Summary
이 프로토콜은 1) 성체 마우스 비복근에서 일차 섬유아세포를 분리하고 배양하는 방법과 2) 자당 밀도 구배와 웨스턴 블롯 분석을 결합한 차등 초원심분리 방법을 사용하여 엑소좀을 정제하고 특성화하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
엑소좀은 거의 모든 세포에서 방출되고 모든 생체액에서 분비되는 작은 세포외 소포체입니다. 이러한 소포를 분리하기 위해 초원심분리, 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한 많은 방법이 개발되었습니다. 그러나 모든 엑소좀이 대규모 엑소좀 정제 및 특성화에 적합한 것은 아닙니다. 여기에는 성체 쥐 골격근에서 분리한 일차 섬유아세포의 배양을 확립한 후 이들 세포의 배양 배지에서 엑소좀을 정제하고 특성 분석하기 위한 프로토콜이 요약되어 있습니다. 이 방법은 순차적 원심분리 단계 후 자당 밀도 구배를 사용하는 것을 기반으로 합니다. 그런 다음 엑소좀 제제의 순도는 표준 마커(예: Alix, CD9 및 CD81)를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 검증됩니다. 이 프로토콜은 전자 현미경, 질량 분석법 및 기능 연구를 위한 흡수 실험을 위해 생체 활성 엑소좀을 분리하고 농축하는 방법을 설명합니다. 쉽게 확장 또는 축소할 수 있으며 다양한 세포 유형, 조직 및 생물학적 체액에서 엑소좀 분리에 적용할 수 있습니다.
Introduction
엑소좀은 크기가 30–150nm인 이질적인 세포외 소포체입니다. 그들은 생리학 및 병리학적 과정에서 확립된 핵심 플레이어이며, 조직과 장기에 유비쿼터스 분포를 가지고 있습니다 1,2. 엑소좀은 단백질, 지질, DNA 유형 및 RNA 유형의 복잡한 화물을 운반하며, 이는 파생된 세포의 유형에 따라 다릅니다 1,2,3. 엑소좀은 서로 다른 기능을 하는 단백질(즉, CD9 및 CD63을 포함한 테트라스파닌)이 풍부하여 융합 현상을 담당합니다. 예를 들어, 열 충격 단백질 HSP70 및 HSP90은 항원 결합 및 제시에 관여합니다. 또한 Alix, Tsg101 및 flotillin은 엑소좀 생물 발생 및 방출에 관여하며 이러한 나노 소포 2,3,4의 마커로 널리 사용됩니다.
엑소좀은 또한 수용 세포로 전달될 수 있는 다양한 RNA(즉, microRNA, long noncoding RNA, ribosomal RNA)를 포함하며, 이는 다운스트림 신호전달에 영향을 미칩니다3. 엑소좀 생리활성은 단일 단위막으로 둘러싸여 있기 때문에 단백질과 핵산의 화물뿐만 아니라 제한막의 지질 성분에도 의존한다1. 엑소좀 막에는 포스파티딜세린, 포스파티드산, 콜레스테롤, 스핑고미엘린, 아라키돈산 및 기타 지방산이 풍부하며, 이 모든 것이 엑소좀 안정성과 막 토폴로지에 영향을 미칠 수 있습니다 2,3. 화물과 지질 배열의 결과로 엑소좀은 수용 세포에서 신호 전달 경로를 시작하고 정상 조직 생리의 유지에 관여합니다 1,2,4,5. 특정 병리학적 조건(예: 신경 퇴행, 섬유증 및 암)에서 병리학적 자극을 유발하고 전파하는 것으로 나타났습니다 4,6,7,8,9,10,11.
엑소좀은 인접 부위나 먼 부위에 신호를 전파할 수 있는 능력으로 인해 질병 상태의 진단 또는 예후에 중요한 바이오마커가 되었습니다. 또한 엑소좀은 치료용 화합물 2,12의 매개체로 실험적으로 사용되었습니다. 클리닉에서 이러한 나노 소포의 잠재적 인 적용은 최대 수율, 순도 및 재현성을 달성하기 위해 분리 방법을 점점 더 중요하게 만듭니다. 엑소좀을 분리하기 위한 다양한 기술이 개발되고 구현되었습니다. 일반적으로 엑소좀은 차등 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 면역 포획(시판 키트 사용)을 통해 조건화된 세포 배양 배지 또는 체액에서 분리할 수 있습니다. 각 접근 방식에는 이전에 논의된 고유한 장점과 단점이있습니다 1,2,13,14.
