Summary
İnme, minimal tedavi seçenekleri olan ve kaybedilen beyin dokusunu yenilemek için mevcut klinik tedavinin olmadığı küresel bir sorundur. Burada kemirgenlerin motor korteksinde hassas fototropotik inme oluşturma yöntemlerini ve daha sonra inmeden sonra doku yenilenmesi üzerindeki etkilerini incelemek için hidrojel biyomalzemelerin enjeksiyonunu açıklıyoruz.
Abstract
İnme, amerika birleşik devletleri'nde engelliliğin ve beşinci önde gelen ölüm nedeninin başındadır. Tüm inmelerin yaklaşık % 87'si iskemik inmelerdir ve beyne kan sağlayan bir damarın ani tıkanma olarak tanımlanır. Tıkanmaya dakikalar kala hücreler ölmeye başlar ve onarılamaz doku hasarına neden olarak ortaya çıkan hücrelerdir. Mevcut terapötik tedaviler, reperfüzyona izin vermek ve daha ciddi beyin hasarını önlemek için pıhtı giderme veya lizise odaklanır. Geçici beyin plastisitesi zamanla hasarlı dokunun bir kısmını kurtarsa da, hastaların önemli bir kısmı asla çözülmeyecek nörolojik eksikliklerle baş başa kalır. İnmenin neden olduğu nörolojik açıkları tedavi etmek için terapötik seçeneklerin eksikliği vardır ve bu artan hasta popülasyonunun tedavisi için yeni stratejiler geliştirilmesi gerektiğini vurgular. Enjekte edilebilir biyomalzemeler şu anda aktif ajanların veya kök hücrelerin teslimi yoluyla beyin plastisitesini artırmak ve endojen onarımı iyileştirmek için tasarlanmıştır. Bu yaklaşımları test etmek için bir yöntem, bir kemirgen inme modeli kullanmak, biyomalzemeyi inme çekirdeğine enjekte etmek ve onarımı değerlendirmektir. İnme sonrası doğru tedavi için inme çekirdeğinin kesin yerini bilmek zorunludur, bu nedenle enjeksiyondan önce görüntüleme ihtiyacını önlemek için öngörülebilir bir inme konumu ile sonuçlanan bir inme modeli tercih edilir. Aşağıdaki protokol, fototropotik inmenin nasıl teşvik edeceğini, bir hidrojenin kontrollü ve hassas bir şekilde nasıl enjekte edeceğini ve biyomalzemeyi sağlam tutarken beynin nasıl çıkarılacağını ve kriyoseksiyon yapılacağını kapsayacaktır. Ek olarak, bu aynı hidrojel malzemelerin kök hücrelerin birlikte teslimi için nasıl kullanılabileceğini vurgulayacağız. Bu protokol, inme çekirdeğine diğer enjekte edilebilir biyomalzemelerin kullanımına genelleştirilebilir.
Introduction
İnme, amerika Birleşik Devletleri'nde engelliliğin önde gelen nedeni ve beşinci ölüm nedenidir1. Tüm inmelerin yaklaşık% 87'si iskemiktir, geri kalan% 13'ünün çoğunluğu hemorajik2 'dir. İskemik inme, bir arterdeki kan akışının çevre dokuya tıkanması olarak tanımlanır. Bu tıkanıklık, hayatta kalan hastalarda sıklıkla kalıcı sakatlığa yol açan oksijen yoksunluğu ve sonraki nekroz ile sonuçlanır. İnme ölüm oranında bir azalma olsa da3, yaygınlığının 2030 yılına kadar 3,4 milyon kişiye çıkması bekleniyor4. Engelli hayatta kalanlardaki bu artış ve buna bağlı olarak ekonomik yük, sinirsel onarım mekanizmalarına odaklanan inme araştırmaları için bir itmeye yol açmıştır. İnmenin ardından, nekrotik bölgenin genişlemesini önleyen bir yara izi oluşumuna yol açan enflamatuar bir dönem vardır. Nekrotik çekirdeği çevreleyen bölge "peri-enfarktüs" olarak ad altındadır ve artan anjiogenez, nörogenez ve aksonal filizlenmeyi içeren bu bölgedeki plastisitenin hayvan modellerinde ve insanlarda gözlenen iyileşme ile doğrudan bağlantılı olduğuna dair güçlü bir kanıt vardır5. İnmeden sonraki karmaşık etkileşimleri düzgün bir şekilde kopyalayabilen in vitro modeller olmadığından, inme araştırmaları için hayvan modelleri gereklidir.
İskemik inme üretmek için kullanılabilecek birkaç in vivo model vardır. Farelerde kullanılan en yaygın modellerden biri, distal veya proksimal (intra-arteriyel filament yoluyla) tıkanıklık yoluyla orta serebral arter tıkanıklığı veya MCAo'dur. Filament MCAo (fMCAo) olarak da bilinen proksimal model, tipik olarak, faktör sayısına bağlı olarak, serebral yarımkürenin% 5 ila% 50'sini kapsayan büyük iskemik inmelerle sonuçlanır6. Bu modellerde, bir dikiş veya filament iç şahdamarından orta serebral arterin (MCA) tabanına ilerletilir ve belirli bir süre yerinde tutulur. Geçici veya kalıcı hale getirilebilen bu tıkanıklık yöntemi, striatum merkezli bir enfarktüs üretir ve korteksin aşırıya bulaştırılmasını içerebilir veya içermeyebilir6. Elde edilen kontur boyutu oldukça değişkendir ve her farede prosedürün etkinliğini doğrulamak için lazer doppler gibi görüntüleme teknikleri gereklidir. 30 dakikadan uzun süren intra-arteriyel veya intra-luminal filament tıkanıklığı, boyut aralığının daha büyük ucunda vuruşlar üretir. Bazı araştırmacılar, önemli deneysel odaklanma ve laboratuvar doğrulaması gerektiren daha kısa filament tıkanma sürelerine odaklanmıştır7. Farelerdeki Filament MCAo modelleri, insan inme vakalarında görüldüğü gibi hücre ölümünün, iskemik ilerlemenin ve peri-enfarktüs bölgesinin oluşumunun benzer aşamalarını izler; bununla birlikte, daha büyük inmeler, daha az yaygın, daha az tedavi edilebilir insan inmeleri olan malign serebral enfarktüslerin hastalık durumuna daha yakından benzer6. Bu arada distal MCA tıkanıklığı daha ilgili bir ameliyat ve kraniektomi gerektirir. Bu modelde, MCA'nın beynin yüzeyi boyunca uzanan distal kısmı doğrudan bir dikiş bağı veya koterizasyon ile tıkanır. Tekniğin bazı varyasyonlarında, şahdamarları tek taraflı veya geçici olarak çift taraflı olarak tıkanır. Distal MCAo'nun bir yararı, filament modelinden daha az değişken boyutta kortikal tabanlı bir inme üretmesidir. Bununla birlikte, distal model, fMCAo6ile de ilgili bir endişe olan dış şahdamarının (ECA) transeksiyon nedeniyle daha zayıf davranışsal çıktı üretir.
