخارجية المتعارف عليها ، وغياب ملوثات البروتين الخلوية (LDH) و ER (calnexin). يوضح الشكل 3 توزيع العلامات الخارجية المتعارف عليها (Alix و CD9 و CD81) بعد تدرجات كثافة السكروز.
الشكل 1: صورة TEM تمثيلية للإكسوسومات المعزولة من وسط زراعة الخلايا الليفية الأولية للفأر. تظهر الأحجام المنتظمة نسبيا لهذه الحويصلات النانوية. عبر الخطوط السوداء تدل على قطر الحويصلات الفردية. شريط المقياس = 100 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: البقع المناعية لمحللات الإكسوسوم التي تم فحصها بالأجسام المضادة ضد علامات الإكسوزوم والخلايا الخلوية وعلامات ER. علامات أليكس ، CD81 ، CD9 ، فلوتيلين 1 ، سينديكان 1 ، سينتينين 1 (إكسوسوم) ، سيتوسوليك (LDH) ، و ER (كالنيكسين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الإكسوسومات مفصولة بتدرج كثافة السكروز. تم فحص الكسور الفردية على لطخة غربية بأجسام مضادة ضد Alix و CD9 و CD81. استنادا إلى نمط تجزئة العلامات ، ترسب الإكسوسومات باستمرار في الكسور 3-6 ، والتي تتوافق مع كثافات 1.096-1.140 جم / مل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| السكروز (غ) | محلول عمل السكروز (مل) | |
| 2.0 م | 2.74 | 4.0 |
| 1.3 م | 2.67 | 6.0 |
| 1.16 م | 2.38 | 6.0 |
| 0.8 م | 1.37 | 5.0 |
| 0.5 م | 0.86 | 5.0 |
| 0.25 م | 0.26 | 3.0 |
الجدول 1: محاليل تدرج كثافة السكروز.
| جسم | مضيف | شركة | رقم الكتالوج |
| سي دي 9 | جرذ | بكالوريوس العلوم البيولوجية | 553758 |
| سي دي 81 | فأر | سانتا كروز للتكنولوجيات الحيوية | SC-166029 |
| اليكس | أرنب | مختبر دازو | اليكس |
| فلوتلين1 | فأر | بكالوريوس العلوم البيولوجية | 610820 |
| سينديكان1 | أرنب | تقنيات الحياة | 36-2900 |
| سينتينين1 | أرنب | ميليبور / سيغما | AB15272 |
| LDH | ماعز | كيميكون | AB1222 |
| كالنيكسين | ماعز | سانتا كروز للتكنولوجيات الحيوية | SC-6465 |
| الجرذان-HRP | حمار | جاكسون إيم. مختبر الدقة | 112-035-003 |
| الماوس-HRP | ماعز | جاكسون إيم. مختبر الدقة | 115-035-044 |
| أرنب-HRP | ماعز | جاكسون إيم. مختبر الدقة | 111-035-144 |
الجدول 2: الأجسام المضادة الأولية والثانوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة للعزل الناجح للإكسوسومات من وسائط الاستزراع ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، في إنشاء وصيانة مزارع الخلايا الليفية الأولية للفأر من العضلات الهيكلية البالغة. يجب الحفاظ على هذه الثقافات عند مستوى أكسجين منخفض لضمان ظروف شبيهة بالفسيولوجية (مستوى O 2 في العضلات الهيكلية هو ~2.5 ٪)15. ستتغير خصائص الخلايا الليفية الأولية عند تمريرها في الثقافة عدة مرات. ومن ثم ، فإن رقم المرور المنخفض أمر ضروري للحصول على عائد خارجي مثالي. يجب استخدام الإكسوسومات المنقاة على الفور لأغراض تجريبية أو الاحتفاظ بها مجمدة في القسمة عند -80 درجة مئوية لحين الحاجة. خطوة أخرى مهمة في البروتوكول هي استخدام محاليل السكروز المحضرة طازجة في كل مرة. أحد قيود هذه الطريقة هو أنها تستغرق وقتا طويلا ، لأن الخلايا الليفية الأولية لا تفرز عموما كميات كبيرة من الإكسوسومات ، مثل الخلايا الإفرازية الأخرى. لذلك ، يجب استخدام الثقافات الكبيرة ، مما يؤدي إلى معالجة كميات كبيرة من الوسائط المكيفة.
ميزة الطرد المركزي التفاضلي المستخدم هنا هي أنه يمثل نهجا قابلا للتطوير (حتى لترات) وهو الطريقة المفضلة لعزل الإكسوسومات عن الخلايا الليفية الأولية. طريقة بديلة للأحجام الأكبر (حتى 100 مل لكل عمود) هي كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC). هذه الطريقة سريعة ويمكنها فصل البروتينات عن الإكسوسومات. لا يحتوي العمود على حبيبات exosomes ، لذلك يلزم المزيد من خطوات التركيز أو الطرد المركزي. أحد عيوب طريقة SEC هو أنه يمكن انسداد العمود بمرور الوقت وتحميله بشكل زائد. تعتمد الطرق الحالية الأخرى على استخدام كميات صغيرة من السوائل البيولوجية (مثل البول ، السائل الدماغي الشوكي ، المصل ، البلازما) والمجموعات المتاحة تجاريا. على الرغم من أن هذه المجموعات تضمن قابلية التكاثر ، إلا أنها مكلفة ولا تنتج دائما غلة عالية من الإكسوسومات النقية. البروتوكول المحدد لتنقية الإكسوسوم واضح ومباشر ويمكن تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا أو الأنسجة والأعضاء الكاملة أو السوائل البيولوجية الأخرى حسب الحاجة التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
أليساندرا دازو حاصلة على كرسي مجوهرات الأطفال (JFC) في علم الوراثة والعلاج الجيني. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01GM104981 و RO1DK095169 و CA021764 ومؤسسة أسيزي في ممفيس والجمعيات الخيرية الأمريكية اللبنانية السورية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14x89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25x89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
References
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
- Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
- van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
- Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
- Howitt, J., Hill, A. F.
- Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
- Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
- Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
- Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
- Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
- Lee, Y. S. Muscle Dissection in mouse. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016).
- Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
- Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
- Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).
