Summary
Этот протокол иллюстрирует: 1) выделение и культивирование первичных фибробластов из икроножной мышцы взрослой мыши, а также 2) очистку и характеристику экзосом с использованием метода дифференциального ультрацентрифугирования в сочетании с градиентами плотности сахарозы с последующим вестерн-блоттинг-анализом.
Abstract
Экзосомы представляют собой небольшие внеклеточные везикулы, выделяемые практически всеми клетками и секретируемые во всех биологических жидкостях. Для выделения этих везикул было разработано множество методов, включая ультрацентрифугирование, ультрафильтрацию и эксклюзионную хроматографию. Однако не все из них подходят для крупномасштабной очистки и характеризации экзосом. Изложен протокол создания культур первичных фибробластов, выделенных из скелетных мышц взрослых мышей, с последующей очисткой и характеристикой экзосом из питательных сред этих клеток. Метод основан на использовании последовательных стадий центрифугирования с последующими градиентами плотности сахарозы. Чистота экзосомальных препаратов затем подтверждается вестерн-блоттинг-анализом с использованием батареи канонических маркеров (например, Alix, CD9 и CD81). Протокол описывает, как выделять и концентрировать биоактивные экзосомы для электронной микроскопии, масс-спектрометрии и экспериментов по поглощению для функциональных исследований. Его можно легко увеличить или уменьшить и адаптировать для выделения экзосом из различных типов клеток, тканей и биологических жидкостей.
Introduction
Экзосомы представляют собой гетерогенные внеклеточные везикулы размером от 30 до 150 нм. Они являются установленными ключевыми игроками в физиологических и патологических процессах, учитывая их повсеместное распространение в тканях и органах 1,2. Экзосомы несут сложный груз белков, липидов, типов ДНК и РНК, которые различаются в зависимости от типа клеток, из которых они получены. Экзосомы обогащены белками, которые выполняют различные функции (например, тетраспанины, включая CD9 и CD63), ответственные за события слияния. Например, белки теплового шока HSP70 и HSP90 участвуют в связывании и презентации антигена. Кроме того, Alix, Tsg101 и флотиллин участвуют в биогенезе и высвобождении экзосом и широко используются в качестве маркеров этих нановезикул 2,3,4.
Экзосомы также содержат различные РНК (т.е. микроРНК, длинные некодирующие РНК, рибосомные РНК), которые могут передаваться клеткам-реципиентам, где они влияют на последующую передачу сигналов. Биоактивность экзосомы, заключенной в единую единую мембрану, зависит не только от груза белков и нуклеиновых кислот, но и от липидных компонентов лимитирующей мембраны1. Экзосомальные мембраны обогащены фосфатидилсерином, фосфатидной кислотой, холестерином, сфингомиелином, арахидоновой кислотой и другими жирными кислотами, которые могут влиять на стабильность экзосом и топологию мембраны 2,3. В результате карго- и липидного расположения экзосомы инициируют сигнальные пути в принимающих клетках и участвуют в поддержании нормальной физиологии тканей 1,2,4,5. Было показано, что при определенных патологических состояниях (например, нейродегенерации, фиброзе и раке) они запускают и распространяют патологические стимулы 4,6,7,8,9,10,11.
Благодаря своей способности распространять сигналы в соседние или отдаленные участки, экзосомы стали ценными биомаркерами для диагностики или прогнозирования заболеваний. Кроме того, экзосомы были экспериментально использованы в качестве носителей терапевтических соединений 2,12. Потенциальное применение этих нановезикул в клинике делает метод выделения все более важным для достижения максимального выхода, чистоты и воспроизводимости. Разработаны и внедрены различные методики выделения экзосом. Как правило, экзосомы могут быть выделены из кондиционированных клеточных культуральных сред или жидкостей организма с помощью дифференциального центрифугирования, эксклюзионной хроматографии и иммунного захвата (с использованием коммерчески доступных наборов). Каждый подход имеет уникальные преимущества и недостатки, которые обсуждались ранее 1,2,13,14.