Daha az invaziv olmasıyla bilinen alternatif bir kontur modeli fototropombotik (PT) modeldir. PT modeli iyi tanımlanmış bir iskemi yeri ile sonuçlanır ve yüksek sağkalım oranı8ile ilişkilidir. Teknik, intraperitoneal olarak enjekte edilen ve intravasküler foto-oksidasyona izin veren ışığa duyarlı bir boyaya dayanır, sadece istenen dokuyu bir ışık veya lazerle ışınlayarak9. Eksitasyondan sonra, ışınlanan bölgede trombosit toplama ve pıhtı oluşumunu aktive eden endotel hasarına neden olan oksijen radikalleri oluşur8,9. Strok boyutu ve konumu üzerindeki sıkı kontrolün yanı sıra PT modelinin yüksek tekrarlanabilirliği, biyomalzemelerin incelenmesi için idealdir. Lazer ve stereotaksik koordinatlar kullanılarak hassasiyet mümkün olsa da, bu modeli birkaç çalışma için daha az ideal hale getirebilecek bazı dezavantajlar vardır. fMCAo modelinin aksine, PT kontur modeli yeniden çürütülemez. Bu nedenle, reperfüzyondan sonraki hasarlara veya reperfüzyonu takip eden mekanizmalara özgü nöroprotektif ajanların araştırılması için malzemeler burada yararlı olmayacaktır8. Ek olarak, PT modelinin mikrovasküler hakareti nedeniyle nispeten küçük iskemik penumbra görülür. Bunun yerine, insan inmesi için karakteristik olmayan lokal vazojenik ödem oluşur, bu da bu modeli peri-enfarktüs alanı6,8'eodaklanan preklinik ilaç çalışmaları için istenmeyen hale getirir.
İnmede biyomalzeme stratejilerinin genel amacı ya biyoaktif ajanlar sunmak ya da beyin dokusu büyümesi için hücre dışı bir matris olarak hareket etmektir. Yöntemlerimizi kullanarak araştıracağımız bir strateji, birçok mevcut hücre tedavilerinin verildiği peri-enfarktüs dokusunun aksine, hidrojel'i doğrudan inme çekirdeğine teslim etmektir10. Bu yaklaşımın gerekçesi, çekirdekte bulunan nekrotik dokuya doğumun çevredeki sağlıklı veya iyileşen dokuyu bozmaktan kaçınacağıdır. Biyomalzemeye dahil olan herhangi bir aktif ajanın difüzyonunun çekirdekten peri-enfarktüse ulaşabileceğini varsayıyoruz, özellikle hidrojel biyomalzemelerin teslimatının glial skarın kalınlığını azalttığını bulduğumuz için11. Peri-enfarktüs bölgesinin inmeden sonra nöroplastisite gösterdiği ve çekici bir hedef haline getirdiği için bu önemlidir. Ayrıca, inme çekirdeğine bir taşıyıcı matrisin teslimi, yeni dokunun oluşumuna rehberlik etmek için anjiyojenik12 veya nörojenik13 faktörle ve doğum için hücrelerle yüklenebilir14. Hücre teslimi bir matris kullanılarak büyük ölçüde geliştirilmiştir, çünkü hücreleri teslimat sırasında mevcut olan sert enjeksiyon kuvvetlerinden ve yerel ortamdan korur, ayrıca farklılaşmayı ve engraftment15'iteşvik eder.
Bu enjekte edilebilir terapötik biyomalzemeler inme uygulamalarında klinik öneme sahiptir, çünkü şu anda inmeden sonra nöronal iyileşmeyi uyaran tıbbi tedaviler yoktur. İyileşmede yer alan altta yatan sinir devreleri inme çekirdeğine bitişik beyin dokusunda yatmaktadır16İnme çekirdeğinin kendisi canlı sinir dokusundan yoksundur. Nekrotik inme çekirdeğine biyomalzeme verilmesinin, büyüme faktörlerinin depo salınımı 13 , büyümedeki dokunun uyarılması ve iyileşen beyin dokusu gelişiminin teşviki11 , 12, immün yanıtların değiştirilmesi17ve kök hücre türevi terapötiklerin verilmesi14, 18. Bununla birlikte, bu uygulamaların olasılığını etkili bir şekilde incelemek için, inmeyi teşvik etmek ve biyomalzeme enjekte etmek için tutarlı ve tekrarlanabilir bir yönteme ihtiyaç vardır. PT kontur modeli, konturun yönü ve konumu üzerinde hassas kontrol sağlayan teknikler kullanır. Stereotaksik cihaza bağlı bir lazer yönlendirmelere rehberlik eder ve stereotaksik cihazlara bağlı pompalar, ek görüntüleme formlarına gerek kalmadan malzemenin enjeksiyon oranını kontrol eder. Bu nedenle, farelerin motor kortekslerinde PT inme yapma ve inme çekirdeğine biyomalzeme enjekte etme yöntemlerini tanımlamayı seçtik. Burada, ilave hücre veya büyüme faktörü olmadan enjeksiyon için biyomalzeme olarak mikro gözenekli tavlanmış parçacık (MAP) hidrojelleri kullanıyoruz. Ek olarak, beynin sağlam biyomalzeme ile nasıl başarılı bir şekilde alınacağını açıklıyoruz ve inme sonucunu biyomalzeme enjeksiyonu ile ve enjeksiyonu olmadan analiz etmek için kullanılan immün entrika testlerini tartışıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler Duke Üniversitesi ve Kaliforniya Los Angeles Üniversitesi'nde IUCAC'ye uygun olarak gerçekleştirildi. Bu çalışmada 8 ila 12 haftalık erkek C57Bl/6J fareler kullanılmıştır. Hayvanlar kontrollü sıcaklık (22 ± 2 °C) altında, 12 saat açık-karanlık döngü süresi ve peletlenmiş yiyecek ve su reklam libitum erişimi ile yerleştirildi. Analjezi ve sedasyon protokolleri IUCAC tarafından onaylanmış olarak tanımlanır, ancak diğer laboratuvarlarda kullanılan protokollerden farklı olabilir.
