Summary
Beroerte is een wereldwijd probleem met minimale behandelingsopties en geen huidige klinische therapie voor het regenereren van het verloren hersenweefsel. Hier beschrijven we methoden voor het creëren van een nauwkeurige fototrombotische beroerte in de motorische cortex van knaagdieren en daaropvolgende injectie van hydrogel-biomaterialen om hun effecten op weefselregeneratie na een beroerte te bestuderen.
Abstract
Beroerte is de belangrijkste oorzaak van invaliditeit en de vijfde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Ongeveer 87% van alle beroertes zijn ischemische beroertes en worden gedefinieerd als de plotselinge verstopping van een vat dat bloed naar de hersenen levert. Binnen enkele minuten na de blokkade beginnen cellen af te sterven en resulteren in onherstelbare weefselschade. De huidige therapeutische behandelingen richten zich op het verwijderen van stolsels of lysis om de reperfusie mogelijk te maken en ernstiger hersenletsel te voorkomen. Hoewel voorbijgaande hersenplasticiteit een deel van het beschadigde weefsel in de loop van de tijd kan redden, blijven aanzienlijke fracties van patiënten achter met neurologische tekorten die nooit zullen verdwijnen. Er is een gebrek aan therapeutische opties om neurologische tekorten veroorzaakt door een beroerte te behandelen, met de nadruk op de noodzaak om nieuwe strategieën te ontwikkelen om deze groeiende patiëntenpopulatie te behandelen. Injecteerbare biomaterialen worden momenteel ontworpen om de plasticiteit van de hersenen te verbeteren en het endogene herstel te verbeteren door de afgifte van actieve stoffen of stamcellen. Een methode om deze benaderingen te testen, is door een knaagdierslagmodel te gebruiken, het biomateriaal in de beroertekern te injecteren en de reparatie te beoordelen. Het kennen van de exacte locatie van de beroertekern is noodzakelijk voor de nauwkeurige behandeling na een beroerte, daarom heeft een beroertemodel dat resulteert in een voorspelbare beroertelocatie de voorkeur om de noodzaak van beeldvorming voorafgaand aan injectie te voorkomen. Het volgende protocol behandelt hoe een fototrombotische beroerte kan worden geïnduceerd, hoe een hydrogel op een gecontroleerde en nauwkeurige manier kan worden geïnjecteerd en hoe de hersenen kunnen worden geëxtraheerd en gecryopteerd terwijl het biomateriaal intact blijft. Daarnaast zullen we belichten hoe dezelfde hydrogelmaterialen kunnen worden gebruikt voor de co-afgifte van stamcellen. Dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar het gebruik van andere injecteerbare biomaterialen in de slagkern.
Introduction
Beroerte is de belangrijkste oorzaak van invaliditeit en de vijfde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten1. Ongeveer 87% van alle beroertes zijn ischemisch, terwijl een meerderheid van de resterende 13% hemorragisch is2. Een ischemische beroerte wordt gedefinieerd als de blokkering van de bloedstroom in een slagader naar het omliggende weefsel. Deze occlusie resulteert in zuurstofgebrek en daaropvolgende necrose die vaak leidt tot permanente invaliditeit bij overlevende patiënten. Hoewel er een daling is geweest in het sterftecijfer van beroerte3,zal de prevalentie ervan naar verwachting toenemen tot 3,4 miljoen mensen in 20304. Deze toename van gehandicapte overlevenden en de daaruit voortvloeiende economische last heeft geleid tot een push voor beroerte-onderzoek dat zich richt op mechanismen van neuraal herstel. Na een beroerte is er een ontstekingsperiode die leidt tot de vorming van een litteken dat voorkomt dat het necrotische gebied zich uitbreidt. Het gebied rond de necrotische kern wordt "peri-infarct" genoemd en er is een sterk bewijs dat de plasticiteit in deze regio, die verhoogde angiogenese, neurogenese en axonale kieming omvat, direct verband houdt met het waargenomen herstel in diermodellen en mensen5. Omdat er geen in vitro modellen zijn die de complexe interacties na een beroerte goed kunnen repliceren, zijn diermodellen essentieel voor beroerteonderzoek.
Er zijn verschillende in vivo modellen die kunnen worden gebruikt om ischemische beroerte te produceren. Een van de meest voorkomende modellen die bij muizen worden gebruikt, is occlusie van de middelste hersenslagader, of MCAo, door distale of proximale (via intra-arteriële filament) occlusie. Het proximale model, ook bekend als filament MCAo (fMCAo), resulteert meestal in grote ischemische beroertes die overal van 5% tot 50% van de hersenhelft omvatten, afhankelijk van het aantal factoren6. In deze modellen wordt een hechtdraad of filament van de interne halsslagader naar de basis van de middelste hersenslagader (MCA) gebracht en gedurende een bepaalde periode op zijn plaats gehouden. Deze methode voor occlusie, die tijdelijk of permanent kan worden gemaakt, produceert een infarct dat is gecentreerd in het striatum en al dan niet bovenliggende cortex kan omvatten6. De resulterende slaggrootte is zeer variabel en beeldvormingstechnieken, zoals laserdoppler, zijn vereist om de effectiviteit van de procedure bij elke muis te bevestigen. Intra-arteriële of intra-luminale filament occlusie die langer dan 30 minuten duurt, produceert slagen aan de grotere kant van het groottebereik. Sommige onderzoekers hebben zich gericht op kortere filamentocclusietijden, die aanzienlijke experimentele focus en laboratoriumvalidatie vereisen7. Filament MCAo-modellen bij muizen volgen vergelijkbare stadia van celdood, ischemische progressie en vorming van een peri-infarctgebied zoals gezien in gevallen van menselijke beroerte; de grotere beroertes lijken echter meer op de ziektetoestand van kwaadaardige herseninfarcten, die minder vaak voorkomen, minder behandelbare menselijke beroertes6. Ondertussen vereist distale MCA-occlusie een meer betrokken operatie en craniectomie. In dit model wordt het distale deel van de MCA dat langs het oppervlak van de hersenen loopt direct afgesloten met een hechtingsband of cauterisatie. In sommige variaties van de techniek zijn de halsslagaders eenzijdig of tijdelijk bilateraal afgesloten. Een voordeel van de distale MCAo is dat het een corticale slag produceert die minder variabel is in grootte dan het filamentmodel. Het distale model produceert echter een slechtere gedragsoutput als gevolg van transsectie van de externe halsslagader (ECA), wat ook een probleem is met fMCAo6.