Изложенный протокол фокусируется на 1) выделении и культивировании первичных фибробластов из икроножной мышцы взрослой мыши и 2) очистке и характеристике экзосом, высвобождаемых в питательную среду этими клетками. Устоявшийся протокол выделения экзосом из первичных фибробластов для функциональных исследований в настоящее время отсутствует. Первичные фибробласты не секретируют большое количество экзосом, что затрудняет процесс изоляции и очистки. Данный протокол описывает очистку больших количеств чистых экзосом от больших объемов культуры с сохранением их морфологической целостности и функциональной активности. Очищенные экзосомы, полученные из кондиционированной среды, были успешно использованы в экспериментах по захвату in vitro для индуцирования специфических сигнальных путей в клетках-реципиентах. Они также использовались для сравнительного протеомного анализа экзосомальных грузов из нескольких биологических образцов4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на мышах проводились в соответствии с протоколами для животных, одобренными Комитетом по уходу за животными и их использованию в Детской исследовательской больнице Святого Иуды и рекомендациями Национальных институтов здравоохранения.
1. Приготовление растворов и сред
- Приготовьте раствор для пищеварения, смешав 15,4 мл PBS с 2,5 мл 20 мг/мл коллагеназы P (конечная концентрация 5 мг/мл), 2 мл 11 U/мл dispase II (конечная концентрация 1,2 U/мл) и 100 мкл 1,0 М CaCl2 (конечная концентрация 5 мМ).
- Приготовьте 500 мл первичной среды фибробластов (DMEM complete), смешав 440 мл DMEM с 50 мл FBS (10%), 5,0 мл ручки/стрептококка (100 U/мл и 100 мкг/мл соответственно) и 5,0 мл глютаминовой добавки (2 мМ). Отфильтруйте-стерилизуйте среду с помощью вакуумного фильтра с размером пор 0,22 мкм.
- Готовят безэкзосомную сыворотку путем ночного ультрацентрифугирования ФБС в полипропиленовых пробирках объемом 38,5 мл при 100 000 х г при 4 °C и переносят надосадочную жидкость в новую пробирку.
- Приготовьте 500 мл среды, не содержащей экзосом, смешав 440 мл DMEM с 50 мл сыворотки без экзосом (10%), 5 мл шприц-ручки/стрептококка (100 ЕД/мл и 100 мкг/мл) и 5 мл глютаминовой добавки (2 мМ). Отфильтруйте-стерилизуйте среду с помощью вакуумного фильтра с размером пор 0,22 мкм.
- Приготовьте 0,5 М Tris-HCl (pH 7,4), растворив 6,057 г основания Tris в 90 мл dH 2 O и доведя pH до7,4 HCl. Отрегулируйте объем до 100 мл с dH2O.
- Приготовьте 10 мМ раствора Tris-HCl (pH 7,4)/1 мМ Mg(Ac)2 (рабочий раствор сахарозы), смешав 97,9 мл dH 2 O с 2 мл 0,5 M Tris-HCl (pH = 7,4) и 100 мкл 1 M Mg(Ac)2. Добавляйте ингибиторы протеазы в раствор непосредственно перед применением и держите раствор на льду.
- Готовят растворы градиента плотности сахарозы на льду в соответствии с таблицей 1. Этих растворов достаточно для приготовления двух градиентных трубок сахарозы.
- Приготовьте 100% ТСА, добавив 40 мл dH2O к 100 г порошка ТСА и перемешайте до полного растворения. Отрегулируйте окончательный объем с dH2O до 100 мл.
- Приготовьте 80% этанол, смешав 20 мл dH2Oс 80 мл 100% этанола.
- Приготовьте проточный буфер для вестерн-блоттинга, смешав 1,8 л dH2O с 200 мл 10-кратного погонного буфера.
- Приготовьте буфер для переноса вестерн-блоттинга, смешав 1,4 л dH2Oс 200 мл 10-кратного буфера для переноса и 400 мл метанола. Предварительно охладите буфер для переноса до 4 °C.