개요된 프로토콜은 1) 성체 마우스 비복근에서 일차 섬유아세포를 분리하고 배양하며, 2) 이러한 세포에 의해 배양 배지로 방출되는 엑소좀의 정제 및 특성 분석에 중점을 둡니다. 기능성 연구를 위해 원발성 섬유아세포에서 엑소좀을 분리하기 위한 잘 확립된 프로토콜은 현재 부족합니다. 일차 섬유아세포는 많은 양의 엑소좀을 분비하지 않기 때문에 분리 및 정제 과정이 까다롭습니다. 이 프로토콜은 형태학적 무결성과 기능적 활성을 유지하면서 대량의 배양물에서 다량의 순수 엑소좀을 정제하는 방법을 설명합니다. 조건화된 배지에서 얻은 정제된 엑소좀은 in vitro 흡수 실험에서 성공적으로 사용되어 수용 세포에서 특정 신호 전달 경로를 유도했습니다. 또한 여러 생물학적 샘플에서 추출한 엑소좀 화물의 비교 단백질체 분석에도 사용되어 왔다4.
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Protocol
마우스에서의 모든 시술은 세인트 주드 아동 연구 병원(St. Jude Children's Research Hospital), 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 가이드라인에 의해 승인된 동물 프로토콜에 따라 수행되었다.
1. 용액 및 매체 준비
- PBS 15.4mL를 20mg/mL 콜라겐분해효소 P 2.5mL(최종 농도 5mg/mL), 11U/mL dispase II 2mL(최종 농도 1.2U/mL 최종 농도) 및 100μL의 1.0MCaCl2 (최종 농도 5mM)와 혼합하여 분해 용액을 준비합니다.
- DMEM 440mL와 FBS 50mL(10%), 펜/연쇄상구균 5.0mL(각각 100U/mL 및 100μg/mL) 및 글루타민 보충제 5.0mL(2mM)를 혼합하여 1차 섬유아세포 배지 500mL(DMEM 완료)를 준비합니다. 0.22μm 기공 크기의 진공 필터로 배지를 필터 멸균합니다.
- 4°C, 100,000 x g 에서 38.5mL 폴리프로필렌 튜브에 FBS를 하룻밤 동안 초원심분리하여 엑소좀이 없는 혈청을 준비하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
- DMEM 440mL와 엑소좀 프리 혈청 50mL(10%), 펜/연쇄상구균 5mL(100U/mL 및 100μg/mL), 글루타민 보충제 5mL(2mM)를 혼합하여 엑소좀 프리 배지 500mL를 준비합니다. 0.22μm 기공 크기의 진공 필터로 배지를 필터 멸균합니다.
- 0.5 mL의 dH 7.4 O에 Tris 염기 6.057g을 녹이고 HCl로 pH를 7.4로 조정하여 90 M Tris-HCl (pH2)을 준비합니다. dH100O로 부피를 2 mL로 조정합니다.
- 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) / 1 mM Mg (Ac) 2 용액 (자당 작업 용액)을 97.9 mL 2 M Tris-HCl (pH = 7.5) 및 100 μL의 1 M Mg (Ac) 2 μL를혼합하여 준비합니다. 사용 직전에 프로테아제 억제제를 용액에 첨가하고 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
- 표 1에 따라 얼음 위에 자당 밀도 구배 용액을 준비합니다. 이러한 용액은 두 개의 슈크로스 그래디언트 튜브를 준비하기에 충분합니다.
- TCA 분말 100g에dH2O40mL를 첨가하여 100% TCA를 제조하고 완전히 녹을 때까지 혼합합니다. dH2O로 최종 부피를 100mL로 조정합니다.
- 20mL의dH2O와 80mL의 100% 에탄올을 혼합하여 80% 에탄올을 준비합니다.
- 1.8L의dH2O와 200mL의 10x 러닝 버퍼를 혼합하여 웨스턴 블롯 러닝 버퍼를 준비합니다.
- 1.4L의dH2O와 200mL의 10x 전달 완충액 및 400mL의 메탄올을 혼합하여 웨스턴 블롯 전달 완충액을 제조합니다. 전송 버퍼를 4°C로 사전 냉각합니다.