Hayvanlar, sağkalım ameliyatının bir sonucu olarak aşırı huzursuzluk, seslendirme (kontrol edilemeyen ağrıyı gösteren), kendi kendine travma, hareket kabiliyetinde azalma veya bozulma, dermal enfeksiyonun fiziksel belirtileri, iştahsızlık ve/veya kilo kaybı %10-15'ten büyük yaşarlarsa erken ötenazi yapılabilir. Beyinde doğal olarak meydana gelen bir polimerden oluştuğu için jelin enjeksiyonundan beklenen bir yan etki yoktur. Hayvanlar hafta sonları ve tatiller de dahil olmak üzere her gün izlenmeli ve her gün ağır basmalıdır. Laboratuvarımızdan ve diğerlerinden yapılan çalışmalarda, bu küçük kortikal veya subkortikal inmelerden sonra tımar, vücut ağırlığı kaybı veya yoksunluk belirtileri / belirtileri veya farelerde kronik stres eksikliğine rastlanmamaktadır. Hayvanlar yerel kafa yarası enfeksiyonu belirtisi gösteriyorsa ötenazi yapılmalıdır. Hayvanlar ayrıca kötü tımar, yara durumu ve hayvanlar arasındaki kavga kanıtları (sırt yaraları) için de izlenmelidir. Kavga veya yara dehiscence kanıtı varsa, hayvanlar önce veteriner hekimlere temas ettikten sonra tedavi edilmelidir. Bu genellikle suda antibiyotik ve / veya lokal topikal antibiyotik uygulamasını içerir. Bu önlemler şifa üretemezse, hayvanlar ötenazi yapılmalıdır.
1. Malzeme ve aletlerin hazırlanması
- Ameliyattan önce fototropotik boya hazırlayın. 2 mL mikrosantrifüj tüpüne 15 mg Rose Bengal tartın.
DİkKAT: Gül Bengal ciddi göz hasarına/tahrişe neden olabilir.- 10 mg/mL çalışma konsantrasyonu yapmak için Rose Bengal'i 1,5 mL steril filtreli 1x PBS'de çözün.
- Boyanın tamamen çözüldüğünü gösteren kümeler görünmeyene kadar tüpü girdaplayın, daha sonra daha fazla kullanıma kadar folyoya örtün.
NOT: Gerekli boya miktarı fare sayısına bağlı olacaktır. Boya, 20 g fare için 10 μL/ g, örneğin 200 μL konsantrasyonda intraperitoneally IP enjekte edilir.
- Anestezi sırasında fare gövdesi sıcaklığını korumak için ısıtma yastığını açın (37 °C).
- Otoklavlı makas, tokalar, pamuk, veteriner göz merhemi, cerrahi yapıştırıcı veya dikiş malzemesi, mavi veya siyah cerrahi işaretleyici ve steril alkol ve beta iyot mendilleri hazırlayın. Sterilize matkap ucu kafaları ile kemik matkap hazırlayın.
- Fare cerrahisi arasındaki aletlerin sterilizasyonuna izin vermek için boncuk sterilizasyonunu 160 °C'ye açın. Hidratlı bir çalışma alanının bakımında daha sonra kullanmak için 50 mL konik bir steril salin tüpü veya 1x PBS çözeltisi ayırın.
- Lazeri stereotaksik cihaza takın. Lazer güvenlik gözlükleri takarak, lazerin gücünü ölçün (mW).
DİkKAT: İşlemde lazer açıldığında lazer güvenlik gözlüklerini kullanın.- Lazer güç çıkışı 10 mW okuyana kadar lazer konsolundaki akımı lazer üretim talimatlarını izleyerek ayarlayın ve akımı ana ekran konsolunda önceden ayarlanmış olarak ayarlayın. Ardından, lazer çıkış gücünün 40 mW okuduğu başka bir ön ayar oluşturmak için akımı tekrar ayarlayın. Şimdi lazeri bir sonraki kullanıma kadar kapatın.
NOT: 10 mW, kullanmadan önce lazeri yönlendirmek için kullanılacaktır.
- Lazer güç çıkışı 10 mW okuyana kadar lazer konsolundaki akımı lazer üretim talimatlarını izleyerek ayarlayın ve akımı ana ekran konsolunda önceden ayarlanmış olarak ayarlayın. Ardından, lazer çıkış gücünün 40 mW okuduğu başka bir ön ayar oluşturmak için akımı tekrar ayarlayın. Şimdi lazeri bir sonraki kullanıma kadar kapatın.
- Ameliyattan sonra fareler için temiz bir kafes hazırlayın. Daha sonra, fareyi spontan hareket durana ve solunumu yavaş, sabit bir hıza gelene kadar uyuşturmak için% 4'lük bir izofluran konsantrasyonu ile indüksiyon odasına yerleştirin.
- Uyuduktan sonra, ne kadar Rose Bengal boyası enjekte edeceğini belirlemek için fareyi tartın. Ardından, fareyi% 1,5 bakım izofluran konsantrasyonu ile stereotaksik cihaza aktarın ve sabitleyin.
NOT: Artan izofluran konsantrasyonları damarları genişletebilir ve fareler arasında yeterli tıkanıklığı veya sürekli olarak boyutlandırılmış vuruşları önleyebilir. - Her iki göze veteriner gözü merhem uygulayın.
NOT: İşlem boyunca nefes almayı ve sıcaklığı izleyin ve farenin hiçbir şey hissetmemesini sağlamak için zaman zaman parmakları kıstırın.
2. Fototropombotik inme modeli9
- Farenin kafasındaki kürkü tıraş edin ve bir alkol mendili ve ardından beta iyot mendili kullanarak bölgeyi aseptik olarak hazırlayın. Üç kez tekrarlayın.
NOT: Gerekirse, tüm beta iyotları temizlemek için sonunda ekstra bir alkol mendili kullanın, çünkü bu da farelerin ameliyattan sonra kafatasını kaşımalarına neden olan cilt tahrişine neden olur. - Küçük bir operasyon makası kullanarak, kulaklar arasında gözlere yaklaşık 1-2 cm yanal bir kesi yapın. Bunu, bir çadır oluşturmak için deriyi kanatçıklarla yukarı doğru çekerek, bir kez aşağı doğru keserek, ardından makası açıklığa sokarak ve sürekli bir orta hat kesisi oluşturarak yapın.
- Cildi ayırın ve bregmayı bulmak için deri kemiklerinips ile hafifçe bastırın. Bregmayı cerrahi işaretleyiciyi kullanarak bir nokta ile işaretleyin.