- Приготовьте 20-кратный Tris-буферный физиологический раствор (TBS), растворив 122 г основания Tris и 180 г натрия хлорида в 850 мл dH2O (pH 8,0). Отрегулируйте объем до 1 л с dH2O.
- Приготовьте блокирующий буфер, растворив 5 г обезжиренного сухого молока с 1 мл 10% Tween-20, 5 мл 20x TBS и 94 мл dH2O.
- Приготовьте буфер антител, растворив 3 г БСА с 1 мл 10% Tween-20, 5 мл 20x TBS и 94 мл dH2O.
- Приготовьте буфер для промывки, смешав 100 мл 20x TBS и 20 мл 10% Tween-20 (10x) с 1,88 л dH2O.
- Готовят проявочный раствор, смешивая 1 объем люминола/усилителя с 1 объемом стабильного перекисного буфера.
2. Рассечение икроножной мышцы мыши15,16
- Приготовьте пробирки объемом 50 мл, содержащие 10 мл PBS на льду.
- Усыпляют мышей в камереСО2 с последующим вывихом шейки матки.
- Удалите икроножную мышцу с обеих ног и перенесите их в трубку с PBS на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите камбаловидную мышцу из мышцы GA перед переносом мышцы GA в PBS.
3. Выделение и культивирование первичных фибробластов мыши
- Взвесьте мышцы и перенесите их в 10-сантиметровую чашку под колпаком биобезопасности. Измельчите мышцы скальпелями, пока они не превратятся в мелкую пасту.
- Перелейте мелко измельченную мышечную пасту в пробирку объемом 50 мл и добавьте в пробирку 3,5-кратный объем/мг тканевого раствора для пищеварения и инкубируйте в течение 45 минут при 37 °C. Тщательно перемешивайте суспензию с помощью пипетки объемом 5 мл каждые 10 минут (это поможет полностью диссоциировать).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы для этого шага можно использовать тканевый диссоциатор. - Добавьте 20 мл DMEM в клеточную суспензию, чтобы инактивировать раствор для пищеварения. Переложите на нейлоновое ситечко размером 70 мкм, помещенное в пробирку объемом 50 мл. Соберите проточный фильтр и промойте сетчатый фильтр дополнительно 5 мл DMEM в полном объеме.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 300 х г при комнатной температуре (RT) в течение 10 мин и осторожно удаляют надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте гранулы в 10 мл DMEM и высаживайте клетки в 10-сантиметровую чашку.
- Культивирование клеток при 37 °C, 5% CO 2, 3% O2 (пассаж 0 или P0).
ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Эти культуры должны поддерживаться при низком уровне кислорода, чтобы обеспечить физиологические условия (уровеньO2 в скелетных мышцах составляет около 2,5%)17. 2) Номер пассажа (например, P0) клеточной культуры является записью количества раз, когда культура подвергалась субкультивированию. 3) Первичные фибробласты в P0 обычно культивируются до 100% слияния плюс 1 день (и только для P0). Это делается для того, чтобы очистить другие типы клеток и убедиться, что клетки, присутствующие в культуре, являются только фибробластами, обедненными миогенными клетками на основе исследования под микроскопом. Скелетная мускулатура взрослого животного в 2-месячном возрасте содержит около 2% миогенныхпредшественников4. Кроме того, миогенные предшественники обычно не прикрепляются к непокрытой посуде; Следовательно, они теряются при субкультуре18,19,20. Миогенным клеткам требуется другая среда (F10), дополненная 20% FBS и основным фактором роста фибробластов (bFGF)18. При полном DMEM средние фибробласты имеют более высокую скорость пролиферации, чем миогенные клетки, что приводит к элиминации этих загрязняющих клеток до первого пассажа. - Промойте клетки P0 PBS при 100% слиянии плюс 1 день. Добавьте 1 мл раствора трипсинизации и инкубируйте при 37 °C, 5% CO 2, 3% O2 для отделения клеток. Остановите ферментативную активность, используя 10 мл DMEM complete.