Een alternatief beroertemodel dat bekend staat als minder invasief is het fototrombotische (PT) model. Het PT-model resulteert in een goed gedefinieerde locatie van ischemie en is geassocieerd met een hoge overlevingskans8. De techniek is gebaseerd op een lichtgevoelige kleurstof die intraperitoneaal wordt geïnjecteerd en die de intravasculaire foto-oxidatie mogelijk maakt door eenvoudigweg het gewenste weefsel met een licht of laser te bestralen9. Bij excitatie worden zuurstofradicalen gevormd die endotheelschade veroorzaken, die de aggregatie van bloedplaatjes en stolselvorming in het bestraalde gebiedactiveert 8,9. De strakke controle over slaggrootte en -locatie, evenals de hoge reproduceerbaarheid van het PT-model, maakt het ideaal voor het bestuderen van biomaterialen. Hoewel precisie mogelijk wordt gemaakt met behulp van een laser en stereotaxische coördinaten, zijn er enkele nadelen die dit model minder ideaal kunnen maken voor weinig studies. In tegenstelling tot het fMCAo-model kan het PT-beroertemodel niet worden gereperfuseerd. Daarom zouden materialen voor het onderzoeken van neuroprotectieve middelen die specifiek zijn voor schade na reperfusie of de mechanismen na reperfusie hier niet nuttig zijn8. Bovendien wordt door de microvasculaire belediging van het PT-model relatief kleine ischemische penumbra gezien. In plaats daarvan treedt lokaal vasogeen oedeem op, wat niet kenmerkend is voor een menselijke beroerte, waardoor dit model ongewenst is voor preklinische geneesmiddelenstudies gericht op het peri-infarctgebied6,8.
Het algemene doel van biomateriaalstrategieën bij beroerte is om bioactieve stoffen te leveren of om te fungeren als een surrogaat extracellulaire matrix voor de groei van hersenweefsel. Een strategie die we zullen onderzoeken met behulp van onze methoden is om hydrogel rechtstreeks in de beroertekern af te leveren, in tegenstelling tot het peri-infarctweefsel waar veel huidige celtherapieën worden geleverd10. De reden voor deze aanpak is dat levering in het necrotische weefsel in de kern zal voorkomen dat het omliggende gezonde of herstellende weefsel wordt verstoord. We gaan ervan uit dat diffusie van alle actieve stoffen die in het biomateriaal zijn opgenomen, het peri-infarct vanuit de kern kunnen bereiken, vooral omdat we vinden dat de afgifte van hydrogel-biomaterialen de dikte van het gliale litteken vermindert11. Dit is belangrijk omdat is aangetoond dat het peri-infarctgebied neuroplasticiteit vertoont na een beroerte, waardoor het een aantrekkelijk doelwit is. Bovendien kan de levering van een surrogaatmatrix aan de beroertekern worden geladen met angiogene12 of neurogene13 factoren om de vorming van nieuw weefsel te begeleiden, evenals cellen voor de bevalling14. De celafgifte wordt sterk verbeterd door het gebruik van een matrix omdat het cellen beschermt tegen de harde injectiekrachten en de lokale omgeving die aanwezig zijn tijdens de bevalling, en differentiatie en engraftment aanmoedigt15.
Deze injecteerbare therapeutische biomaterialen hebben klinische relevantie in beroertetoepassingen, omdat er momenteel geen medische therapieën zijn die neuronaal herstel na een beroerte stimuleren. De onderliggende neurale circuits die betrokken zijn bij herstel liggen in hersenweefsel dat grenst aan de beroertekern16, terwijl de beroertekern zelf verstoken is van levensvatbaar neuraal weefsel. We verwachten dat het leveren van een biomateriaal in de necrotische beroertekern potentieel heeft om het aangrenzende weefsel te stimuleren in de richting van regeneratieve processen via een aantal eerder genoemde mechanismen, waaronder depotafgifte van groeifactoren13, stimulatie van weefselgroei en bevordering van herstel van de ontwikkeling van hersenweefsel11,12, verandering van immuunresponsen17en levering van van stamcellen afgeleide therapeutica14, 18. Om de mogelijkheid van deze toepassingen effectief te bestuderen, is echter een consistente en reproduceerbare methode nodig voor het induceren van een beroerte en het injecteren van biomaterialen. Het PT-slagmodel maakt gebruik van technieken die nauwkeurige controle bieden over de oriëntatie en locatie van de slag. Een laser die aan het stereotaxische apparaat is bevestigd, leidt oriëntaties en pompen die aan de stereotaxische apparaten zijn bevestigd, regelen de injectiesnelheid van het materiaal zonder dat aanvullende vormen van beeldvorming nodig zijn. Daarom hebben we ervoor gekozen om de methoden te beschrijven voor het uitvoeren van een PT-beroerte in de motorische cortex van muizen en voor het injecteren van biomaterialen in de slagkern. Hier gebruiken we microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) hydrogels als biomateriaal voor injectie zonder toegevoegde cellen of groeifactoren. Daarnaast leggen we uit hoe we de hersenen met succes kunnen ophalen met intact biomateriaal en bespreken we immunochemische testen die worden gebruikt om de uitkomst van de beroerte met en zonder injectie van biomaterialen te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met IUCAC aan de Duke University en de University of California Los Angeles. 8 tot 12 weken oude mannelijke C57Bl / 6J-muizen werden gebruikt in deze studie. De dieren werden gehuisvest onder gecontroleerde temperatuur (22 ± 2 °C), met een licht-donkercyclusperiode van 12 uur en toegang tot gepelletiseerd voedsel en water ad libitum. Analgesie- en sedatieprotocollen worden beschreven als goedgekeurd door de IUCAC, maar kunnen verschillen van protocollen die in andere laboratoria worden gebruikt.