- 20dH122 O (pH 850)의 2 mL에 180g의 트리스베이스와 180g의 염화나트륨을 녹여 8.0x 트리스 완충 식염수 (TBS)를 준비합니다. dH 1O로 볼륨을2L로 조정합니다.
- 무지방 분유 5g을 10% Tween-20 1mL, 20x TBS 5mL 및 dH2O94mL와 함께 녹여 차단 완충액을 준비합니다.
- BSA 3g을 10% Tween-20 1mL, 20x TBS 5mL 및 dH2O94mL와 함께 용해시켜 항체 완충액을 준비합니다.
- 100mL의 20x TBS와 20mL의 10% Tween-20(10x)을 1.88L의dH2O와 혼합하여 세척 완충액을 준비합니다.
- luminol/enhance 1 부피와 안정한 과산화물 완충액 1 부피를 혼합하여 현상액을 준비합니다.
2. 비복근(GA) 마우스 근육의 해부15,16
- 얼음 위에 10mL PBS가 들어 있는 50mL 튜브를 준비합니다.
- CO2 챔버에서 마우스를 안락사시킨 후 자궁경부 탈구를 실시합니다.
- 양쪽 다리에서 비복근을 제거하고 얼음 위에 PBS가 있는 튜브로 옮깁니다.
알림: GA 근육을 PBS로 옮기기 전에 GA 근육에서 가자미 근육을 제거하십시오.
3. 마우스 1차 섬유아세포 분리 및 배양
- 근육의 무게를 측정하고 생물 안전 후드 아래의 10cm 접시로 옮깁니다. 고운 반죽이 될 때까지 메스로 근육을 다집니다.
- 잘게 다진 근육 페이스트를 50mL 튜브에 옮기고 3.5x 부피/mg 조직의 분해 용액을 튜브에 넣고 37°C에서 45분 동안 배양합니다. 현탁액을 10분마다 5mL 피펫으로 완전히 혼합합니다(이렇게 하면 완전한 해리에 도움이 됩니다).
알림: 또는 이 단계에 조직 해리기를 사용할 수 있습니다. - 세포 현탁액에 20mL의 DMEM complete를 추가하여 분해 용액을 비활성화합니다. 50mL 튜브에 놓인 70μm 나일론 셀 스트레이너로 옮깁니다. 플로우 스루를 수집하고 추가로 5mL의 DMEM complete로 세포 스트레이너를 세척합니다.
- 실온(RT)에서 300 x g 에서 10분 동안 셀 현탁액을 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
- 펠릿을 10mL의 DMEM 완료에 재현탁시키고 세포를 10cm 접시에 파종합니다.
- 37 °C, 5 % CO 2, 3 % O2 (통로 0 또는 P0)에서 세포를 배양합니다.
참고: 1) 이러한 배양은 생리학적으로 유사한 조건(골격근의 O 2 수준은 약2.5%)을 보장하기 위해 낮은 산소 수준으로 유지되어야 합니다17. 2) 세포 배양의 통로 번호(예: P0)는 배양이 과대 배양된 횟수의 기록입니다. 3) P0의 일차 섬유아세포는 100% 밀도에 1일을 더할 때까지 일상적으로 배양됩니다(P0에 한함). 이는 다른 유형의 세포를 제거하고 배양에 존재하는 세포가 현미경 검사를 기반으로 근원 세포가 고갈된 섬유아세포일 뿐임을 확인하기 위한 것입니다. 생후 2개월이 된 성체 동물의 골격근에는 약 2%의 근생성 전구세포가 포함되어 있다4. 또한, myogenic progenitors는 일반적으로 코팅되지 않은 접시에 부착되지 않습니다. 그러므로, 그들은 서브컬쳐(subculturing) 18,19,20 동안에 손실된다. 근육 세포는 20% FBS와 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)가 보충된 다른 배지(F10)가 필요합니다18. DMEM complete에서 중간 섬유아세포는 근육 세포보다 증식 속도가 더 높기 때문에 첫 번째 통과 전에 이러한 오염 세포가 제거됩니다. - P0 세포를 PBS로 헹구고 100%가 합류하면 1일을 더합니다. 트립신화 용액 1mL를 첨가하고 37°C, 5% CO2, 3%O2에서 배양하여 세포를 분리합니다. 10mL의 DMEM complete를 사용하여 효소 활성을 중지합니다.
