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Biology

कंकाल की मांसपेशी फाइब्रोब्लास्ट से एक्सोसोम का अलगाव और लक्षण वर्णन

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/61127
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Genetics, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

यह प्रोटोकॉल 1) वयस्क माउस गैस्ट्रोकेनेमस मांसपेशियों से प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव और संस्कृति को दर्शाता है और साथ ही 2) सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट के साथ संयुक्त अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधि का उपयोग करके एक्सोसोम का शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन करता है, जिसके बाद पश्चिमी धब्बा विश्लेषण होता है।

Abstract

एक्सोसोम लगभग सभी कोशिकाओं द्वारा जारी किए गए छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाएं हैं और सभी जैविक तरल पदार्थों में स्रावित होती हैं। इन पुटिकाओं के अलगाव के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, जिनमें अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, अल्ट्राफिल्ट्रेशन और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी शामिल हैं। हालांकि, सभी बड़े पैमाने पर एक्सोसोम शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त नहीं हैं। यहां उल्लिखित वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशियों से अलग प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट की संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है, इसके बाद इन कोशिकाओं के संस्कृति मीडिया से एक्सोसोम का शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन किया गया है। विधि सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट के बाद अनुक्रमिक सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों के उपयोग पर आधारित है। एक्सोसोमल तैयारी की शुद्धता को तब कैननिकल मार्करों (यानी, एलिक्स, सीडी 9 और सीडी 81) की बैटरी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा मान्य किया जाता है। प्रोटोकॉल बताता है कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और कार्यात्मक अध्ययन के लिए अपटेक प्रयोगों के लिए बायोएक्टिव एक्सोसोम को कैसे अलग और केंद्रित किया जाए। इसे आसानी से ऊपर या नीचे किया जा सकता है और विभिन्न सेल प्रकारों, ऊतकों और जैविक तरल पदार्थों से एक्सोसोम अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

एक्सोसोम विषम बाह्य कोशिकीय पुटिकाएं हैं जो 30-150 एनएम के आकार में होती हैं। वे शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में प्रमुख खिलाड़ी स्थापित हैं, ऊतकों और अंगों में उनके सर्वव्यापी वितरण को देखते हुए 1,2. एक्सोसोम में प्रोटीन, लिपिड, डीएनए प्रकार और आरएनए प्रकार ों का एक जटिल कार्गो होता है, जो कोशिकाओं के प्रकार के अनुसार भिन्न होता है जिससे वे 1,2,3 प्राप्त होते हैं। एक्सोसोम प्रोटीन में समृद्ध होते हैं जिनके अलग-अलग कार्य होते हैं (यानी, सीडी 9 और सीडी 63 सहित टेट्रास्पैनिन) संलयन घटनाओं के लिए जिम्मेदार होते हैं। उदाहरण के लिए, हीट शॉक प्रोटीन एचएसपी 70 और एचएसपी 90 एंटीजन बाइंडिंग और प्रस्तुति में शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, एलिक्स, टीएसजी 101, और फ्लोटिलिन एक्सोसोम बायोजेनेसिस और रिलीज में भाग लेते हैं और व्यापक रूप से इन नैनोपुटिकाओं 2,3,4 के मार्कर के रूप में उपयोग किए जाते हैं।

एक्सोसोम में विभिन्न प्रकार के आरएनए (यानी, माइक्रोआरएनए, लॉन्ग नॉनकोडिंग आरएनए, राइबोसोमल आरएनए) भी होते हैं जिन्हें प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जा सकता है, जहां वे डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग3 को प्रभावित करते हैं। एकल इकाई झिल्ली से घिरा होने के कारण, एक्सोसोम बायोएक्टिविटी न केवल प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के कार्गो पर निर्भर करती है, बल्कि सीमित झिल्ली1 के लिपिड घटकों पर भी निर्भर करती है। एक्सोसोमल झिल्ली फॉस्फेटिडिलसेरिन, फॉस्फेटिडिक एसिड, कोलेस्ट्रॉल, स्फिंगोमाइलिन, एराकिडोनिक एसिड और अन्य फैटी एसिड में समृद्ध होती है, जिनमें से सभी एक्सोसोम स्थिरता और झिल्ली टोपोलॉजी 2,3 को प्रभावित कर सकते हैं। कार्गो और लिपिड व्यवस्था के परिणामस्वरूप, एक्सोसोम कोशिकाओं को प्राप्त करने में सिग्नलिंग मार्ग शुरू करते हैं और सामान्य ऊतक शरीर विज्ञान 1,2,4,5 के रखरखाव में भाग लेते हैं। कुछ रोग स्थितियों (यानी, न्यूरोडीजेनेरेशन, फाइब्रोसिस और कैंसर) के तहत, उन्हें पैथोलॉजिकल उत्तेजनाओं 4,6,7,8,9,10,11 को ट्रिगर और प्रचारित करने के लिए दिखाया गया है।