Dieren kunnen voortijdig worden geëuthanaseerd als ze overmatige rusteloosheid, vocalisatie (wat wijst op oncontroleerbare pijn), zelftrauma, verminderde of verminderde mobiliteit, fysieke tekenen van huidinfectie, verlies van eetlust en / of gewichtsverlies van meer dan 10% -15% als gevolg van de overlevingsoperatie ervaren. Er zijn geen verwachte nadelige effecten van injectie van de gel, omdat het een samengesteld polymeer is dat van nature in de hersenen voorkomt. Dieren moeten dagelijks worden gecontroleerd, ook in het weekend en op feestdagen, en om de dag opnieuw worden gewogen. Studies van ons laboratorium en anderen hebben geen tekorten gevonden in verzorging, verlies van lichaamsgewicht of tekenen / symptomen van ontwenning of chronische stress bij muizen na deze kleine corticale of subcorticale beroertes. Als dieren tekenen van lokale hoofdwondinfectie vertonen, moeten ze worden geëuthanaseerd. Dieren moeten ook worden gecontroleerd op slechte verzorging, wondconditie en bewijs van gevechten tussen dieren (rugwonden). Als er aanwijzingen zijn voor vecht- of wonddehiscentie, moeten de dieren eerst worden behandeld nadat contact is opgenomen met de dierenartsen. Vaak gaat het om antibiotica in het water en/of lokale topische antibioticatoepassing. Als deze maatregelen geen genezing opleveren, moeten dieren worden geëuthanaseerd.
1. Voorbereiding van materialen en instrumenten
- Bereid fototrombotische kleurstof voor voorafgaand aan de operatie. Weeg 15 mg Rose Bengal af in een microcentrifugebuis van 2 ml.
LET OP: Rose Bengal kan ernstige oogschade / irritatie veroorzaken.- Los de Rose Bengal op in 1,5 ml steriel gefilterde 1x PBS om een werkconcentratie van 10 mg / ml te maken.
- Vortex de buis totdat er geen klonten zichtbaar zijn, wat aangeeft dat de kleurstof volledig is opgelost, en dek vervolgens af met folie tot verder gebruik.
OPMERKING: De benodigde hoeveelheid kleurstof is afhankelijk van het aantal muizen. Kleurstof wordt intraperitoneaal IP geïnjecteerd in een concentratie van 10 μL/g, bijvoorbeeld 200 μL voor een muis van 20 g.
- Schakel het verwarmingskussen in om de lichaamstemperatuur van de muis te handhaven tijdens de anesthesie (37 °C).
- Bereid een autoclaaf schaar, tang, katoen, oogzalf, chirurgische lijm of hechtmateriaal, een blauwe of zwarte chirurgische marker en steriele alcohol- en bèta-jodiumdoekjes voor. Bereid de botboor voor met gesteriliseerde boorkoppen.
- Zet de kraalsterilisatie aan op 160 °C om sterilisatie van instrumenten tussen muizenoperaties mogelijk te maken. Zet een conische buis van 50 ml steriele zoutoplossing of 1x PBS-oplossing opzij voor later gebruik bij het handhaven van een gehydrateerd operatiegebied.
- Bevestig de laser aan het stereotaxische apparaat. Draag een laserveiligheidsbril en meet het vermogen van de laser (mW).
LET OP: Gebruik een laserveiligheidsbril wanneer de laser tijdens de procedure wordt ingeschakeld.- Pas de stroom op de laserconsole aan volgens de laserproductie-instructies totdat het laservermogen 10 mW aangeeft en stel de stroom in als een vooraf ingestelde op de startschermconsole. Pas vervolgens de stroom opnieuw aan om een andere vooraf ingestelde instelling vast te stellen waarbij het laseruitgangsvermogen 40 mW afgeeft. Schakel nu de laser uit tot verder gebruik.
OPMERKING: De 10 mW wordt gebruikt om de laser voorafgaand aan gebruik te oriënteren.
- Pas de stroom op de laserconsole aan volgens de laserproductie-instructies totdat het laservermogen 10 mW aangeeft en stel de stroom in als een vooraf ingestelde op de startschermconsole. Pas vervolgens de stroom opnieuw aan om een andere vooraf ingestelde instelling vast te stellen waarbij het laseruitgangsvermogen 40 mW afgeeft. Schakel nu de laser uit tot verder gebruik.
- Bereid een schone kooi voor muizen voor na de operatie. Plaats de muis vervolgens in de inductiekamer met een isofluraanconcentratie van 4% om hem te verdoven totdat de spontane beweging stopt en de ademhaling langzaam en gestaag verloopt.
- Eenmaal in slaap, weeg de muis om te bepalen hoeveel Rose Bengale kleurstof moet worden geïnjecteerd. Breng vervolgens de muis over en zet deze vast aan het stereotaxische apparaat met een onderhoudsisofluraanconcentratie van 1,5%.
OPMERKING: Toenemende isofluraanconcentraties kunnen vaten verwijden en voldoende occlusie of consistent grote slagen tussen muizen voorkomen. - Breng oogzalf aan op beide ogen.
OPMERKING: Let op de ademhaling en temperatuur tijdens de procedure en knijp af en toe in de tenen om ervoor te zorgen dat de muis niets kan voelen.
2. Fototrombotische beroerte model9
- Scheer de vacht van het hoofd van de muis en bereid het gebied aseptisch voor met behulp van een alcoholdoekje gevolgd door een bèta-jodiumdoekje. Herhaal dit drie keer.
OPMERKING: Gebruik indien nodig een extra alcoholdoekje aan het einde om alle bèta-jodium te verwijderen, omdat dit huidirritatie veroorzaakt, waardoor de muizen hun schedel na de operatie jeuken. - Maak met behulp van een kleine operatieschaar een laterale incisie tussen de oren naar de ogen, ongeveer 1-2 cm. Doe dit door de huid met een tang naar boven te trekken om een tent te creëren, eenmaal naar beneden te knippen, vervolgens de schaar in de opening te steken en een doorlopende middellijnincisie te maken.
- Scheid de huid en druk lichtjes op de pariëtale botten met de tang om de bregma te lokaliseren. Markeer de bregma met een stip met behulp van de chirurgische marker.
OPMERKING: Botfragmentbeweging benadrukt de frontale rand van de pariëtale botten. De bregma is het middelpunt waar de frontale en pariëtale botfragmenten elkaar ontmoeten(figuur 1A). - Draag een laserveiligheidsbril en beweeg de laser over de schedel van de muis en bevestig het stereotaxische apparaat in een hoek van 90 °. Selecteer de vooraf ingestelde 10 mW en schakel de laser in.