- 세포를 RT에서 10분 동안 300 x g 으로 원심분리하고 펠릿을 20mL의 DMEM 완료에 재현탁시키고 15cm 접시(통로 1 또는 P1)에 파종합니다. 세포는 80%–90% 밀도까지 성장하며 통로 3까지 확장할 수 있습니다.
참고: 다운스트림 실험 통로 1에 따라 통로 2(P2) 또는 통로 3(P3)을 사용할 수 있습니다.
4. 세포의 파종 및 조건화된 배지의 수집
- 섬유아세포(P1, P2 또는 P3)를 10mL의 PBS로 세척하고 2.5mL의 트립신화 용액을 세포에 첨가하고 37°C, 5% CO2, 3%O2에서 배양합니다. 10mL의 DMEM complete를 사용하여 효소 활성을 중지합니다.
참고: 4번 통과 이후에는 1차 전지가 폐기되고 특성이 변경되므로 추가 실험에 사용해서는 안 됩니다. - 세포를 수집하고 상온에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
- 세포 펠릿을 10mL의 엑소좀이 없는 배지에 재현탁시키고 세포를 계수합니다.
- 접시 당 1.5-2.0 x 106 셀 (15cm)에서 세포를 파종하고 37 °C, 5 % CO 2, 3 % O2 에서 배양합니다.
- 얼음 위의 50mL 튜브에서 16–24시간 사이에 조절된 배지를 수집합니다.
참고: 세포가 80% 합류하지 않으면 새로운 엑소좀 유리 배지를 다시 추가하고 추가 16-24시간 후에 수집할 수 있습니다. 추가 처리를 위해 두 컬렉션을 결합할 수 있습니다.
5. 차등 및 초원심분리를 이용한 엑소좀 정제
알림: 모든 단계는 4°C 또는 얼음 위에서 수행됩니다. 필요한 경우 물을 채운 튜브로 튜브의 균형을 맞춥니다.
- 살아있는 세포를 제거하기 위해 300 x g 에서 10분 동안 조절된 배지를 원심분리하고 상층액을 새 50mL 튜브로 옮깁니다.
- 2,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 죽은 세포를 제거하고 상층액을 38.5mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
- 상층액을 10,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하여 세포 기관, 세포 사멸체 및 막 조각을 제거합니다. 상층액을 38.5mL 초투명 튜브로 옮깁니다.
- 상층액을 100,000 x g 에서 1.5시간 동안 초원심분리하여 엑소좀을 펠트합니다.
- 상층액을 조심스럽게 버리고 약 1mL의 컨디셔닝된 배지를 남기고 엑소좀 펠릿을 총 30mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 세척합니다.
- 100,000 x g 에서 1.5시간 동안 원심분리하고 엑소좀 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 피펫팅으로 상층액을 조심스럽게 버립니다.
- 펠릿을 얼음처럼 차가운 PBS(15cm 접시당 ~25μL)에 재현탁시키고 BCA 단백질 분석 키트와 562nm에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
참고: 단백질 농도는 dH2O에서 0.1% Triton-X100으로 1:2 희석하여 측정합니다. 80% 밀도에서 1차 섬유아세포의 15cm 접시(20mL의 조절된 배지)에서 엑소좀의 수율은 ~3–4μg입니다.
6. 슈크로스 밀도 구배에 의한 엑소좀의 특성 분석
- 2.0 M의 1.5 mL, 1.3 M의 2.5 mL, 1.16 M의 2.5 mL, 0.8 M의 2.0 mL 및 0.5 M 슈크로스 용액의 2.0 mL를 피펫팅하여(아래에서 위로) 13 mL 초투명 튜브에 슈크로스 그래디언트를 로드합니다.
- 30–100 μg의 엑소좀을 0.25 M 자당 용액과 혼합하고 부피를 1 mL로 조절합니다.
- 그래디언트 위에 엑소좀을 조심스럽게 로드하고 100,000 x g 및 4°C에서 2.5시간 동안 샘플을 초원심분리합니다.
- 울트라 원심분리기에서 튜브를 꺼내 얼음 위에 놓고 그래디언트 상단에서 시작하여 1.0mL 분획을 수집합니다. 얼음 위의 1.7mL 튜브로 옮깁니다.