पड़ोसी या दूर की साइटों पर संकेतों का प्रसार करने की उनकी क्षमता के कारण, एक्सोसोम रोग की स्थिति के निदान या पूर्वानुमान के लिए मूल्यवान बायोमार्कर बन गए हैं। इसके अलावा, एक्सोसोम का उपयोग चिकित्सीय यौगिकों 2,12 के वाहनों के रूप में प्रयोगात्मक रूप से किया गया है। क्लिनिक में इन नैनोपुटिकाओं का संभावित अनुप्रयोग अधिकतम उपज, शुद्धता और प्रजनन क्षमता प्राप्त करने के लिए अलगाव विधि को तेजी से महत्वपूर्ण बनाता है। एक्सोसोम के अलगाव के लिए विभिन्न तकनीकों को विकसित और कार्यान्वित किया गया है। आम तौर पर, एक्सोसोम को डिफरेंशियल सेंट्रीफ्यूजेशन, साइज एक्सक्लूजन क्रोमैटोग्राफी और इम्यून कैप्चर (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके) द्वारा वातानुकूलित सेल कल्चर मीडिया या शरीर के तरल पदार्थ से अलग किया जा सकता है। प्रत्येक दृष्टिकोण के अद्वितीय फायदे और नुकसान हैं जिनकी चर्चा पहले 1,2,13,14 की गई है।

उल्लिखित प्रोटोकॉल 1) वयस्क माउस गैस्ट्रोकेनेमस मांसपेशियों से प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव और संस्कृति पर केंद्रित है और 2) इन कोशिकाओं द्वारा संस्कृति माध्यम में जारी एक्सोसोम का शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन। कार्यात्मक अध्ययन के लिए प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट से एक्सोसोम के अलगाव के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल की वर्तमान में कमी है। प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट बड़ी मात्रा में एक्सोसोम का स्राव नहीं करते हैं, जिससे अलगाव और शुद्धिकरण प्रक्रिया चुनौतीपूर्ण हो जाती है। यह प्रोटोकॉल उनकी रूपात्मक अखंडता और कार्यात्मक गतिविधि को बनाए रखते हुए बड़ी संस्कृति की मात्रा से बड़ी मात्रा में शुद्ध एक्सोसोम के शुद्धिकरण का वर्णन करता है। वातानुकूलित माध्यम से प्राप्त शुद्ध एक्सोसोम का उपयोग प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में विशिष्ट सिग्नलिंग मार्गों को प्रेरित करने के लिए इन विट्रो अपटेक प्रयोगों में सफलतापूर्वक किया गया है। उनका उपयोग कई जैविक नमूनों से एक्सोसोमल कार्गो के तुलनात्मक प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए भी किया गयाहै।

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Protocol

चूहों में सभी प्रक्रियाओं को सेंट जूड चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ दिशानिर्देशों द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था।