- Pas de x- en y-as van de laser aan totdat deze direct boven de bregma ligt. Reset de x en y op de digitale displayconsole en verplaats de laser vervolgens 1,8 mm links van de bregma. Breng de laser nu zo dicht mogelijk bij de schedel zonder deze de schedel te laten raken.
- Verplaats de laser naar 2,2 mm links van de bregma om ervoor te zorgen dat deze zonder obstakels kan bewegen. Schakel de laser uit.
- Injecteer de juiste hoeveelheid Rose Bengal dye intraperitoneaal (IP) met behulp van een wegwerpnaald van 29 G. Start onmiddellijk een timer gedurende 7 minuten om kleurstof systemisch te laten circuleren. Selecteer de voorinstelling voor 40 mW zonder de laser in te schakelen.
OPMERKING: Eenmaal comfortabel met de procedure, kan de kleurstof worden geïnjecteerd vóór de aseptische voorbereiding van de muis en klaar zijn voordat de 7 minuten voorbij zijn om tijd te besparen. - Schakel de laser (40 mW) in wanneer de timer van 7 minuten afgaat, terwijl u een laserveiligheidsbril draagt, en stel een timer van 10 minuten in.
- Verplaats de laser na 10 minuten naar 2,2 mm links van de bregma zonder deze uit te schakelen en stel nog een timer van 10 minuten in.
- Zodra de tweede timer van 10 minuten is afgegaan, verandert u de laser terug naar 10 mW en verplaatst u de laser naar 2,0 mm links van de bregma. Markeer deze plek met de chirurgische marker. Schakel vervolgens de laser uit.
- Til de laser op en ontgrendel deze vanuit de hoek van 90°, zodat deze van de muis kan worden verwijderd. Breng op dit punt de steriele zoutoplossing of PBS aan met katoen als het operatiegebied droog is.
- Boor in kleine uitbarstingen op het 2,0 mm-merkteken loodrecht op het oppervlak van de schedel.
OPMERKING: Wees voorzichtig om langzaam te boren om te voorkomen dat je te diep boort en de hersenen raakt. Er zal een lichte daling / verandering in weerstand zijn zodra de boor door de schedel is gegaan en boren kan bloedingen veroorzaken.- Gebruik katoen om overtollig bloed te absorberen. Het is typisch om wat bloed te zien van geknepen slagaders in de schedel na het boren - overmatig bloed betekent dat de boor de hersenen raakt. Als dit gebeurt, registreert u de muis-id en gaat u verder.
- Plaats een klein doekje naast de muis. Trek met behulp van de tang de huid dicht bij elkaar om je voor te bereiden op het lijmen.
OPMERKING: Hechten kan hier in plaats daarvan worden gedaan. Hechten vereist meestal slechts 3 hechtingen.- Pak met de tang de twee zijden van de huid vast en trek ze samen en omhoog. Dep grote druppels chirurgische lijm aan het einde van de punt op het doekje voordat u het op de muis aanbrengt.
- Breng de chirurgische lijm spaarzaam aan en houd de huid samen met een tang gedurende 10 s. Ga door totdat er geen zichtbare openingen zijn.
OPMERKING: De lijm komt er snel uit – knijp niet in de fles. Vermijd het lijmen van de huid op de schedel of het krijgen van lijm in het oog.
- Plaats de muis na het lijmen of hechten in de nieuwe kooi om te herstellen van de anesthesie. Het duurt 5-10 minuten voordat het dier herstelt en het helpt om de helft van de kooi op een verwarmingskussen te laten rusten.
3. Sham beroerte operatie
- Voer alle procedures uit die identiek zijn aan de hierboven beschreven bewerking in rubriek 2, behalve injecteer 1x PBS of zoutoplossing in plaats van Rose Bengale dye.
4. Injectie van hydrogel of andere biomaterialen
- Voer de injectie van biomaterialen uit op een door de gebruiker gedefinieerd tijdstip. In dit experiment werden injecties uitgevoerd tussen 5 en 7 dagen na de beroerte. 2 - 6 μL hydrogel worden geïnjecteerd (door de gebruiker gedefinieerd).
- Schakel het verwarmingskussen in om de lichaamstemperatuur van de muis te handhaven tijdens de anesthesie (37 °C).
- Bereid geautoclaveerde scharen, tangen, katoen, oogzalf van dierenartsen, chirurgische lijm of hechtmateriaal en steriele alcohol- en bèta-jodiumdoekjes voor. Bereid de botboor voor met steriele boorkoppen en de 25 μL glazen Hamilton spuiten met metalen 30 G naalden.
- Zet de kraalsterilisatie aan op 160 °C om sterilisatie van instrumenten tussen muizen mogelijk te maken.
- Bevestig de injectiepompen aan het stereotaxische apparaat. Stel het debiet in op 1 μL/min en stel het volume in op 4 μL.
- Bereid een schone kooi voor de muizen voor na de operatie.
- Plaats de muis in de inductiekamer met een isofluraanconcentratie van 4% om hem te verdoven totdat de spontane beweging stopt en de ademhaling langzaam en gestaag verloopt.
- Eenmaal in de slaapstand brengt u de muis over op het stereotaxische apparaat met een onderhoudsisofluraanconcentratie van 1,5%.
- Breng de oogzalf van de dierenarts aan op beide ogen.
- Scheer elke vacht die mogelijk opnieuw van het hoofd van de muis is gegroeid en bereid het gebied aseptisch voor met behulp van een alcoholdoekje gevolgd door een bèta-jodiumdoekje. Herhaal dit drie keer.
OPMERKING: Gebruik indien nodig een extra alcoholdoekje aan het einde om alle bèta-jodium te reinigen, omdat dit huidirritatie veroorzaakt en ertoe leidt dat de muizen hun schedel jeuken na de operatie.
- Open met de kleine schaar en/of tang de huid boven de hersenen. Gebruik katoen met steriele zoutoplossing of PBS om vuil van de schedel te reinigen. Een wit-gele cirkel (de slag, figuur 1B) en het braamgat van de boor zullen zichtbaar zijn. Als het dode weefsel niet zichtbaar is, is er waarschijnlijk geen beroerte opgetreden. Als het braamgat niet gecentreerd is boven de slag, boor dan opnieuw om het te centreren.