- Центрифугируют клетки при 300 x g в течение 10 мин при RT и повторно суспендируют гранулы в 20 мл DMEM complete и семян в чашку диаметром 15 см (проход 1 или P1). Клетки выращиваются до слияния 80–90% и могут расширяться до 3-го пассажа.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от последующих экспериментов можно использовать проход 1, проход 2 (P2) или проход 3 (P3).
4. Посев клеток и сбор кондиционированной среды
- Промывают фибробласты (Р1, Р2 или Р3) 10 мл PBS, добавляют 2,5 мл раствора трипсинизации к клеткам и инкубируют при 37 °C, 5% CO 2, 3% O2. Остановите ферментативную активность, используя 10 мл DMEM complete.
ПРИМЕЧАНИЕ: После прохождения 4 первичные клетки отбрасываются и не должны использоваться для дальнейших экспериментов, так как они изменяют характеристики. - Соберите клетки и центрифугируйте при 300 x g при RT в течение 10 мин.
- Ресуспендированную клеточную гранулу в 10 мл безэкзосомной среды и подсчитывают количество клеток.
- Высевают клетки при температуре 1,5–2,0 x 10по 6 клеток в чашке (15 см) и инкубируют при 37 °C, 5% CO 2, 3 % O2.
- Собирайте кондиционированную среду в течение 16–24 ч в пробирках по 50 мл на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки не сливаются на 80%, свежая экзосомальная свободная среда может быть добавлена снова и собрана через дополнительные 16–24 часа. Две коллекции могут быть объединены для дальнейшей обработки.
5. Очистка экзосом с помощью дифференциального и ультрацентрифугирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполняются при температуре 4 °C или на льду. При необходимости уравновешивайте трубку трубкой, наполненной водой.
- Центрифугу кондиционированной среды при 300 x g в течение 10 мин для удаления живых клеток и переложить надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 50 мл.
- Удалить омертвевшие клетки центрифугированием при 2 000 x g в течение 10 мин и переложить надосадочную жидкость в полипропиленовую пробирку объемом 38,5 мл.
- Центрифугируют надосадочную жидкость при 10 000 x g в течение 30 мин для удаления органелл, апоптотических телец и фрагментов мембраны. Перелейте надосадочную жидкость в сверхпрозрачную пробирку объемом 38,5 мл.
- Ультрацентрифуга надосадочной жидкости при концентрации 100 000 x g в течение 1,5 ч до гранулирования экзосом.
- Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, оставив примерно 1 мл кондиционированной среды, и промойте гранулу экзосомы в общем объеме 30 мл ледяного PBS.
- Центрифугу при 100 000 x g в течение 1,5 ч и осторожно выбросьте надосадочную жидкость путем пипетирования, стараясь не повредить экзосомальную гранулу.
- Ресуспендируйте гранулу в ледяном PBS (~25 мкл на чашку диаметром 15 см) и измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа белка BCA и микропланшетного ридера при длине волны 562 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию белка измеряют путем разбавления 1:2 0,1% Triton-X100 в dH2O. Выход экзосом из 15-сантиметровой чашки (20 мл кондиционированной среды) первичных фибробластов при 80% слиянии составляет ~3–4 мкг.
6. Характеристика экзосом по градиенту плотности сахарозы
- Загрузите градиент сахарозы в ультрапрозрачную пробирку объемом 13 мл путем пипетирования (снизу вверх) следующим образом: 1,5 мл 2,0 М, 2,5 мл 1,3 М, 2,5 мл 1,16 М, 2,0 мл 0,8 М и 2,0 мл 0,5 М раствора сахарозы.
- Смешайте 30–100 мкг экзосом с 0,25 М раствором сахарозы и доведите объем до 1 мл.
- Осторожно загружают экзосомы поверх градиентов и ультрацентрифугируют образцы в течение 2,5 ч при 100 000 x g и 4 °C.
- Извлеките пробирки из ультрацентрифуги, поместите их на лед и соберите фракции по 1,0 мл, начиная с верхней части градиента. Переложите их в пробирки по 1,7 мл на льду.