NOT: Kemik parçası hareketi parietal kemiklerin ön kenarlıklarını vurgular. Bregma, frontal ve parietal kemik parçalarının bir araya geldiği merkez noktadır (Şekil 1A). - Lazer güvenlik gözlükleri takarak, lazeri farenin kafatasının üzerine taşıyın, stereotaksik cihazı 90 ° açıyla sabitleyin. 10 mW'ı önceden ayarlayın ve lazeri açın.
- Lazerin x ve y eksenini doğrudan bregma'nın üzerine gelene kadar ayarlayın. Dijital ekran konsolundaki x ve y'yi sıfırlayın ve ardından lazeri bregmanın 1,8 mm soluna taşıyın. Şimdi lazeri kafatasına dokunmasına izin vermeden kafatasına mümkün olduğunca yaklaştır.
- Herhangi bir engel olmadan hareket edebileceğinden emin olmak için lazeri bregmanın 2,2 mm soluna taşıyın. Lazeri kapatın.
- Tek kullanımlık 29 G iğne kullanarak uygun miktarda Rose Bengal boyasını intraperitoneally (IP) enjekte edin. Boyanın sistemik olarak dolaşmasına izin vermek için hemen 7 dakika boyunca bir zamanlayıcı başlatın. Lazeri açmadan 40 mW için önceden ayarlanmışı seçin.
NOT: İşlemden memnun kaldıktan sonra, boya farenin aseptik hazırlanmasından önce enjekte edilebilir ve zaman kazanmak için 7 dakika bitmeden bitirilebilir. - Lazer güvenlik gözlüğü takarken 7 dakikalık zamanlayıcı patladığında lazeri (40 mW) açın ve 10 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın.
- 10 dakika sonra, lazeri kapatmadan bregmanın 2,2 mm soluna hareket ettirün ve 10 dakika daha zamanlayıcı ayarlayın.
- İkinci 10 dakikalık zamanlayıcı patladıktan sonra lazeri tekrar 10 mW'a değiştirin ve lazeri bregmanın 2,0 mm soluna taşıyın. Bu noktayı cerrahi işaretleyiciyle işaretle. O zaman lazeri kapat.
- Lazeri kaldırın ve fareden uzaklaşabilmesi için 90° açıdan kilidini açın. Bu noktada, cerrahi bölge kuruysa steril salin veya PBS'yi pamukla uygulayın.
- Kafatasının yüzeyine dik 2,0 mm işaretinde küçük patlamalar delin.
NOT: Çok delmemek ve beyne çarpmamak için yavaşça delmeye dikkat edin. Matkap kafatasından geçtikten sonra dirençte hafif bir düşüş / değişiklik olacaktır ve delme kanamaya neden olabilir.- Fazla kanı emmek için pamuk kullanın. Deldikten sonra kafatasındaki sıyrık arterlerden bir miktar kan görmek tipiktir - aşırı kan, matkap ucunun beyne çarptığı anlamına gelir. Bu durumda, fare tanımlayıcısını kaydedin ve devam edin.
- Farenin yanına küçük bir mendil yerleştirin. Forseps kullanarak, yapıştırmaya hazırlanmak için cildi birbirine yakın çekin.
NOT: Bunun yerine dikiş burada yapılabilir. Dikiş genellikle sadece 3 dikiş gerektirir.- Toparlamaları kullanarak, cildin iki tarafını tutun ve birlikte ve yukarı doğru çekin. Fareye uygulamadan önce silme ucunun ucundaki büyük cerrahi yapıştırıcı damlalarını kapatın.
- Cerrahi yapıştırıcıyı idareli uygulayın ve cildi 10 sn forseps ile bir arada tutun. Görünür açıklıklar olmayana kadar devam edin.
NOT: Tutkal hızlı bir şekilde çıkar - şişeyi sıkmayın. Cildi kafatasına yapıştırmaktan veya göze tutkal almaktan kaçının.
- Yapıştırdıktan veya dikize ettikten sonra, anesteziden kurtulmak için fareyi yeni kafese yerleştirin. Hayvanın iyileşmesi 5-10 dakika sürer ve kafesin yarısını bir ısıtma yastığı üzerinde dinlendirmeye yardımcı olur.
3. Sham vuruş operasyonu
- Gül Bengal boyası yerine 1x PBS veya salin enjekte etmek dışında, tüm prosedürleri bölüm 2'de yukarıda açıklanan işlemle aynı şekilde gerçekleştirin.
4. Hidrojel veya diğer biyomalzemelerin enjeksiyonu
- Biyomalzemelerin enjeksiyonunun kullanıcı tanımlı bir zamanda gerçekleştirilmesi. Bu deneyde inme sonrası 5- 7 gün arasında enjeksiyonlar yapıldı. 2 - 6 μL hidrojel enjekte edilir (kullanıcı tanımlı).
- Anestezi sırasında fare gövdesi sıcaklığını korumak için ısıtma yastığını açın (37 °C).
- Otoklavlı makas, toka, pamuk, veteriner göz merhemi, cerrahi tutkal veya dikiş malzemesi ile steril alkol ve beta iyot mendilleri hazırlayın. Kemik matkabı steril matkap uç başlıkları ve metal 30 G iğneli 25 μL cam Hamilton şırıngaları ile hazırlayın.
- Fareler arasındaki aletlerin sterilizasyonuna izin vermek için boncuk sterilizasyonunu 160 ° C'ye açın.
- Enjeksiyon pompalarını stereotaksik cihaza takın. Akış hızını 1 μL/dak olarak ayarlayın ve hacmi 4 μL olarak ayarlayın.
- Ameliyattan sonra fareler için temiz bir kafes hazırlayın.
- Fareyi, spontan hareket durana ve solunumu yavaş ve sabit bir hıza gelene kadar uyuşturmak için% 4'lük bir izofluran konsantrasyonu ile indüksiyon odasına yerleştirin.
- Uykudayken, fareyi % 1,5 bakım izofluran konsantrasyonu ile stereotaksik cihaza aktarın ve sabitleyin.
- Veteriner gözü merhemini her iki göze de uygulayın.
- Farenin kafasını yeniden büyümüş olabilecek herhangi bir kürkü tıraş edin ve bir alkol mendili ve ardından beta iyot mendili kullanarak bölgeyi aseptik olarak hazırlayın. Üç kez tekrarlayın.
NOT: Gerekirse, cilt tahrişine neden olduğu ve farelerin ameliyattan sonra kafatasını kaşındırmalarına neden olduğu için tüm beta iyotları temizlemek için sonunda ekstra bir alkol mendili kullanın.