- Plaats de injectiepomp over de muis en vergrendel op 90°. Reinig de spuit met steriele zoutoplossing of PBS-oplossing voordat u het materiaal teruglaadt.
- Eenmaal schoon, demonteer de glazen spuit zodat er geen naald is. Laad de spuit terug met behulp van een 25 μL verdringerpipet met de 10 μL hydrogel (of ander biomateriaal hier met of zonder cellen).
- Duw met behulp van de zuiger van de spuit de gel helemaal naar de voorkant van de spuit. Monteer vervolgens de spuit opnieuw en blijf duwen totdat de gel zichtbaar uit de naald straalt.
- Plaats de spuit op de pomp. De achterkant van de pomp moet mogelijk worden aangepast zodat de spuit past. Doe dit door het debiet aan te passen tot 30 μL/min, selecteer Terugtrekking of Injecteren afhankelijk van de richting waarin het moet bewegen en druk vervolgens op Start. Druk op Stoppen wanneer de achterkant van de pomp zich op de juiste locatie bevindt.
- Schroef de achterkant van de pomp zodat de spuit goed vastzit. Als er eerder aanpassingen zijn gedaan, zorg er dan voor dat het debiet is ingesteld op 1 μL/min en is ingesteld om te injecteren.
- Beweeg de pomp in de x- en y-richting om hem over het gat te oriënteren. Beweeg de pomp naar beneden in de z-richting totdat de naald van de spuit de bovenkant van het gat raakt.
- Reset de z op de digitale displayconsole. Beweeg vervolgens de spuit naar beneden in de z-richting 0,750 mm. Als de spuit buigt of er weerstand is, is de schedel genezen of niet volledig doorboord en moet deze opnieuw worden geboord.
- Druk op Start op de pompconsole om 4 - 6 μL van de hydrogel te injecteren met een snelheid van 1 μL/min.
- Stel een timer van 5 minuten in wanneer de pomp stopt met injecteren om de gel te laten beginnen met crosslinken.
- Trek na 5 minuten de spuit langzaam omhoog door aan de z nob te draaien. Kijk of er per ongeluk materiaal uit het gat wordt getrokken of lekt. Ontgrendel de pomp en beweeg deze weg van de muis wanneer de naald ver genoeg van de schedel verwijderd is.
- Sluit met een tang, chirurgische lijm of hechtingen de huid boven het hoofd. Plaats de muis in de schone kooi en observeer het herstel ervan. Het duurt ongeveer 5 - 10 minuten voordat de muis herstelt van de anesthesie.
5. Perfusie en monsterverzameling
- Verdoof de muis met isofluraan.
- Fixeer het dier in rugligging en open de buikholte met een mediane snee. Optioneel klemt u de dalende abdominale aorta vast om minder fixatief en PBS te gebruiken.
- Knip het diafragma open en beweeg de zijkanten van de ribbenkast omhoog om de borstholte te openen. Steek een perfusiecanule in de linker ventrikel en snijd een opening in het rechter atrium. Begin langzaam te perfuseren met 10-20 ml PBS of totdat de vloeistof half helder is.
- Eenmaal helder, schakel over naar 4% PFA voor nog eens 10 - 20 ml. Door de armen los te maken, kunnen ze samentrekken als de PFA infundeert. Zodra ze stoppen met bewegen, wacht je op nog eens 30 s.
- Onthoofd het dier en trek de huid terug om de schedel bloot te leggen. Gebruik een stompe, dunne tang om voorzichtig de stukjes van de schedel te verwijderen om de hersenen bloot te leggen. Speciale zorg moet worden genomen bij het verwijderen van de schedel boven de plaats van de beroerte. Een kleine chirurgische schaar kan hier worden gebruikt om de schedel weg te snijden. De grootste uitdaging is dat gel vast komt te zitten aan de schedel en uit de hersenen komt als de schedel wordt verwijderd.
- Zodra de hersenen zijn losgemaakt, plaats in 10 - 15 ml van 4% PFA 's nachts (niet langer dan 24 uur).
- Verplaats de hersenen van PFA naar 30% sucrose de volgende dag. De hersenen zijn klaar voor cryosectie zodra het naar de bodem zinkt (ongeveer 2 - 3 dagen). Het kan op dit punt ook worden achtergelaten voor opslag.
6. Cryosectie en kleuring
- Haal de hersenen uit sucrose en plaats ze op een glazen dia. Snijd een klein deel van de achterkant van de hersenen af met een scheermesje om een plat gedeelte te maken dat op een klauwplaat kan worden gemonteerd.
- Plaats een klodder Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) op de klauwplaat en plaats vervolgens de hersenen, plat naar beneden, op de klauwplaat in de OCT. Plaats dit monster op droogijs tot het bevroren is of in de cryostaat op het vriesblok.
OPMERKING: OCT kan worden toegevoegd om de hersenen volledig te omvatten om te voorkomen dat het materiaal zich tijdens het doorsnijden van de hersenen scheidt.
- Plaats een klodder Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) op de klauwplaat en plaats vervolgens de hersenen, plat naar beneden, op de klauwplaat in de OCT. Plaats dit monster op droogijs tot het bevroren is of in de cryostaat op het vriesblok.
- Snijd de hersenen serieel op een cryostaat bij -20 °C bij 30 μm dikke secties over 10 met gelatine bedekte dia's. Zorg ervoor dat u bij het sectieen de hydrogel niet verliest. Als dit deel moeilijk is, plaats dan wat OCT op de bovenkant van de hersenen over de gel(figuur 3). Bewaren bij -80 °C tot nader gebruik.
- Haal dia's uit de -80 °C en plaats ze op een vlekkenbak om ze te laten drogen. Dia's die niet zijn ingevroren maar gewoon doorsneden, kunnen ook onmiddellijk worden gekleurd.
- Teken met een hydrofobe pen een cirkel rond de hersenschijfjes op de dia. Eenmaal droog, rehydrateer de hersenschijfjes met 1x gefilterde PBS en plaats op een shaker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Dit kost ongeveer 1 ml buffer per dia met 9 - 12 hersensecties.