1. समाधान और मीडिया की तैयारी

  1. 15.4 मिलीलीटर पीबीएस को 20 मिलीग्राम/एमएल कोलेजनेस पी (5 मिलीग्राम/एमएल अंतिम सांद्रता), 2 मिलीलीटर 11 यू/एमएल डिस्पेस द्वितीय (1.2 यू/एमएल अंतिम एकाग्रता) और 1.0 एमएम सीएसीएल2 (5 एमएम अंतिम सांद्रता) के 100 μL के साथ मिलाकर पाचन समाधान तैयार करें।
  2. 500 एमएल प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट माध्यम (डीएमईएम पूर्ण) के 500 एमएल को 50 एमएल एफबीएस (10%), 5.0 एमएल पेन/स्ट्रेप (100 यू/एमएल और 100 μg/एमएल, क्रमशः) और 5.0 एमएल ग्लूटामाइन पूरक (2 मिलीमीटर) के साथ मिलाकर 500 मिलीलीटर प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट माध्यम (डीएमईएम पूर्ण) तैयार करें। 0.22 μm छिद्र आकार वैक्यूम फ़िल्टर के साथ माध्यम को फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 x g पर 38.5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में एफबीएस के रात भर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एक्सोसोम-मुक्त सीरम तैयार करें और सतह पर तैरनेवाला को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. 440 मिलीलीटर डीएमईएम को 50 मिलीलीटर एक्सोसोम-मुक्त सीरम (10), 5 मिलीलीटर पेन/स्ट्रेप (100 यू/एमएल और 100 μg/एमएल) और 5 मिलीलीटर ग्लूटामाइन पूरक (2 मिलीमीटर) के साथ मिलाकर 500 मिलीलीटर एक्सोसोम-मुक्त माध्यम तैयार करें। 0.22 μm छिद्र आकार वैक्यूम फ़िल्टर के साथ माध्यम को फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें।
  5. 6.057 ग्राम ट्रिस बेस को 90 एमएल डीएच 2 ओ में घोलकर और पीएच को एचसीएल के साथ 7.4 में समायोजित करके 0.5 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4) तैयार करें। वॉल्यूम को डीएच2ओ के साथ 100 एमएल तक समायोजित करें।
  6. 97.9 मिलीलीटर डीएच 2 ओ को 0.5 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच = 7.4) और 100 μ लीटर 1 एम एमजी (एसी)2के साथ मिलाकर 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4)/1 एमएम एमजी (एसी)2 समाधान (सुक्रोज वर्किंग सॉल्यूशन) तैयार करें। उपयोग करने से ठीक पहले समाधान में प्रोटीज अवरोधक जोड़ें और समाधान को बर्फ पर रखें।
  7. तालिका 1 के अनुसार बर्फ पर सुक्रोज घनत्व ढाल समाधान तैयार करें। ये समाधान दो सुक्रोज ढाल ट्यूब तैयार करने के लिए पर्याप्त हैं।
  8. 40 मिलीलीटर डीएच2ओ से 100 ग्राम टीसीए पाउडर जोड़कर 100% टीसीए तैयार करें और पूरी तरह से घुलने तक मिलाएं। डीएच2ओ से 100 एमएल के साथ अंतिम मात्रा समायोजित करें।
  9. 100% इथेनॉल के 80 एमएल के साथ 20 एमएल डीएच2ओ मिलाकर 80% इथेनॉल तैयार करें।
  10. 1.8 लीटर डीएच2ओ को 200 एमएल 10 गुना रनिंग बफर के साथ मिलाकर वेस्टर्न ब्लॉट रनिंग बफर तैयार करें।
  11. 1.4 लीटर डीएच2ओ को 200 एमएल 10एक्स ट्रांसफर बफर और 400 एमएल मेथनॉल के साथ मिलाकर वेस्टर्न ब्लॉट ट्रांसफर बफर तैयार करें। स्थानांतरण बफर को 4 डिग्री सेल्सियस तक प्रीकूल करें।
  12. 122 ग्राम ट्रिस बेस और 180 ग्राम सोडियम क्लोराइड को 850 एमएल डीएच2ओ (पीएच 8.0) में घोलकर 20एक्स ट्रिस-बफर्ड सेलाइन (टीबीएस) तैयार करें। वॉल्यूम को डीएच2ओ के साथ 1 एल में समायोजित करें।
  13. 10% ट्वीन-20 के 1 मिलीलीटर, 20x TBS के 5 मिलीलीटर और dh2Oके 94 मिलीलीटर के साथ 5 ग्राम नॉनफैट सूखे दूध को घोलकर ब्लॉकिंग बफर तैयार करें।
  14. 10% ट्वीन -20 के 1 एमएल, 20 एक्स टीबीएस के 5 एमएल और डीएच2ओ के 94 एमएल के साथ बीएसए के 3 ग्राम को घोलकर एंटीबॉडी बफर तैयार करें।
  15. 1.88 लीटर डीएच2ओ के साथ 100 मिलीलीटर 20 x TBS और 10% ट्वीन-20 (10x) के 20 मिलीलीटर मिश्रण करके वॉशिंग बफर तैयार करें।
  16. स्थिर पेरोक्साइड बफर की 1 मात्रा के साथ ल्यूमिनोल / एन्हांस की 1 मात्रा मिलाकर विकासशील समाधान तैयार करें।