- Küçük makası ve/veya asaları kullanarak, beynin üzerindeki cildi yeniden açın. Kafatasındaki kalıntıları temizlemek için steril tuzlu su veya PBS ile pamuk kullanın. Matkaptan beyaz-sarı bir daire (kontur, Şekil 1B)ve çapak deliği görünür olacaktır. Ölü doku görünmüyorsa, muhtemelen felç oluşmaz. Çapak deliği konturun üzerinde ortalanmazsa, ortalamak için yeniden delin.
- Enjeksiyon pompasını farenin üzerine yönlendirin ve 90 ° 'de kilitleyin. Malzemeyi geri yüklemeden önce şırınnayı steril salin veya PBS çözeltisi ile temizleyin.
- Temizledikten sonra, cam şırıngayı iğne olmayacak şekilde sökün. Şırınnayı 10 μL hidrojel (veya hücreli veya hücresiz diğer biyomalzemeler) ile 25 μL pozitif deplasman pipet kullanarak geri yükleyin.
- Şırınd pistonu kullanarak, jeli şırınnanın önüne kadar itin. Daha sonra şırıngayı yeniden bir araya haline alıp jel iğneden gözle görülür şekilde çilene kadar itmeye devam edin.
- Şırındıcı pompanın üzerine yerleştirin. Şırınnanın sığması için pompanın arkasının ayarlanması gerekebilir. Akış hızını 30 μL/dk olarak ayarlayarak bunu yapın, hareket etmesi gereken yöne bağlı olarak Geri Çekme veya Enjekte Et 'i seçin ve başlat'a basın. Pompanın arkası doğru konumdayken Durdur'a vurun.
- Şırınnanın güvende olması için pompanın arkasını vidala. Ayarlamalar daha önce yapılmışsa, akış hızının 1 μL/dk olarak ayarlandığını ve enjekte etmek üzere ayarlandığını unutmayın.
- Pompayı deliğin üzerine yönlendirmek için x ve y yönünde hareket ettinin. Şırınganın iğnesi deliğin üstüne değene kadar pompayı z yönünde aşağı hareket ettinin.
- Dijital ekran konsolundaki z'leri sıfırlayın. Ardından şırınnayı z yönünde 0,750 mm aşağı hareket ettirin. Şırındı bükülürse veya direnç varsa, kafatası ya iyileşir ya da tamamen delinmez ve yeniden delinmesi gerekir.
- Hidrojelin 4 - 6 μL'lik kısmını 1 μL/dk hızında enjekte etmek için pompa konsolunda Başlat'a basın.
- Jelin çapraz bağlamaya başlamasına izin vermek için pompa enjekte etmeyi durdurduğunda 5 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın.
- 5 dakika sonra, z nob'u çevirerek şırınnayı yavaşça yukarı çekin. Herhangi bir malzemenin yanlışlıkla çekildiğini veya delikten sızdırıp sızmadığını görmek için izleyin. Pompanın kilidini açın ve iğne kafatasından yeterince uzakta olduğunda fareden uzaklaştırın.
- Dikinler, cerrahi tutkal veya dikişler kullanarak, başın üzerindeki cildi kapatın. Fareyi temiz kafese yerleştirin ve iyileşmesini gözlemleyin. Farenin anesteziden kurtulması yaklaşık 5 - 10 dakika sürmelidir.
5. Perfüzyon ve numune toplama
- Fareyi izofluran kullanarak uyuşturun.
- Hayvanı sırtüstü pozisyonda sabitleyin ve karın boşluğunu ortanca bir kesikle açın. İsteğe bağlı olarak, daha az fiksatif ve PBS kullanmak için alçalan abdominal aortu kelepçeleyin.
- Diyaframı kesin ve göğüs boşluğunu açmak için göğüs kafesinin kenarlarını yukarı hareket ettirin. Sol ventrikül içine bir perfüzyon kanül yerleştirin ve sağ kulakçıkta bir açıklık kesin. 10-20 mL PBS ile veya sıvı yarı temiz çalışana kadar yavaşça perfüze etmeye başlayın.
- Temizlendikten sonra, başka bir 10 - 20 mL için% 4 PFA'ya geçin. Kolların sabitlenerek PFA infüze oldukça kaslanmaları sağlar. Hareket etmeyi bıraktıklarında, 30'luk daha bekle.
- Hayvanın kafasını koparın ve kafatasını ortaya çıkarmak için deriyi geri çekin. Künt, ince tokalar kullanarak, beyni açığa çıkarmak için kafatasının parçalarını dikkatlice çıkarın. Kafatasını inme bölgesinin üstünden çıkarırken özel dikkat edilmesi gerekir. Kafatasını kesmeye yardımcı olmak için burada küçük cerrahi makas kullanılabilir. En büyük zorluk, kafatası çıkarılırken jelin kafatasına yapışıp beyinden çıkmasıdır.
- Beyin ayrıldıktan sonra, bir gecede % 4 PFA'nın 10 - 15 mL'sine yerleştirin (24 saatten uzun değil).
- Ertesi gün beyinleri PFA'dan %30 sakkaroza taşıyın. Beyin dibe battıktan sonra (yaklaşık 2 - 3 gün) kriyoseksiyona hazırdır. Bu noktada depolama için de bırakılabilir.
6. Kriyoseksiyon ve boyama
- Beyni sakkarozdan çıkar ve cam bir kaydırağın üzerine yerleştir. Bir aynaya monte edilecek düz bir kısım oluşturmak için beynin arka kısmını jiletle kesin.
- En uygun kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) bir dollop chuck yerleştirin, ve sonra beyni yerleştirin, düz tarafı aşağı, OCT chuck üzerine.
NOT: OCT, bölümleme sırasında malzemenin beyinden ayrılmasını önlemeye yardımcı olmak için beyni tamamen kapsayacak şekilde eklenebilir.
- En uygun kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) bir dollop chuck yerleştirin, ve sonra beyni yerleştirin, düz tarafı aşağı, OCT chuck üzerine.
- 10 jelatin kaplı slayt boyunca 30 μm kalınlığında bölümlerde -20 °C'de bir kriyostat üzerinde beyinleri seri olarak kesin. Hidrojel kaybetmemeyi sağlarken dikkatli olun. Bu kısım zorsa, beynin üstüne jelin üzerine biraz OCT yerleştirin (Şekil 3). Bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
- Slaytları -80 °C'den alın ve kurumasını sağlamak için bir boyama tepsisine yerleştirin. Dondurulmamış ancak sadece bölümlenmiş slaytlar da hemen lekelenebilir.