- Was de glaasjes met 1x gefilterde PBS gedurende 5 min bij kamertemperatuur, herhaal dit drie keer.
- Blokglijden gedurende 30 minuten tot een uur met 10% ezelserum in 0,01% PBS-Triton X bij kamertemperatuur op de buikdanseres. Dit kost ongeveer 200 μL per dia.
- Incubeer het primaire antilichaam in 10% ezelserum met 0,01% PBS-Triton X 's nachts bij 4°C op een shaker. Test eerst primaire antilichamen om de juiste concentraties te bepalen. Hier werden GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500) (Figuur 4) gebruikt.
- Was glaasjes met 1x gefilterde PBS de volgende dag gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, herhaal dit drie keer.
- Incubeer met secundair antilichaam in 10% ezelserum in 0,01% PBS-Triton X en DAPI gedurende 2 uur op de laboratoriumschudder bij kamertemperatuur. 1:1.000 werd gebruikt voor alle secondaries en DAPI.
- Was de platen gedurende 5 minuten met 1x gefilterde PBS.
- Laat secties drogen bij kamertemperatuur in het donker. Dit kan 20 minuten tot 4 uur duren; het plaatsen van de dia's in een exsiccator kan het proces versnellen.
- Uitdroging glijdt in oplopende concentraties alcohol (1 min per oplossing) van 50%, 70%, 95%, 100% en 100%.
- Ontvet in het eerste bad van xyleen gedurende 1 min, dan het tweede bad van xyleen gedurende 5 minuten.
- Haal de dia's er snel één voor één uit en voeg montagemedium toe terwijl hersensecties nat zijn met xyleen. Voeg er snel een glazen afdekplaat aan toe. Gebruik een afdekplaat met de juiste lengte en dikte die nodig is voor de dia en microscoop die respectievelijk voor beeldvorming worden gebruikt.
- Verwijder eventuele bubbels onder de deklip door zachtjes met een pipetpunt in een naar buiten gerichte beweging vanuit het midden van de dia te drukken. Laat DPX 4 uur drogen tot een nacht in het donker bij kamertemperatuur.
- Gebruik een scheermesje om gedroogd bevestigingsmedium dat op de dia's is gemorst eraf te schrapen. Veeg dia's af met lensreiniger. Dia's kunnen nu worden afgebeeld met fluorescentiemicroscopie.
OPMERKING: Het is het beste om dia in het donker of bij 4 °C op te slaan totdat de beeldvorming is voltooid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van deze methode was om aan te tonen hoe biomaterialen in de hersenen kunnen worden geïnjecteerd na een beroerte. Een fototrombotisch model met rose bengal en een 520 nm laser werd gebruikt voor een gecontroleerde oriëntatie van de beroerte laesie in zowel grootte als locatie. Vijf dagen na een beroerte kon het infarct worden gevisualiseerd tijdens de operatie(figuur 1B)en door TTC en beeldvorming van IHC-gekleurde dia's(figuur 2). Een toename van de laserdiameter met een 2x lens leidde tot een visuele toename van de slaglaesie die meer dan 2,5 mm overspande versus een enkele sectie van 1 mm met alleen de laser (figuur 2). Mortaliteit tijdens een operatie met het PT-model trad zelden op, minder dan 1%, als gevolg van de minimaal invasieve procedure. De dood na de operatie was ook laag en werd gezien bij minder dan 5% van de muizen.
Hydrogelmicrodeeltjes (HMP's) op basis van hyaluronzuur werden vijf dagen na de beroerte geïnjecteerd(figuur 3). De HMP's gloeien na injectie in de beroertelaesie om microannealed deeltjes (MAP) te vormen met een poreuze scaffold die celmigratie naar de beroertekern mogelijk maakt(figuur 4). Tien dagen na injectie werden muizen doordrenkt met 4% PFA en hun hersenen werden geëxtraheerd, 's nachts in 4% PFA geplaatst en vervolgens gedurende twee dagen in 30% sucrose voordat ze werden ingevroren en gesneden voor IHC-kleuring en analyse.
Eerder werk in ons laboratorium toonde de injectie van MAP-hydrogels in de beroertelaesie vijf dagen na beroerte26. Injectie van hyaluronhydrogels die overeenkomen met de modulus van de cortex leidde tot een significante afname van de reactieve astrocyten in het peri-infarct en in de MAP-gel. Bovendien drukten microglia die zich ook binnen de hydrogel bevonden pro-repair M2-markers uit. Dit suggereert dat MAP hydrogel de reactiviteit van astrocyten in slechts twee dagen na injecties kan verminderen en een meer ontstekingsremmende omgeving met pro-herstel astrocyten en microglia kan bevorderen(figuur 5).