2. गैस्ट्रोकेनेमस (जीए) माउस मांसपेशी का विच्छेदन15,16

  1. बर्फ पर 10 एमएल पीबीएस युक्त 50 एमएल ट्यूब तैयार करें।
  2. चूहों को सीओ2 कक्ष में इच्छामृत्यु दें जिसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था हो।
  3. दोनों पैरों से गैस्ट्रोकेनेमस मांसपेशियों को हटा दें और उन्हें बर्फ पर पीबीएस के साथ ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: जीए मांसपेशी को पीबीएस में स्थानांतरित करने से पहले जीए मांसपेशी से सोलस मांसपेशी को हटा दें।

3. माउस प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट अलगाव और संस्कृति

  1. मांसपेशियों का वजन करें और उन्हें जैव सुरक्षा हुड के तहत 10 सेमी डिश में स्थानांतरित करें। स्केलपेल के साथ मांसपेशियों को तब तक कीमा करें जब तक कि यह एक अच्छा पेस्ट न बन जाए।
  2. बारीक कीमा मांसपेशियों के पेस्ट को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूब में पाचन समाधान के 3.5x वॉल्यूम / मिलीग्राम ऊतक जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। निलंबन को हर 10 मिनट में 5 एमएल पाइप के साथ अच्छी तरह से मिलाएं (यह पूर्ण पृथक्करण में सहायता करेगा)।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, इस चरण के लिए एक ऊतक विघटनकर्ता का उपयोग किया जा सकता है।
  3. पाचन समाधान को निष्क्रिय करने के लिए सेल सस्पेंशन में 20 एमएल डीएमईएम पूर्ण जोड़ें। 50 एमएल ट्यूब पर रखे गए 70 μm नायलॉन सेल स्ट्रेनर में स्थानांतरित करें। फ्लो-थ्रू इकट्ठा करें और डीएमईएम के अतिरिक्त 5 एमएल के साथ सेल छन्नी को धो लें।
  4. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 300 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  5. डीएमईएम के 10 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और कोशिकाओं को 10 सेमी डिश में बीज दें।
  6. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 3% ओ2 (मार्ग 0 या पी 0) पर कल्चर करें।
    नोट: 1) इन संस्कृतियों को शारीरिक जैसी स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए कम ऑक्सीजन स्तर पर बनाए रखने की आवश्यकता है (कंकाल की मांसपेशियों में ओ 2 स्तर लगभग2.5% है)। 2) एक सेल संस्कृति की मार्ग संख्या (जैसे, पी 0) संस्कृति को उपसंस्कृति की संख्या की संख्या का रिकॉर्ड है। 3) पी 0 पर प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट ्स को नियमित रूप से 100% कंफ्लुएंसी प्लस 1 दिन (और केवल पी 0 के लिए) तक संवर्धित किया जाता है। यह अन्य प्रकार की कोशिकाओं को शुद्ध करने और यह सुनिश्चित करने के लिए है कि संस्कृति में मौजूद कोशिकाएं केवल फाइब्रोब्लास्ट हैं, माइक्रोस्कोप परीक्षा के आधार पर मायोजेनिक कोशिकाओं से समाप्त हो जाती हैं। 2 महीने की उम्र में एक वयस्क जानवर से कंकाल की मांसपेशी में लगभग 2% मायोजेनिक पूर्वजहोते हैं। इसके अलावा, मायोजेनिक पूर्वज आमतौर पर अनलेपित व्यंजनों से नहीं जुड़ते हैं; इसलिए, वे18,19,20 उप-संवर्धन के दौरान खो जाते हैं। मायोजेनिक कोशिकाओं को 20% एफबीएस और बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (बीएफजीएफ) 18 के साथ पूरक एक अलग माध्यम (एफ 10) की आवश्यकता होती है। डीएमईएम पूर्ण में, मध्यम फाइब्रोब्लास्ट में मायोजेनिक कोशिकाओं की तुलना में उच्च प्रसार दर होती है, जिसके परिणामस्वरूप पहले मार्ग से पहले इन दूषित कोशिकाओं का उन्मूलन होता है।
  7. पीबीएस के साथ पी 0 कोशिकाओं को कुल्ला करें जब 100% कंफ्लुएंट प्लस 1 दिन हो। ट्रिप्सिनाइजेशन घोल के 1 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 3% ओ2 पर इनक्यूबेट करें। डीएमईएम पूर्ण के 10 एमएल का उपयोग करके एंजाइमेटिक गतिविधि को रोकें।
  8. आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और डीएमईएम के 20 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और 15 सेमी डिश (मार्ग 1 या पी 1) में बीज दें। कोशिकाओं को 80% -90% कंफ्लुएंसी तक बढ़ाया जाता है और मार्ग 3 तक विस्तारित किया जा सकता है।
    नोट: डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के आधार पर मार्ग 1, मार्ग 2 (पी 2) या मार्ग 3 (पी 3) का उपयोग किया जा सकता है।