- 각 튜브에 110μL의 100% TCA를 넣고 잘 섞은 후 RT에서 10분 동안 배양합니다.
- 10,000 x g 및 RT에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 버립니다.
- 펠릿을 500μL의 사전 냉각된 80% 에탄올에 재현탁시키고 샘플을 -20°C에서 10분 동안 세척하도록 둡니다.
- 10,000 x g 및 4 °C에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 펠릿을 RT에서 10-15분 동안 건조시키고 시험관 내 실험을 위해 펠릿을 PBS에 재현탁시킵니다. BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하거나 웨스턴 블롯 분석을 위해 14.5μL의 dH2O, 5μL의 4x Laemmli 완충액 및 0.5μL의 1M DTT에 펠릿을 직접 재현탁시킵니다.
7. 웨스턴 블롯 분석을 통한 엑소좀 검출
- 5.7 단계에서 채취한 엑소좀 5–10 μg을 5 μL의 4x Laemmli 완충액 및 0.5 μL의 1 M DTT와 혼합한 다음 dH2O를 사용하여 최종 부피를 20 μL로 조정합니다. 6.9단계의 샘플을 포함한 모든 샘플을 98°C에서 5분 동안 가열합니다.
- 샘플을 10% TGX stain-free gel에 넣고 제조업체의 권장 사항에 따라 단백질 ladder를 로드합니다.
참고: 관심 단백질의 분자량에 따라 겔의 백분율을 선택하십시오. - 로딩 염료가 겔 바닥에 올 때까지 버퍼에서 ~1시간 동안 100V에서 겔을 실행합니다.
알림: 실행 시간은 사용하는 장비 또는 젤의 종류 및 비율에 따라 다를 수 있습니다. - 젤을 이미지화합니다. 얼룩이 없는 겔의 이미지는 면역 블록의 로딩 컨트롤로 사용됩니다.
- PVDF 멤브레인을 사용하여 80V에서 1.5시간 동안 또는 4°C에서 30V에서 밤새 겔을 옮깁니다.
- RT에서 1시간 동안 차단 완충액의 멤브레인을 차단합니다.
- 특이 항체 멤브레인(표 2)을 항체 완충액에서 4°C에서 밤새 교반하면서 배양합니다.
- 세척 완충액에서 멤브레인을 세척하고 적절한 2차 항체(표 2)로 멤브레인을 교반과 함께 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
- 세척 버퍼에서 멤브레인을 세척하고 현상액과 카메라 기반 이미저를 사용하여 멤브레인을 이미지화합니다. 또는 X선 필름을 사용하여 멤브레인을 현상합니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 비용 효율적인 방식으로 대량의 조절된 배지에서 엑소좀을 정제하는 데 적합합니다. 이 절차는 재현성이 높고 일관성이 있습니다. 그림 1 은 생쥐 일차 섬유아세포의 배양액에서 정제된 엑소좀의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 보여줍니다. 그림 2 는 표준 엑소좀 마커의 단백질 발현 패턴과 세포질(LDH) 및 ER(칼넥신) 단백질 오염 물질의 부재를 보여줍니다. 그림 3 은 슈크로스 밀도 구배 후 표준 엑소좀 마커(Alix, CD9 및 CD81)의 분포를 보여줍니다.
그림 1: 마우스 일차 섬유아세포의 배양 배지에서 분리한 엑소좀의 대표적인 TEM 이미지. 이 나노 소포의 비교적 균일 한 크기가 표시됩니다. 검은색 선은 개별 소포의 직경을 나타냅니다. 스케일 바 = 100nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 엑소좀, 세포염색체 및 ER 마커에 대한 항체로 조사된 엑소좀 용해물의 면역블롯. 알릭스, CD81, CD9, 플로틸린1, 신데칸1, 신테닌1(엑소좀), 세포질(LDH), ER(칼넥신) 마커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 자당 밀도 구배로 분리된 엑소좀. 개별 분획은 Alix, CD9 및 CD81에 대한 항체가 있는 웨스턴 블롯에서 조사되었습니다. 마커의 분획 패턴에 따라 엑소좀은 1.096–1.140g/mL의 밀도에 해당하는 3–6개의 분획으로 일관되게 침전됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 자당 (g) | 자당 작업 용액(mL) | |
| 2.0 미터 | 2.74 | 4.0 |
| 1.3 미터 | 2.67 | 6.0 |
| 1.16 미터 | 2.38 | 6.0 |
| 0.8 미터 | 1.37 | 5.0 |
| 0.5 미터 | 0.86 | 5.0 |
| 0.25 미터 | 0.26 | 3.0 |
표 1: 자당 밀도 그래디언트 용액.