Figuur 1: Schematische weergave van bregma en lokalisatie van beroerte. (A) De pariëtale kwabben ontmoeten elkaar aan de bovenkant om de bregma te vormen. De laserplaatsing was gecentreerd 2,0 mm links van de bregma. (B) Visuele conformatie van beroerte en braamgat werden 5 dagen na beroerte gezien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Coronale secties die het infarct overspannen. (A) Seriële IHC-hersensecties 5 dagen na beroerte, beroerte met laser alleen (boven) en 2x lens (onder). Plakjes waren 30 μm dik met elke sectie 300 μm verwijderd van de vorige sectie. (B) Vergrote IHC beits, 500 μm scale-bar. Kernen (DAPI) worden weergegeven in blauw, astrocyten (GFAP+) in rood en microgliaal (Iba1+) in groen, 4x vergroting. (C)Delen van hersenen gekleurd met TTC om laesievolume 5 dagen na beroerte te visualiseren, 1 mm dikke secties met 1 cm schaalbalk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Injectie en visualisatie van biomateriaal. (A)Visueel van gelinjectie tijdens de operatie. (B)De gel kan met het oog worden gevisualiseerd bij het verwijderen van de schedel. (C)Eenmaal bevroren en gemonteerd, was de gel zichtbaar in de hersenen tijdens het snijden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunohistochemische vlekken van beroerte alleen in vergelijking met beroerte met hydrogels. (A) Schema van gecryopectioneerde hersenen van 30 μm dik. Verschillende secties in het midden werden gekozen voor beeldanalyse. (B) Beroerte alleen, immunohistochemie (IHC) vlekken 15 dagen na beroerte. Astrocyten (GFAP+) cellen worden getoond in rood, microglia (Iba1+) zijn groen en vaten (GLUT1+) zijn wit. Beroerte + Hydrogel conditie, IHC 10d post injectie, 15 dagen na beroerte. Astrocyten (GFAP+) cellen worden getoond in rood, microglia (Iba1+) zijn groen, hydrogel materiaal is wit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Effecten van microporeuze gegloeide deeltjeshydrogels op reactieve astrocyten en microglia na een beroerte. (A) Schema van experimentele tijdlijn waarbij pijl slagdag betekent, + injectiedag betekent en x opoffering en analysetijdpunt betekent. (B) Schema van analyse-instellingen die laten zien waar secties werden afgebeeld en geanalyseerd. (C) IHC-beelden die astrocytenreactiviteit tonen via pERK, S100b, GFAP. DKwantificering van pERK/GFAP procent van astrocyten die zeer reactief waren. (E) Kwantificering van S100b/GFAP procent van astrocyten die zeer reactief waren. (F) IHC-beelden van microglia-reactiviteit door CD11b-, Arg1- en iNOS-kleuring. (G) Kwantificering van iNOS/Dapi voor de bepaling van microgliaal pro-inflammatoir fenotype. (H) Kwantificering van Arg1/Dapi voor de bepaling van microgliaal pro-repair fenotype. Alle schaalbalk = 100 μm. Statistische analyse werd gedaan in GraphPad Prism. * aangegeven gegevens werden geanalyseerd met behulp van Tukey post-hoc test en een 95% betrouwbaarheidsinterval met P<0,05. Individuele p-waarden gaven de T-test aan. Dit cijfer is gewijzigd van ref.26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier demonstreren we een gemakkelijk reproduceerbaar, minimaal invasief, permanent beroertemodel en beschrijven we hoe een biomateriaal vijf dagen na de beroerte in het infarct kan worden geïnjecteerd. Het gebruik van de fototrombotische kleurstof Rose Bengal en een 520 nm gecollimeerde laser verbonden met het stereotaxische apparaat geeft ons de mogelijkheid om de slag op de motorische cortex van de muis met verbeterde precisie te positioneren. Vijf dagen na de beroerte is de locatie van het infarct met het oog zichtbaar in het centrum van de bestraling, 2,0 mm medio-lateraal aan de bregma. Hydrogel wordt vervolgens nauwkeurig in de slagkern geïnjecteerd met behulp van spuitpompen. Mortaliteit tijdens de operatie en na een beroerte in dit model is vrijwel afwezig, met slechts een handvol muizen die na de operatie sterven als gevolg van anesthesiologische complicaties. Ondanks de voordelen van het gebruik van PT-beroerte voor biomateriaaltoepassingen, zijn er verschillende biologische beperkingen en technische problemen die moeten worden aangepakt.
In termen van biologische beperkingen is PT geen beroertemodel dat de optie biedt voor cerebrale reperfusie, een proces dat spontaan kan optreden bij menselijke beroertes of als reactie op endovasculaire stolselrecuperatie / lysis. Bovendien, in tegenstelling tot het MCAo-model dat de etiologie van de meeste menselijke beroertes nabootst door een groot hersenvat af te sluiten, schaadt PT de bloedstroom door veel kleinere bloedvaten. Een technische moeilijkheid van het injecteren van hydrogel-biomaterialen is hun neiging om zich tijdens de operatie aan de spuit of aan de schedel te hechten tijdens extracties. Het ontwerpen van een hydrogel die tijdens de injectie als vloeistof achterblijft en vervolgens in situ gels, kan het eerste probleem aanpakken; voorkomen dat de gel aan de dura mater blijft plakken, is echter vaak onvermijdelijk omdat de injectieplaats en de beroertekern zich aan het oppervlak van de hersenen bevinden. Dit kan het moeilijk maken om het hersenweefsel te extraheren terwijl het biomateriaal intact blijft. Als zodanig moet speciale zorg worden besteed aan het verwijderen van stukjes schedel uit de hersenen om ervoor te zorgen dat de dura mater niet met de schedel optilt en onbedoeld de gel ontwortelt. Cryosectie van hersenen vereist ook technische vaardigheid omdat zowel het hanteringsproces als de mestranssectie de gel gemakkelijk van het omliggende weefsel kunnen losmaken, waardoor de gegevensverzameling met betrekking tot celinfiltratie wordt beperkt. Onthechting wordt verergerd wanneer het materiaal niet volledig is geïntegreerd met het weefsel. Het voorbereiden van het monster met OCT creëert een versterkingsschaal die helpt om de materiaalscheiding tijdens het snijden te minimaliseren.