- Добавьте 110 мкл 100% ТСА в каждую пробирку, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 10 минут при RT.
- Центрифугу в течение 10 мин при 10 000 x g и RT и осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл предварительно охлажденного 80% этанола и оставьте образцы для промывки на 10 мин при -20 °C.
- Центрифугу в течение 10 мин при 10 000 x g и 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
- Высушите гранулу в течение 10–15 мин при RT и повторно суспендируйте гранулу в PBS для экспериментов in vitro. Измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа белка BCA или ресуспендируйте гранулу непосредственно в 14,5 мкл dH2O, 5 мкл 4x Laemmli буфера и 0,5 мкл 1 M DTT для вестерн-блоттинга.
7. Обнаружение экзосом методом вестерн-блоттинга
- Смешайте 5–10 мкг экзосом, начиная со стадии 5,7, с 5 мкл 4-кратного буфера Laemmli и 0,5 мкл 1 M DTT, затем доведите окончательный объем до 20 мкл с dH2O. Нагревают все образцы, включая те, которые находятся на стадии 6.9, в течение 5 мин при 98 °C.
- Загрузите образцы в 10%-ный гель TGX без пятен и загрузите белковые лестницы в соответствии с рекомендациями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите процентное содержание геля в соответствии с молекулярной массой интересующего белка. - Пропустите гель при 100 В в течение ~1 ч в работающем буфере до тех пор, пока загружающий краситель не окажется на дне геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время работы может варьироваться в зависимости от используемого оборудования, типа и процентного содержания геля. - Изобразите гель. Изображения гелей без пятен используются в качестве контроля нагрузки для иммуноблотов.
- Перенесите гель с помощью мембраны PVDF на 1,5 ч при 80 В или на ночь при 30 В при 4 °C.
- Блокируют мембраны в блокирующем буфере в течение 1 ч при РТ.
- Инкубируют мембраны для специфических антител (табл. 2) в буфере антител в течение ночи при 4 °C при перемешивании.
- Промывают мембраны в промывочном буфере и инкубируют мембраны с соответствующими вторичными антителами (табл. 2) в течение 1 ч при РТ с перемешиванием.
- Промойте мембраны в промывочном буфере и визуализируйте мембраны с помощью проявочного раствора и тепловизора на базе камеры. В качестве альтернативы можно использовать рентгеновскую пленку для проявки мембран.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол подходит для очистки экзосом от больших объемов кондиционированной среды экономически эффективным способом. Процедура отличается высокой воспроизводимостью и последовательностью. На рисунке 1 представлено изображение экзосом, очищенных из питательной среды первичных фибробластов мыши, методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). На рисунке 2 показан характер экспрессии белков канонических экзосомальных маркеров и отсутствие цитозольных (ЛДГ) и ЭР (кальнексин) белковых контаминантов. На рисунке 3 показано распределение канонических экзосомальных маркеров (Alix, CD9 и CD81) после градиентов плотности сахарозы.
Рисунок 1: Репрезентативное ПЭМ-изображение экзосом, выделенных из питательной среды первичных фибробластов мыши. Показаны относительно однородные размеры этих нановезикул. Поперек черными линиями обозначают диаметр отдельных пузырьков. Масштабная линейка = 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Иммуноблоттинги лизатов экзосом, прощупываемые антителами к экзосомным, цитозольным и ER-маркерам. Аликс, CD81, CD9, флотиллин1, синдекан1, синтенин1 (экзосома), цитозольный (ЛДГ) и ЭР (кальнексин) маркеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Экзосомы, разделенные градиентом плотности сахарозы. Отдельные фракции исследовали на вестерн-блоттинге с антителами к Alix, CD9 и CD81. Исходя из характера фракционирования маркеров, экзосомы последовательно осаждаются фракциями 3–6, которые соответствуют плотности 1,096–1,140 г/мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Сахароза (г) | Рабочий раствор сахарозы (мл) | |
| 2,0 М | 2.74 | 4.0 |
| 1,3 М | 2.67 | 6.0 |
| 1,16 млн | 2.38 | 6.0 |
| 0,8 м | 1.37 | 5.0 |
| 0,5 м | 0.86 | 5.0 |
| 0,25 м | 0.26 | 3.0 |
Таблица 1: Растворы градиента плотности сахарозы.