- Hidrofobik bir kalem kullanarak, slayttaki beyin dilimlerinin etrafına bir daire çizin. Kurutulur, beyin dilimlerini 1x filtreli PBS ile yeniden sulandırin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Bu, 9 - 12 beyin bölümü ile slayt başına yaklaşık 1 mL tampon alır.
- Slaytları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1x filtreli PBS ile yıkayın, üç kez tekrarlayın.
- Dansözde oda sıcaklığında %0,01 PBS-Triton X'te %10 eşek serumu ile 30 dakika ile bir saat arasında slaytları engelleyin. Bu, slayt başına yaklaşık 200 μL sürer.
- Primer antikoru%10 eşek serumunda% 0.01 PBS-Triton X ile bir gecede 4 °C'de bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Doğru konsantrasyonları belirlemek için önce birincil antikorları test edin. Burada GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500) (Şekil 4) kullanılmıştır.
- Ertesi gün 1x filtreli PBS ile slaytları oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın, üç kez tekrarlayın.
- %0.01 PBS-Triton X ve DAPI'da %10 eşek serumunda sekonder antikor ile oda sıcaklığında laboratuvar çalkalayıcıda 2 saat kuluçkaya yatırın. 1:1,000 tüm ikinci sınıflar ve DAPI için kullanıldı.
- Slaytları 1x filtreli PBS ile 5 dakika yıkayın.
- Bölümlerin karanlıkta oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Bu 20 dakika ila 4 saat sürebilir; slaytları bir kurutucuya yerleştirmek işlemi hızlandırabilir.
- Artan alkol konsantrasyonlarında (çözelti başına 1 dk) %50, %70, %95, %100 ve %100 dehidrat kayar.
- 1 dakika xylene ilk banyosunda yağdan arındırın, sonra 5 dakika xylene ikinci banyo.
- Beyin bölümleri ksilen ile ıslanırken slaytları tek tek hızla dışarı çıkarın ve montaj ortamı ekleyin. Üzerine hızlı bir şekilde cam bir kapak kılıfı ekleyin. Görüntüleme için kullanılan slayt ve mikroskop için gereken doğru uzunlukta ve kalınlıkta bir kapak kayması kullanın.
- Slaytın ortasından dışa doğru bir hareketle pipet ucuyla hafifçe bastırarak kapak altlığındaki kabarcıklardan kurtulun. DPX'in oda sıcaklığında karanlıkta gece boyunca 4 saat kurumasını bekleyin.
- Slaytlara dökülen herhangi bir kurutulmuş montaj ortamını kazımak için bir jilet kullanın. Lens temizleyici ile slaytları silin. Slaytlar artık floresan mikroskopi ile görüntülenebilir.
NOT: Görüntüleme tamamlanana kadar slaytı karanlıkta veya 4 °C'de saklamak en iyisidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntemin amacı inmeden sonra beyne biyomalzemelerin nasıl enjekte edildiğini göstermekti. İnme lezyonunun hem boyut hem de mekanda kontrollü bir şekilde yönlendirilmesi için gül bengal ve 520 nm lazerli fototropotik bir model kullanılmıştır. İnmeden beş gün sonra enfarktüs ameliyat sırasında(Şekil 1B)ve TTC ve görüntüleme IHC lekeli slaytlar (Şekil 2)ile görselleştirilebilir. 2x lens ile lazer çapındaki artış, inme lezyonunda 2,5 mm'nin üzerine yayılan görsel bir artışa ve sadece lazerle tek bir 1 mm bölüme yol açar(Şekil 2). PT modeli ile ameliyat sırasında mortalite nadiren, % 1'den az, minimal invaziv prosedür nedeniyle meydana geldi. Ameliyat sonrası ölüm de düşüktü ve farelerin% 5'inden daha azında görüldü.
Hyaluronik asit bazlı hidrojel mikropartiküller (HMP' ler) inmeden beş gün sonra enjekte edildi (Şekil 3). HPS, inme çekirdeğine hücre geçişine izin veren gözenekli bir iskele ile mikroannealed parçacıklar (MAP) oluşturmak için inme lezyonuna enjeksiyondan sonra tavlama yapar (Şekil 4). Enjeksiyon fareleri% 4 PFA ile perfüzyon edildikten on gün sonra ve beyinleri çıkarıldı, bir gecede% 4 PFA'ya yerleştirildi ve daha sonra dondurulmadan önce iki gün boyunca% 30 sakkarozda IHC boyama ve analizi için bölümlendi.
Laboratuvarımızdaki önceki çalışmalarda, inmeden beş gün sonra inme lezyonuna MAP hidrojellerinin enjeksiyonugösterilmiştir 26. Korteksin modülüne uyan hyalüronik hidrojellerin enjeksiyonu, peri-enfarktüs içindeki ve MAP jel içindeki reaktif astrositlerde önemli bir azalmaya yol açtı. Ayrıca, hidrojel içinde de olan mikroglia, onarım yanlısı M2 belirteçlerini ifade etti. Bu, MAP hidrojel'in enjeksiyonları takip eden sadece iki gün içinde astrosit reaktivitesini azaltabileceğini ve pro-recovery astrositler ve mikroglia ile daha anti-enflamatuar bir ortamı teşvik edebileceğini göstermektedir (Şekil 5).