4. कोशिकाओं की बुवाई और वातानुकूलित माध्यम का संग्रह

  1. फाइब्रोब्लास्ट्स (पी 1, पी 2, या पी 3) को 10 एमएल पीबीएस के साथ धोएं, कोशिकाओं में 2.5 एमएल ट्रिप्सिनाइजेशन समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 3% ओ2 पर इनक्यूबेट करें। डीएमईएम पूर्ण के 10 एमएल का उपयोग करके एंजाइमेटिक गतिविधि को रोकें।
    नोट: मार्ग 4 के बाद, प्राथमिक कोशिकाओं को त्याग दिया जाता है और आगे के प्रयोगों के लिए उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि वे विशेषताओं को बदलते हैं।
  2. कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 10 मिनट के लिए आरटी पर 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. एक्सोसोम-मुक्त माध्यम के 10 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और कोशिकाओं की गिनती करें।
  4. कोशिकाओं को 1.5-2.0 x 106 कोशिकाओं प्रति डिश (15 सेमी) पर बीज दें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 3% ओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  5. बर्फ पर 50 एमएल ट्यूबों में 16-24 घंटे के बीच वातानुकूलित माध्यम एकत्र करें।
    नोट: यदि कोशिकाएं 80% कंफ्लुएंट नहीं हैं, तो ताजा एक्सोसोमल मुक्त माध्यम को फिर से जोड़ा जा सकता है और अतिरिक्त 16-24 घंटे की अवधि के बाद एकत्र किया जा सकता है। आगे की प्रक्रिया के लिए दो संग्रहों को जोड़ा जा सकता है।

5. अंतर और अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके एक्सोसोम का शुद्धिकरण

नोट: सभी चरण 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर किए जाते हैं। जरूरत पड़ने पर ट्यूब को पानी से भरी ट्यूब से संतुलित करें।

  1. जीवित कोशिकाओं को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 300 x g पर वातानुकूलित माध्यम को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला को एक नई 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. 10 मिनट के लिए 2,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा मृत कोशिकाओं को निकालें और सतह पर तैरनेवाला को 38.5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. ऑर्गेनेल, एपोप्टोटिक निकायों और झिल्ली के टुकड़ों को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए 10,000 x g पर सतह पर तैरनेवाला को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला को 38.5 एमएल अल्ट्रा-क्लियर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. एक्सोसोम को पेलेट करने के लिए 1.5 घंटे के लिए 100,000 x g पर सुपरनैटेंट को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक छोड़ दें, लगभग 1 मिलीलीटर वातानुकूलित माध्यम छोड़ दें, और एक्सोसोम गोली को बर्फ-ठंडे पीबीएस की कुल मात्रा में 30 मिलीलीटर में धो लें।
  6. 1.5 घंटे के लिए 100,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सावधानीपूर्वक सुपरनैटेंट को पाइपिंग द्वारा छोड़ दें, सावधान रहें कि एक्सोसोमल गोली को परेशान न करें।
  7. बर्फ-ठंडे पीबीएस (~ 25 μL प्रति 15 सेमी डिश) में गोली को फिर से निलंबित करें और बीसीए प्रोटीन परख किट और 562 एनएम पर एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
    नोट: प्रोटीन एकाग्रता को डीएच 2 ओ में 0.1% ट्राइटन-एक्स 100 के साथ 1:2कमजोर पड़ने से मापा जाता है। प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट ्स के 15 सेमी डिश (20 मिलीलीटर वातानुकूलित माध्यम) से एक्सोसोम की उपज 80% कंफ्लुएंसी पर ~ 3-4 μg है।