| Антитело | Хозяин | Компания | Каталожный номер |
| КД9 | Крыса | БД Биосайенс | 553758 |
| КД81 | Мышь | Санта-Крус Биотекнолоджис | СК-166029 |
| Аликс | Кролик | Лаборатория д'Аццо | Аликс |
| Флотилин1 | Мышь | БД Биосайенс | 610820 |
| Синдекан1 | Кролик | Технологии жизни | 36-2900 |
| Синтенин1 | Кролик | Millipore/Sigma | AB15272 |
| ЛДГ | Коза | Хемикон | АВ1222 |
| Кальнексин | Коза | Санта-Крус Биотекнолоджис | СК-6465 |
| крыса-HRP | Осел | Джексон Имм. Лаборатория Res | 112-035-003 |
| Мышь-HRP | Коза | Джексон Имм. Лаборатория Res | 115-035-044 |
| Кролик-HRP | Коза | Джексон Имм. Лаборатория Res | 111-035-144 |
Таблица 2: Первичные и вторичные антитела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшим шагом для успешного выделения экзосом из питательной среды, как указано в этом протоколе, является надлежащее установление и поддержание первичных культур фибробластов мышей из скелетных мышц взрослого человека. Эти культуры необходимо поддерживать при низком уровне кислорода, чтобы обеспечить физиологические условия (уровень О2 в скелетных мышцах ~2,5 %)15. Первичные фибробласты будут менять характеристики при слишком частом попадании в культуру. Следовательно, низкое число пассажей является обязательным условием для идеального выхода экзосом. Очищенные экзосомы следует либо немедленно использовать в экспериментальных целях, либо хранить в замороженном виде в аликвотах при -80 °C до тех пор, пока это не понадобится. Еще одним важным этапом протокола является использование растворов сахарозы, приготовленных каждый раз свежими. Ограничением метода является то, что он занимает много времени, потому что первичные фибробласты, как правило, не секретируют большое количество экзосом, как другие секреторные клетки. Поэтому следует использовать большие культуры, которые приводят к большим объемам кондиционных сред, подлежащих обработке.
Преимущество дифференциального центрифугирования, используемого здесь, заключается в том, что оно представляет собой масштабируемый подход (до литров) и является методом выбора для выделения экзосом из первичных фибробластов. Альтернативным методом для больших объемов (до 100 мл на колонку) является эксклюзионная хроматография (SEC). Этот метод является быстрым и может отделить белки от экзосом. Колонка не гранулирует экзосомы, поэтому требуются дальнейшие этапы концентрирования или центрифугирования. Одним из недостатков метода SEC является то, что колонна со временем может засоряться и перегружаться. Другие современные методы основаны на использовании небольших объемов биологических жидкостей (например, мочи, ликвора, сыворотки, плазмы) и коммерчески доступных наборов. Несмотря на то, что эти наборы обеспечивают воспроизводимость, они являются дорогостоящими и не всегда дают высокий выход чистых экзосом. Описанный протокол очистки экзосом прост и может быть применен к различным типам клеток, целых тканей и органов или других биологических жидкостей в зависимости от экспериментальной необходимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни у одного из авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
Алессандра д'Аццо возглавляет кафедру генетики и генной терапии Фонда «Ювелиры для детей» (JFC). Эта работа была частично поддержана грантами NIH R01GM104981, RO1DK095169 и CA021764, Фондом Ассизи в Мемфисе и Американо-ливанско-сирийской ассоциированной благотворительной организацией.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14x89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25x89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
References
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
- Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
- van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
- Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
- Howitt, J., Hill, A. F.
- Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
- Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
- Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
- Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
- Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
- Lee, Y. S. Muscle Dissection in mouse. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016).
- Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
- Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
- Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).