Voordat u biomaterialen injecteert, raden we aan de gewenste slaggrootte te optimaliseren, afhankelijk van de knaagdierstam en laboratoriumopstelling. Kleinere of grotere infarcten kunnen worden gemaakt door drie hoofdparameters aan te passen: laseruitvoerintensiteit, straalvergroting en bestralingstijd. Andere factoren waarvan ook is aangetoond dat ze de slaggrootte beïnvloeden, zijn de concentratie van isofluraan19 en de hoeveelheid tijd dat de kleurstof mag circuleren voorafgaand aan de bestraling. Met betrekking tot de intensiteit van de laseruitvoer (vermogen / gebied of mW / cm2), vonden we dat een laservermogen van 10 mW voldoende was om een klein infarct te produceren met een horizontale diameter die iets kleiner was dan die van de laserstraal. Een hoger laservermogen leverde marginaal bredere maar aanzienlijk diepere infarcten op (gegevens niet getoond) omdat de laserstraal een gaussisch bestralingsprofiel had. Door de intensiteit te verhogen, kan het middelpunt van maximale bestraling dieper langs de schedel doordringen en de lichte toename van de penetratie van de spotgrootte van de laser veroorzaken. Andere slagmodellen hebben de schedel verdund door deze te schuren voordat licht of laser wordt aangebracht om de lichtpenetratie en de daaropvolgende reproduceerbaarheid van de stolling te vergroten met behoud van een lagere laserintensiteit20; dit kan echter bloedingen in de schedel veroorzaken en kost behoorlijk wat tijd tijdens de operatie en vaardigheid om onder de knie te krijgen zonder per ongeluk de hersenen te beschadigen in het proces. Vergelijkbaar met de intensiteit, nam het vergroten van de laserstraaldiameter ook de infarctgrootte toe; laserintensiteit en straaldiameter schalen echter niet lineair ten opzichte van elkaar, maar volgen de vergelijking, vermogensdichtheid = laservermogen (w)/ πr2, waarbij de straal van de straal is. In termen van bestralingstijd vonden we dat een minimum van 10 minuten nodig was om reproduceerbare slagen te produceren. Om de horizontale diameter van het infarct te vergroten en tegelijkertijd de verticale diepte constant te houden, hebben we de laser gedurende 10 minuten achtereenvolgens op aangrenzende locaties aangebracht. Om de invloed van de isofluraanconcentratie en de circulatietijd van rose bengal aan te pakken, ontdekten we dat 1,5% isofluraanconcentratie en 7 minuten circulatie na IP-injectie resulteerden in consistente vorming van beroertes. Deze vijf parameters werden geoptimaliseerd voor ons specifieke gebruik. We hadden een voldoende grote beroerte nodig om gedragsveranderingen te veroorzaken, maar niet interfereren met de subventriculaire zone, waar we het effect van ons materiaal op neurale voorlopercellen wilden bestuderen. Naast de slaggrootte moesten we ook het optimale gelvolume bepalen om te injecteren. Op zijn minst hadden we voldoende gel nodig om de slagholte volledig te vullen, omdat we ontdekten dat openingen tussen gel en omringend weefsel tot vergelijkbare resultaten leidden als onze controlegroepen, terwijl contact tussen gel en weefsel resulteerde in minder reactieve astrocyten en verhoogde cellulaire infiltratie. We kwamen tot een ondergrens van 4-6 μL gel, die geen nadelige effecten opleverde na injectie (ongepubliceerde gegevens).
Met betrekking tot het beoordelen van de uitkomst van de beroerte zijn er verschillende opties die verder gaan dan IHC-kleuring, zoals magnetische resonantie beeldvorming, gedragstests, histologische analyse en TTC (2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride) kleuring. Het wordt ten zeerste aanbevolen om TTC te gebruiken voor voorlopige optimalisatie van beroerte vanwege het gebruiksgemak en de onmiddellijke resultaten. Eerdere gedragstests in ons laboratorium hebben gekeken naar de cilindertest / spontane voorpoottaak, de rasterwandeltest en de pastatest12,21. Opgemerkt moet worden dat rotarod-testen geen significante afname van gedragsuitkomsten lieten zien nadat de PT-beroertemethode was geïmplementeerd (gegevens niet getoond). Gedragstests moeten dus zeer complexe taken beoordelen die aanzienlijke corticale input vereisen.
Hier demonstreerden we de techniek van het injecteren van hydrogels na een beroerte zonder de afgifte van groeifactoren of cellen. Hydrogels zijn echter ook gebruikt voor celtransplantatie, evenals medicijn- en groeifactorafgifte, en kunnen een waardevolle bron blijken te zijn voor zowel het bestuderen van biologie na een beroerte als het onderzoeken van nieuwe therapiemethoden. In het kader van een beroerte heeft ons laboratorium niet-poreuze hyaluronzuurhydrogels geïnjecteerd die geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neurale voorlopercellen14,18 inkapselen in concentraties variërend van 25.000 cellen / μL tot 50.000 cellen / μL gel. Het gebruik van een hydrogel resulteerde in een toename van de levensvatbaarheid en differentiatie van cellen. Andere laboratoria hebben ook celdifferentiatie en verhoogde weefselregeneratie gemeld als reactie op hydrogels die worden gebruikt om stamcellen te transplanteren na een beroerte 22-24. Daarnaast hebben we hydrogels geïnjecteerd met groeifactoren na een beroerte die leiden tot weefselregeneratie en gedragsverbetering na een beroerte13,14. In termen van materiaalontwerp is injecteerbaarheid een waardevol kenmerk dat dient om invasiviteit te minimaliseren; daarom moeten hydrogels worden geformuleerd als sol-gels (vloeibaar-tot-vast), afschuifverdunning (G'> G" onder statische omstandigheden; G" > G' tijdens de stroming), of korrelige gels bestaande uit bouwstenen waarvan de diameter kleiner is dan de binnendiameter van een naald12,25,26. Optimalisatie moet vervolgens worden uitgevoerd om de diffusie van geneesmiddelen of groeifactoren, de levensvatbaarheid van cellen onder een reeks celconcentraties, gelcondities en injectieparameters te testen, zoals snelheid, naaldmeter, injectiediepte en injectiedag ten opzichte van wanneer een beroerte werd geïnduceerd. De dag van materiaalinjectie varieerde bijvoorbeeld van één dag na de beroerte tot, zo lang als drie weken na de beroerte27,28. Hier rapporteren we vijf dagen, maar hebben we eerder zeven dagen na een beroerte geïnjecteerd bij het transplanteren van cellen. Deze dagen werden gekozen op basis van de tijdlijn van de ontstekingsreactie en de piekactiviteit van angiogenese en neurogenese die een week na een beroerte werd gezien5,29,30,31. Volumekarakterisering moet ook op elk injectietijdstip worden uitgevoerd, omdat het slagvolume in de loop van de tijd zal afnemen als gevolg van atrofie. Aangezien deze parameters voorafgaand aan de injectie worden geoptimaliseerd, zijn de methoden hier voldoende om gebruikers te begeleiden bij het injecteren van biomaterialen met de toevoeging van cellen en / of groeifactoren en geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat TS een van de oprichters is van Tempo Therapeutics, dat MAP-hydrogels wil commercialiseren.
Acknowledgments
We erkennen graag de National Institutes of Health en het National Institute of Neurological Disorders and Stroke voor financiering (R01NS079691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
- National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229 (2017).
- Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69 (2017).
- Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
- Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
- Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794 (2015).
- Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14 (2018).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
- Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
- Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
- Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
- Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
- Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
- Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
- Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
- Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
- Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
- Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
- Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943 (2017).
- Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
- Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
- Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
- Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