Şekil 1: Bregma'nın şematik gösterimi ve konturun lokalizasyonu. (A) Parietal loblar bregma oluşturmak için üstte buluşur. Lazer yerleşimi bregmanın 2.0 mm solunda ortalandı. (B) İnme ve çapak deliğinin görsel uyumu inmeden 5 gün sonra görüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Enfarktüsü kapsayan koronal bölümler. (A) Beyinlerin seri IHC bölümleri inmeden 5 gün sonra, sadece lazerle (üstte) ve 2x lensle (altta) inme. Dilimler, her bölüm önceki bölümden 300 μm uzaktayken 30 μm kalınlığındaydı. (B) Genişlemiş IHC lekesi, 500 μm ölçek çubuğu. Çekirdek (DAPI) mavi, astrositler (GFAP+) kırmızı ve mikroglial (Iba1+) yeşil, 4x büyütme ile gösterilir. (C) Lezyon hacmini inmeden 5 gün sonra görselleştirmek için TTC ile boyanmış beyin bölümleri, 1 cm ölçek çubuğu ile 1 mm kalınlığında bölümler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Biyomalzeme enjeksiyonu ve görselleştirilmesi. (A) Ameliyat sırasında jel enjeksiyonunun görseli. (B) Kafatası çıkarılırken jel gözle görselleştirilebilir. (C) Dondurulduktan ve monte edildikten sonra, jel kesit yapılırken beyinde görülebilirdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İnmenin immünhistokmeni lekeleri sadece hidrojellerle inmeye kıyasla. (A) Kriyoseksiyonlu beyin şeması 30 μm kalınlığında. Görüntü analizi için ortadaki birkaç bölüm seçildi. (B) Sadece inme, immünostokimya (IHC) inmeden 15 gün sonra lekelenir. Astrositler (GFAP+) hücreleri kırmızı, mikroglia (Iba1+) yeşil ve damarlar (GLUT1+) beyaz olarak gösterilir. İnme + Hidrojel durumu, IHC 10d enjeksiyon sonrası, inmeden 15 gün sonra. Astrositler (GFAP+) hücreler kırmızı, mikroglia (Iba1+) yeşil, hidrojel malzeme beyaz olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Mikro gözenekli tavlanmış parçacık hidrojellerinin inme sonrası reaktif astrositler ve mikroglia üzerindeki etkileri. (A) Okun vuruş gününü, + enjeksiyon gününü ve x'in fedakarlık ve analiz zaman noktasını işaret ettiği deneysel zaman çizelgesi şeması. (B) Bölümlerin nerede görüntülendiğini ve analiz edildiğini gösteren analiz kurulumu şeması. (C) pERK, S100b, GFAP aracılığıyla astrosit reaktivite gösteren IHC görüntüleri. (D) Son derece reaktif olan astrositlerin pERK/GFAP yüzdesinin ölçülmesi. (E) Son derece reaktif olan astrositlerin S100b/GFAP yüzdesinin ölçülmesi. (F) CD11b, Arg1 ve iNOS boyama yoluyla mikroglia reaktivitesinin IHC görüntüleri. (G) Mikroglial pro-enflamatuar fenotip tayini için iNOS/Dapi nicelemesi. (H) Mikroglial pro-onarım fenotipinin belirlenmesi için Arg1/Dapi'nin nicelemesi. Tüm ölçek çubuğu = 100 μm. GraphPad Prizması'nda istatistiksel analiz yapıldı. * belirtilen veriler Tukey post-hoc testi ve P<0<05 ile % 95 güven aralığı kullanılarak analiz edildi. Tek tek p değerleri T-test'i gösterdi. Bu şekilref. 26'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada kolayca tekrarlanabilir, minimal invaziv, kalıcı bir inme modeli gösteriyoruz ve inmeden beş gün sonra enfarktüse nasıl biyomalzeme enjekte edeceğimizi açıklıyoruz. Fototropombotik boya Rose Bengal ve stereotaksik cihaza bağlı 520 nm kolimli lazer kullanımı bize inmeyi farenin motor korteksine gelişmiş hassasiyetle konumlandırma yeteneği verir. İnmeden beş gün sonra, enfarktüsün yeri ışınlamanın merkezinde gözle görülebilir, bregma için 2.0 mm vasat yanal. Hidrojel daha sonra şırınd pompaları kullanılarak strok çekirdeğine doğru bir şekilde enjekte edilir. Bu modelde ameliyat sırasında ve inme sonrası mortalite neredeyse yoktur, ameliyattan sonra anestezik komplikasyonlar nedeniyle sadece bir avuç fare ölür. Biyomalzeme uygulamaları için PT inme kullanmanın avantajlarına rağmen, ele alınması gereken çeşitli biyolojik sınırlamalar ve teknik zorluklar vardır.
Biyolojik sınırlamalar açısından PT, insan inmelerinde veya endovasküler pıhtı alımına/lizizine yanıt olarak kendiliğinden ortaya çıkabilen bir süreç olan serebral reperfüzyon seçeneği sunan bir inme modeli değildir. Ek olarak, büyük bir beyin damarını tıkayarak çoğu insan inmesinin etiyolojisini taklit eden MCAo modelinin aksine, PT birçok küçük damardan kan akışını bozar. Hidrojel biyomalzemelerin enjekte etmenin teknik bir zorluğu, ameliyat sırasında şırınmaya veya ekstraksiyonlar sırasında kafatasına yapışma eğilimleridir. Enjeksiyon sırasında sıvı olarak kalan bir hidrojel tasarlamak ve daha sonra yerinde jeller ilk sorunu ele alabilir; bununla birlikte, jelin dura mater'e yapışmasını önlemek genellikle kaçınılmazdır, çünkü enjeksiyon bölgesi ve inme çekirdeği beynin yüzeyinde yer almaktadır. Bu, biyomalzemeyi sağlam tutarken beyin dokusunu çıkarmayı zorlaştırabilir. Bu nedenle, dura mater'in kafatası ile kalkmamasını ve istemeden jeli sökmemesini sağlamak için kafatası parçalarını beyinden çıkarırken özel dikkat edilmelidir. Kriyoseksiyon beyinleri de teknik beceri gerektirir, çünkü hem elleçleme işlemi hem de bıçak transeksiyonu jeli çevresindeki dokudan kolayca ayırabilir ve böylece hücre sızması ile ilgili veri toplamayı sınırlayabilir. Malzeme doku ile tam olarak entegre olmadığında kopma şiddetlenir. Numunenin OCT ile hazırlanması, kesim sırasında malzeme ayrımını en aza indirmeye yardımcı olan bir takviye kabuğu oluşturur.