6. सुक्रोज घनत्व ढाल द्वारा एक्सोसोम का लक्षण वर्णन।

  1. सुक्रोज ग्रेडिएंट को 13 एमएल अल्ट्रा-क्लियर ट्यूब में पाइपिंग (नीचे से ऊपर) निम्नलिखित द्वारा लोड करें: 2.0 मीटर का 1.5 एमएल, 1.3 मीटर का 2.5 एमएल, 1.16 एम का 2.5 एमएल, 0.8 मीटर का 2.0 एमएल और 0.5 एम सुक्रोज समाधान का 2.0 एमएल।
  2. 0.25 एम सुक्रोज घोल के साथ एक्सोसोम के 30-100 μg मिलाएं और मात्रा को 1 एमएल तक समायोजित करें।
  3. ग्रेडिएंट ्स के शीर्ष पर एक्सोसोम को सावधानीपूर्वक लोड करें और 100,000 x g और 4 °C पर 2.5 घंटे के लिए नमूनों को अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूज से ट्यूबों को निकालें और उन्हें बर्फ पर रखें और ढाल के शीर्ष से शुरू होने वाले 1.0 एमएल अंश एकत्र करें। उन्हें बर्फ पर 1.7 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  5. प्रत्येक ट्यूब में 100% टीसीए के 110 μL जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं, और आरटी पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. 10,000 x g और RT पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को सावधानी से छोड़ दें।
  7. प्री-कूल्ड 80% इथेनॉल के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें और नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए धोने के लिए छोड़ दें।
  8. 10,000 x g और 4 °C पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  9. आरटी पर 10-15 मिनट के लिए गोली को सुखाएं और इन विट्रो प्रयोगों के लिए पीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें। बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें या पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए डीएच2ओ के 14.5 μL, 4x Laemmli बफर के 5 μL और 1 M DTT के 0.5 μL में सीधे गोली को पुन: निलंबित करें।

7. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा एक्सोसोम का पता लगाना

  1. चरण 5.7 से एक्सोसोम के 5-10 μg को 4x Laemmli बफर के 5 μL और 1 M DTT के 0.5 μL के साथ मिलाएं, फिर अंतिम मात्रा को dH2O के साथ 20 μL में समायोजित करें। चरण 6.9 सहित सभी नमूनों को 98 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्म करें।
  2. नमूने को 10% टीजीएक्स दाग मुक्त जेल में लोड करें और निर्माता की सिफारिशों के अनुसार प्रोटीन सीढ़ी लोड करें।
    नोट: रुचि के प्रोटीन के आणविक भार के अनुसार जेल का प्रतिशत चुनें।
  3. जेल को 100 वोल्ट पर ~ 1 घंटे के लिए बफर चलाने में जब तक लोडिंग डाई जेल के निचले भाग में न हो।
    नोट: रन टाइम उपयोग किए गए उपकरण या जेल के प्रकार और प्रतिशत के अनुसार भिन्न हो सकता है।
  4. जेल की छवि। दाग-मुक्त जैल की छवियों का उपयोग इम्यूनोब्लोट्स के लिए लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
  5. 80 V पर 1.5 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 V पर रात भर पीवीडीएफ झिल्ली का उपयोग करके जेल को स्थानांतरित करें।
  6. आरटी पर 1 घंटे के लिए बफर को अवरुद्ध करने में झिल्ली को अवरुद्ध करें।
  7. आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एंटीबॉडी बफर में विशिष्ट एंटीबॉडी (तालिका 2) के लिए झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  8. बफर धोने में झिल्ली को धोएं और आंदोलन के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए उपयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी (तालिका 2) के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  9. बफर धोने में झिल्ली को धोएं और विकसित समाधान और कैमरा-आधारित इमेजर का उपयोग करके झिल्ली की छवि बनाएं। वैकल्पिक रूप से, झिल्ली विकसित करने के लिए एक्स-रे फिल्म का उपयोग करें।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल लागत प्रभावी तरीके से वातानुकूलित माध्यम की बड़ी मात्रा से एक्सोसोम के शुद्धिकरण के लिए उपयुक्त है। प्रक्रिया अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सुसंगत है। चित्र 1 माउस प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट के कल्चर माध्यम से शुद्ध एक्सोसोम की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) छवि दिखाता है। चित्रा 2 कैननिकल एक्सोसोमल मार्करों के प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न और साइटोसोलिक (एलडीएच) और ईआर (कैलनेक्सिन) प्रोटीन दूषित पदार्थों की अनुपस्थिति को दर्शाता है। चित्रा 3 सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट के बाद कैननिकल एक्सोसोमल मार्करों (एलिक्स, सीडी 9 और सीडी 81) के वितरण को दर्शाता है।