| 항체 | 호스트 | 회사 | 카탈로그 번호 |
| CD9 (CD9) | 쥐 | BD 바이오사이언스 | 553758 |
| CD81 시리즈 | 마우스 | 산타 크루즈 생명 공학 | 남 호 - 166029 |
| 알릭스 | 토끼 | d'Azzo 연구소 | 알릭스 |
| 플로틸린1 | 마우스 | BD 바이오사이언스 | 610820 |
| 신데칸1 | 토끼 | 생명 기술 | 36-2900 |
| 신테닌1 | 토끼 | 밀리포어/시그마 | AB15272 |
| LDH (LDH) | 염소 | 케미콘 | AB1222년 |
| 칼넥신 | 염소 | 산타 크루즈 생명 공학 | 사우스 캐롤라이나 - 6465 |
| 쥐-HRP | 당나귀 | 잭슨 음. Res Lab | 112-035-003 |
| 마우스-HRP | 염소 | 잭슨 음. Res Lab | 115-035-044 |
| 토끼-HRP | 염소 | 잭슨 음. Res Lab | 111-035-144 |
표 2: 1차 및 2차 항체.
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Discussion
이 프로토콜에 설명된 바와 같이 배양 배지에서 엑소좀을 성공적으로 분리하기 위한 중요한 단계는 성체 골격근에서 1차 마우스 섬유아세포 배양을 적절하게 확립하고 유지하는 것입니다. 이러한 배양은 생리학적으로 유사한 조건(골격근의 O2 수준은 ~2.5%)을 보장하기 위해 낮은 산소 수준으로 유지되어야 합니다15. 원발성 섬유아세포는 배양에 너무 많이 통과되면 형질이 바뀝니다. 따라서 이상적인 엑소좀 수율을 위해서는 낮은 통로 수가 필수적입니다. 정제된 엑소좀은 실험 목적으로 즉시 사용하거나 필요할 때까지 -80°C의 부분 표본에서 냉동 보관해야 합니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 매번 신선하게 준비된 자당 용액을 사용하는 것입니다. 이 방법의 한계는 시간이 많이 걸린다는 것인데, 1차 섬유아세포는 일반적으로 다른 분비 세포와 달리 많은 양의 엑소좀을 분비하지 않기 때문입니다. 따라서 대규모 배양을 사용해야 하며, 이로 인해 많은 양의 조건화된 배지를 처리해야 합니다.
여기에 사용된 차등 원심분리의 장점은 확장 가능한 접근 방식(최대 리터)을 나타내며 1차 섬유아세포에서 엑소좀을 분리하기 위해 선택하는 방법이라는 것입니다. 더 큰 부피(컬럼당 최대 100mL)를 위한 대체 방법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)입니다. 이 방법은 빠르며 엑소좀에서 단백질을 분리할 수 있습니다. 컬럼은 엑소좀을 펠릿화하지 않으므로 추가 농축 또는 원심분리 단계가 필요합니다. SEC 방법의 단점 중 하나는 시간이 지남에 따라 컬럼이 막히고 과부하가 발생할 수 있다는 것입니다. 다른 현재 방법은 소량의 생물학적 유체(예: 소변, CSF, 혈청, 혈장) 및 상업적으로 이용 가능한 키트의 사용을 기반으로 합니다. 이러한 키트는 재현성을 보장하지만 비용이 많이 들고 항상 높은 수율의 순수 엑소좀을 생산하는 것은 아닙니다. 엑소좀 정제를 위한 프로토콜은 간단하며 실험적 필요에 따라 다양한 유형의 세포, 전체 조직 및 장기 또는 기타 생물학적 유체에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자 중 누구도 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
알레산드라 다조(Alessandra d'Azzo)는 유전학 및 유전자 치료 분야의 JFC(Jewelers for Children) 기부 의장을 맡고 있습니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01GM104981, RO1DK095169, CA021764, 멤피스의 아시시 재단, 미국 레바논 시리아 연합 자선 단체의 일부 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14x89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25x89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
References
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