Biyomalzemeleri enjekte etmeden önce, kemirgen suşuna ve laboratuvar kurulumuna bağlı olarak istenen inme boyutunu optimize etmenizi öneririz. Lazer çıkış yoğunluğu, ışın büyütme ve ışınlama süresi olmak üzere üç ana parametre ayarlanarak daha küçük veya daha büyük enfarktüsler yapılabilir. İnme boyutunu etkilediği de gösterilen diğer faktörler arasında izoflurankonsantrasyonu 19 ve boyanın ışınlamadan önce dolaşmasına izin verilen süre sayılıyor. Lazer çıkış yoğunluğu ile ilgili olarak (güç/alan veya mW/cm2),10 mW'lık bir lazer gücünün, lazer ışınınınkine göre biraz daha küçük yatay çapa sahip küçük bir enfarktüs üretmek için yeterli olduğunu gördük. Daha yüksek lazer gücü, gauss ışınlama profiline sahip lazer ışını nedeniyle marjinal olarak daha geniş ama önemli ölçüde daha derin enfarktüsler (veri gösterilmedi) sağladı. Yoğunluğu artırarak, maksimum ışınımın merkez noktası kafatasının daha derinlerine nüfuz edebilir ve lazerin spot boyutu penetrasyonunda hafif bir artışa neden olabilir. Diğer inme modelleri, daha düşük bir lazer yoğunluğunu korurken ışık penetrasyonunu ve daha sonra pıhtılaşmanın tekrarlanabilirliğini artırmak için kafatasını ışık veya lazer uygulamadan önce zımparalayarak inceltmiş20; bununla birlikte, bu kafatasında kanamaya neden olabilir ve ameliyat sırasında oldukça zaman alır ve bu süreçte beyne yanlışlıkla zarar vermeden ustalaşmak beceri gerektirir. Yoğunluğa benzer şekilde, lazer ışını çapını artırmak da enfarktüs boyutunu artırdı; bununla birlikte, lazer yoğunluğu ve ışın çapı birbirine göre doğrusal olarak ölçeklemez, ancak denklemi takip edin, güç yoğunluğu = lazer gücü (w)/ πr2, ışının yarıçapı nerededir. Işınlama süresi açısından, tekrarlanabilir inmeler elde etmek için en az 10 dakikaya ihtiyaç duyulduğunu gördük. Dikey derinliği sabit tutarken enfarktının yatay çapını artırmak için lazeri bitişik yerlere sırayla 10'ar dakika uyguladık. Gül bengalinin izofluran konsantrasyonu ve dolaşım süresinin etkisini ele almak için, IP enjeksiyonundan sonra% 1.5 izofluran konsantrasyonu ve 7 dakikalık dolaşımın sürekli inme oluşumuna neden olduğunu bulduk. Bu beş parametre özel kullanımımız için optimize edildi. Davranış değişikliklerine neden olacak kadar büyük bir inmeye ihtiyacımız vardı, ancak malzememizin nöral progenitör hücreler üzerindeki etkisini incelemeyi amaçladığımız subventriküler bölgeye müdahale etmedik. İnme boyutuna ek olarak, enjekte etmek için en uygun jel hacmini belirlememiz gerekiyordu. En azından, inme boşluğunu tamamen doldurmak için yeterli jele ihtiyacımız vardı, çünkü jel ve çevre doku arasındaki boşlukların kontrol gruplarımızla benzer sonuçlara yol açtığını, jel ve doku arasındaki temasın ise daha az reaktif astrosit ve hücresel infiltrasyonun artmasına neden olduğunu gördük. Enjekte edildikten sonra hiçbir yan etki üretmeyen 4-6 μL jelin daha düşük bir sınırına ulaştık (yayınlanmamış veriler).
İnme sonucunun değerlendirilmesi ile ilgili olarak, IHC lekelemenin ötesinde manyetik rezonans görüntüleme, davranış testleri, histolojik analiz ve TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium klorür) boyama gibi çeşitli seçenekler vardır. Kullanım kolaylığı ve anında sonuçları nedeniyle inmenin ön optimizasyonu için TTC kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Laboratuvarımızdaki önceki davranışsal testler Silindir testi / spontan ön ayak görevine, ızgara yürüyüş testlerine ve makarna testi12,21'ebakmıştır. Rotarod testinin PT inme yöntemi uygulandıktan sonra davranışsal sonuçlarda önemli düşüşler göstermediği unutulmamalıdır (veriler gösterilmemektedir). Bu nedenle, davranış testleri önemli kortikal giriş gerektiren çok karmaşık görevleri değerlendirmelidir.
Burada büyüme faktörleri veya hücrelerin teslimi olmadan inmeden hidrojel enjekte etme tekniğini gösterdik. Bununla birlikte, hidrojeller hücre naklinin yanı sıra ilaç ve büyüme faktörü doğumu için de kullanılmıştır ve hem inmeden sonra biyoloji eğitimi hem de yeni tedavi yöntemlerinin araştırılması için değerli bir kaynak olabilir. İnme bağlamında laboratuvarımız, indüklenmiş pluripotent kök hücre türevi nöral progenitör hücreleri14 , 18'i 25.000hücre / μL ila 50.000 hücre / μL jel arasında değişen konsantrasyonlarda kapsülleyen gözeneksiz hyaluronik asit hidrojelleri enjekte etti. Bir hidrojel kullanımı hücre canlılığında ve farklılaşmasında bir artışa neden oldu. Diğer laboratuvarlar da inme 22-24sonra kök hücre nakli için kullanılan hidrojellere yanıt olarak hücre farklılaşması ve doku yenilenmesinde artış bildirilmiştir. Ek olarak, inmeden sonra doku yenilenmesine ve davranışsal iyileşmeye yol açan büyüme faktörleri ile hidrojel enjekte ettik13,14. Malzeme tasarımı açısından enjekte edilebilirlik, istilacılığı en aza indirmeye yarayan değerli bir özelliktir; bu nedenle, hidrojeller statik koşullar altında sol jeller (sıvıdan katıya), kesme inceltme (G' > G" olarak formüle edilmelidir; G" > G' akış sırasında) veya çapı bir iğnenin iç çapından daha az olan yapı taşlarından oluşan granül jeller12,25,26. Optimizasyon daha sonra ilaçların veya büyüme faktörlerinin difüzyonunu, bir dizi hücre konsantrasyonu altında hücre canlılığını, jel koşullarını ve inmenin indüklenme zamanına göre hız, iğne göstergesi, enjeksiyon derinliği ve enjeksiyon günü gibi enjeksiyon parametrelerini test etmek için yapılmalıdır. Örneğin, malzeme enjeksiyon günü, inme sonrası bir gün ile inme sonrası üç hafta27,28arasında değişmektedir. Burada, beş gün rapor ediyoruz, ancak daha önce hücre nakli yaparken inmeden yedi gün sonra enjekte ettik. Bu günler, inflamatuar yanıtın zaman çizelgesine ve inmeden bir hafta sonra görülen anjiogenez ve nörogenezin pik aktivitesine göre seçildi5,29,30,31. İnme hacmi atrofi nedeniyle zamanla azalacağından, her enjeksiyon zaman noktasında hacim karakterizasyonu da yapılmalıdır. Bu parametrelerin enjeksiyondan önce optimize edilmiş olduğu göz önüne alındığında, buradaki yöntemler kullanıcılara hücre ve / veya büyüme faktörleri ve ilaçların eklenmesiyle biyomalzeme enjekte etmelerine rehberlik etmek için yeterlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, TS'nin MAP hidrojellerini ticarileştirmeye çalışan Tempo Therapeutics'in kurucusu olduğunu beyan ediyor.
Acknowledgments
Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü'nü finanse etmek için kabul etmek istiyoruz (R01NS079691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
- National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229 (2017).
- Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69 (2017).
- Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
- Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
- Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794 (2015).
- Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14 (2018).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
- Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
- Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
- Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
- Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
- Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
- Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
- Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
- Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
- Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
- Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
- Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943 (2017).
- Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
- Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
- Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
- Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