Figure 1
चित्रा 1: माउस प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट के संस्कृति माध्यम से अलग एक्सोसोम की प्रतिनिधि टीईएम छवि। इन नैनोपुटिकाओं के अपेक्षाकृत समान आकार दिखाए गए हैं। काली रेखाओं के पार व्यक्तिगत पुटिकाओं के व्यास को दर्शाता है। स्केल बार = 100 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक्सोसोम लाइसेट के इम्यूनोब्लॉट्स ने एक्सोसोम, साइटोसोलिक और ईआर मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जांच की। एलिक्स, सीडी 81, सीडी 9, फ्लोटिलिन 1, सिंडेकन 1, सिंटेनिन 1 (एक्सोसोम), साइटोसोलिक (एलडीएच), और ईआर (कैलनेक्सिन) मार्कर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक्सोसोम एक सुक्रोज घनत्व ढाल द्वारा अलग किए गए। अलग-अलग अंशों की जांच एक पश्चिमी धब्बा पर की गई, जिसमें एलिक्स, सीडी 9 और सीडी 81 के खिलाफ एंटीबॉडी थे। मार्करों के विभाजन पैटर्न के आधार पर, एक्सोसोम लगातार 3-6 अंशों में तलछट करते हैं, जो 1.096-1.140 ग्राम / एमएल के घनत्व के अनुरूप होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सुक्रोज (जी) सुक्रोज वर्किंग सॉल्यूशन (एमएल)
2.0 M 2.74 4.0
1.3 M 2.67 6.0
1.16 मीटर 2.38 6.0
0.8 M 1.37 5.0
0.5 M 0.86 5.0
0.25 मीटर 0.26 3.0

तालिका 1: सुक्रोज घनत्व ढाल समाधान।

प्रतिपिंड मेज़बान अतिथि कैटलॉग संख्या
CD9 मूषक बी.डी. बायोसाइंसेज; 553758
CD81 चूहा सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजीज SC-166029
Alix शशक डी'अज़ो प्रयोगशाला Alix
फ्लोटिलिन 1 चूहा बी.डी. बायोसाइंसेज; 610820
Syndecan1 शशक जीवन प्रौद्योगिकी 36-2900
Syntenin1 शशक मिलिपोर/सिग्मा AB15272
एलडीएच बकरा केमिकॉन AB1222
कैलनेक्सिन बकरा सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजीज SC-6465
चूहा-एचआरपी गधा जैक्सन इम्म। रेस लैब 112-035-003
माउस-HRP बकरा जैक्सन इम्म। रेस लैब 115-035-044
खरगोश-एचआरपी बकरा जैक्सन इम्म। रेस लैब 111-035-144

तालिका 2: प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी।

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Discussion

संस्कृति मीडिया से एक्सोसोम के सफल अलगाव के लिए एक महत्वपूर्ण कदम, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित है, वयस्क कंकाल की मांसपेशियों से प्राथमिक माउस फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की उचित स्थापना और रखरखाव है। इन संस्कृतियों को शारीरिक जैसी स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए कम ऑक्सीजन स्तर पर बनाए रखने की आवश्यकता है (कंकाल की मांसपेशियों में ओ 2 स्तर ~2.5 % है)। संस्कृति में कई बार पारित होने पर प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट विशेषताओं को बदल देंगे। इसलिए, आदर्श एक्सोसोम उपज के लिए कम मार्ग संख्या अनिवार्य है। शुद्ध एक्सोसोम को या तो प्रायोगिक उद्देश्यों के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जाना चाहिए या जरूरत पड़ने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट में जमे हुए रखा जाना चाहिए। प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम हर बार ताजा तैयार सुक्रोज समाधान का उपयोग है। विधि की एक सीमा यह है कि यह समय लेने वाला है, क्योंकि प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट आमतौर पर अन्य स्रावी कोशिकाओं की तरह एक्सोसोम की उच्च मात्रा का स्राव नहीं करते हैं। इसलिए, बड़ी संस्कृतियों को नियोजित किया जाना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप बड़ी मात्रा में वातानुकूलित मीडिया को संसाधित किया जाना है।

यहां उपयोग किए जाने वाले अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन का लाभ यह है कि यह एक स्केलेबल दृष्टिकोण (लीटर तक) का प्रतिनिधित्व करता है और प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट से एक्सोसोम को अलग करने की विधि है। बड़े वॉल्यूम (प्रति कॉलम 100 एमएल तक) के लिए एक वैकल्पिक विधि आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) है। यह विधि तेज है और एक्सोसोम से प्रोटीन को अलग कर सकती है। कॉलम पेलेट एक्सोसोम नहीं करता है, इसलिए आगे एकाग्रता या सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों की आवश्यकता होती है। एसईसी विधि के नुकसान में से एक यह है कि कॉलम को समय के साथ भरा जा सकता है और ओवरलोड किया जा सकता है। अन्य वर्तमान विधियां जैविक तरल पदार्थ (यानी, मूत्र, सीएसएफ, सीरम, प्लाज्मा) और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट की छोटी मात्रा के उपयोग पर आधारित हैं। हालांकि ये किट प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करते हैं, वे महंगे होते हैं और हमेशा शुद्ध एक्सोसोम की उच्च उपज का उत्पादन नहीं करते हैं। एक्सोसोम शुद्धिकरण के लिए उल्लिखित प्रोटोकॉल सीधा है और प्रयोगात्मक आवश्यकता के आधार पर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, पूरे ऊतकों और अंगों, या अन्य जैविक तरल पदार्थों पर लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

किसी भी लेखक के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एलेसेंड्रा डी'अज़ो जेनेटिक्स और जीन थेरेपी में ज्वैलर्स फॉर चिल्ड्रन (जेएफसी) संपन्न कुर्सी रखती हैं। इस काम को एनआईएच अनुदान R01GM104981, RO1DK095169 और CA021764, मेम्फिस के असीसी फाउंडेशन और अमेरिकी लेबनानी सीरियाई एसोसिएटेड चैरिटीज द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm dishes Midwest Scientific, TPP TP93100
15 cm dishes Midwest Scientific TP93150
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific, Pierce 23225
Bovine serum albumin Fraction V Roche 10735094001
CaCl2 Sigma C1016-100G
Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 Eppendorf 022620659/5427754008
Chemidoc MP imaging system BioRad 12003154
Collagenase P Sigma, Roche 11 213 857 001 100 mg
cOmplete protease inhibitor cocktail Millipore/Sigma, Roche 11697498001
Criterion Blotter with plate electrodes BioRad 1704070
Criterion TGX stain-free protein gel BioRad 5678034 10% 18-well, midi-gel
Criterion vertical electrophoresis cell (midi) BioRad NC0165100
Dispase II Sigma, Roche 04 942 078 001 neutral protease, grade II
Dithiothreitol Sigma/Millipore, Roche 10708984001
Dulbecco’s Modification Eagles Medium Corning 15-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Corning 21-031-CV
Ethanol 200 proof Pharmco by Greenfield Global 111000200
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes Corning 352070
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028
Fluostar Omega multi-mode microplate reader BMG Labtech
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific, Gibco 35050-061
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144S-500
Immobilon-P Transfer membranes Millipore IPVH00010
Laemmli sample buffer (4x) BioRad 1610747
Magnesium acetate solution Sigma 63052-100ml
Non-fat dry milk LabScientific M-0842
O2/CO2 incubator Sanyo MC0-18M
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Gibco 15140-122 10,000 U/ml
Premium microcentrifuge tubes Fisher Scientific, Midwest Scientific AVSC1510 1.7 mL
Protected disposable scalpels Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker 372610
Running buffer BioRad 1610732
Sodium Chloride Fisher Scientific, Fisher Chemical S271-3
Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system Millipore S2GPU05RE 500 mL
Sterile cell strainer (70 mm) Fisher Scientific, Fisher brand 22-363-548
Sucrose Fisher Scientific, Fisher Chemical S5-500
SuperSignal west Femto Thermo Fisher Scientific 34096
Thin wall Polypropylene tubes Beckman Coulter 326823
Transfer buffer BioRad 16110734
Trichloroacetic Acid Sigma 91228-100G
Tris base BioRad 1610719
Triton-X100 solution Sigma 93443-100mL
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific, Gibco 12604-013 No phenol red
Tween-20 BioRad #1610781
Ultra-centrifuge Optima XPM Beckman Coulter A99842
Ultra-clear tube (14x89 mm) Beckman Coulter 344059
Ultra-clear tubes (25x89 mm) Beckman Coulter 344058
Water bath Isotemp 220 Fisher Scientific FS220

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References

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van de Vlekkert, D., Qiu, X., Annunziata, I., d'Azzo, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts. J. Vis. Exp. (159), e61127, doi:10.3791/61127 (2020).

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