Summary
El accidente cerebrovascular es un problema global con opciones de tratamiento mínimas y sin terapia clínica actual para regenerar el tejido cerebral perdido. Aquí describimos métodos para crear un accidente cerebrovascular fototrombótico preciso en la corteza motora de roedores y la posterior inyección de biomateriales de hidrogel para estudiar sus efectos sobre la regeneración de tejidos después del accidente cerebrovascular.
Abstract
El accidente cerebrovascular es la principal causa de discapacidad y la quinta causa principal de muerte en los Estados Unidos. Aproximadamente el 87% de todos los accidentes cerebrovasculares son accidentes cerebrovasculares isquémicos y se definen como el bloqueo repentino de un vaso que suministra sangre al cerebro. A los pocos minutos de la obstrucción, las células comienzan a morir y resultan en daños irreparables en los tejidos. Los tratamientos terapéuticos actuales se centran en la eliminación de coágulos o lisis para permitir la reperfusión y prevenir daños cerebrales más graves. Aunque la plasticidad cerebral transitoria puede salvar parte del tejido dañado con el tiempo, fracciones significativas de pacientes quedan con déficits neurológicos que nunca se resolverán. Existe una falta de opciones terapéuticas para tratar los déficits neurológicos causados por el accidente cerebrovascular, lo que enfatiza la necesidad de desarrollar nuevas estrategias para tratar a esta creciente población de pacientes. Los biomateriales inyectables se están diseñando actualmente para mejorar la plasticidad cerebral y mejorar la reparación endógena a través de la administración de agentes activos o células madre. Un método para probar estos enfoques es utilizar un modelo de accidente cerebrovascular de roedor, inyectar el biomaterial en el núcleo del accidente cerebrovascular y evaluar la reparación. Conocer la ubicación precisa del núcleo del accidente cerebrovascular es imperativo para el tratamiento preciso después del accidente cerebrovascular, por lo tanto, es preferible un modelo de accidente cerebrovascular que resulte en una ubicación predecible del accidente cerebrovascular para evitar la necesidad de imágenes antes de la inyección. El siguiente protocolo cubrirá cómo inducir un accidente cerebrovascular fototrombótico, cómo inyectar un hidrogel de manera controlada y precisa, y cómo extraer y crioseccionar el cerebro mientras se mantiene intacto el biomaterial. Además, destacaremos cómo estos mismos materiales de hidrogel se pueden utilizar para la co-entrega de células madre. Este protocolo se puede generalizar al uso de otros biomateriales inyectables en el núcleo del accidente cerebrovascular.
Introduction
El accidente cerebrovascular es la principal causa de discapacidad y la quinta causa principal de muerte en los Estados Unidos1. Aproximadamente el 87% de todos los accidentes cerebrovasculares son isquémicos, mientras que la mayoría del 13% restante son hemorrágicos2. Un accidente cerebrovascular isquémico se define como el bloqueo del flujo sanguíneo en una arteria al tejido circundante. Esta oclusión resulta en la privación de oxígeno y la necrosis posterior que a menudo conduce a la discapacidad permanente en los pacientes sobrevivientes. Si bien ha habido una disminución en la tasa de mortalidad del accidente cerebrovascular3,se espera que su prevalencia aumente a 3,4 millones de personas para 20304. Este aumento en los sobrevivientes discapacitados y la consiguiente carga económica ha llevado a un impulso para la investigación del accidente cerebrovascular que se centra en los mecanismos de reparación neuronal. Después del accidente cerebrovascular hay un período inflamatorio que conduce a la formación de una cicatriz que impide que la región necrótica se expanda. La región que rodea el núcleo necrótico se denomina "peri-infarto" y hay una fuerte evidencia de que la plasticidad en esta región, que incluye el aumento de la angiogénesis, la neurogénesis y la brotación axonal, está directamente relacionada con la recuperación observada en modelos animales y humanos5. Dado que no hay modelos in vitro que puedan replicar adecuadamente las interacciones complejas después del accidente cerebrovascular, los modelos animales son esenciales para la investigación del accidente cerebrovascular.
Hay varios modelos in vivo que se pueden utilizar para producir accidente cerebrovascular isquémico. Uno de los modelos más comunes utilizados en ratones es la oclusión de la arteria cerebral media, o MCAo, a través de la oclusión distal o proximal (a través del filamento intraarterial). El modelo proximal, también conocido como filamento MCAo (fMCAo), generalmente resulta en grandes accidentes cerebrovasculares isquémicos que abarcan entre el 5% y el 50% del hemisferio cerebral, dependiendo del número de factores6. En estos modelos, una sutura o filamento se avanza desde la arteria carótida interna hasta la base de la arteria cerebral media (MCA) y se mantiene en su lugar durante un período de tiempo específico. Este método de oclusión, que puede hacerse temporal o permanente, produce un infarto que se centra en el cuerpo estriado y puede o no implicar la corteza suprayacente6. El tamaño del accidente cerebrovascular resultante es muy variable, y se requieren técnicas de imagen, como el doppler láser, para confirmar la efectividad del procedimiento en cada ratón. La oclusión del filamento intraarterial o intraluminal que dura más de 30 minutos produce accidentes cerebrovasculares en el extremo más grande del rango de tamaño. Algunos investigadores se han centrado en tiempos de oclusión de filamentos más cortos, que requieren un enfoque experimental sustancial y validación de laboratorio7. Los modelos de MCAo de filamento en ratones siguen etapas similares de muerte celular, progresión isquémica y formación de una región periinfarto como se ve en los casos de accidente cerebrovascular humano; sin embargo, los accidentes cerebrovasculares más grandes se parecen más al estado de enfermedad de los infartos cerebrales malignos, que son menos comunes, menos tratables accidentes cerebrovasculares humanos6. Mientras tanto, la oclusión distal de MCA requiere una cirugía y una craniectomía más involucradas. En este modelo, la parte distal del MCA que corre a lo largo de la superficie del cerebro se ocluye directamente con una atadura de sutura o cauterización. En algunas variaciones de la técnica, las arterias carótidas se ocluyen unilateral o transitoriamente-bilateralmente. Un beneficio del MCAo distal es que produce un trazo basado en cortical que es menos variable en tamaño que el modelo de filamento. Sin embargo, el modelo distal produce una producción conductual más pobre debido a la transección de la arteria carótida externa (ECA), que también es una preocupación con fMCAo6.
Un modelo alternativo de accidente cerebrovascular que es conocido por ser menos invasivo es el modelo fototrombótico (PT). El modelo de PT da como resultado una localización bien definida de la isquemia y se asocia con una alta tasa de supervivencia8. La técnica se basa en un tinte fotosensible inyectado por vía intraperitoneal que permite la fotooxidación intravascular simplemente irradiando el tejido deseado con una luz o láser9. Tras la excitación, se forman radicales de oxígeno que causan daño endotelial, lo que activa la agregación plaquetaria y la formación de coágulos en el área irradiada8,9. El estricto control sobre el tamaño y la ubicación del trazo, así como la alta reproducibilidad del modelo PT, lo hacen ideal para estudiar biomateriales. Si bien la precisión es posible utilizando un láser y coordenadas estereotáxicas, hay algunas desventajas que pueden hacer que este modelo sea menos ideal para pocos estudios. A diferencia del modelo fMCAo, el modelo de carrera PT no se puede volver a perfundir. Por lo tanto, los materiales para investigar los agentes neuroprotectores específicos de los daños después de la reperfusión o los mecanismos posteriores a la reperfusión no serían útiles aquí8. Además, debido al insulto microvascular del modelo PT, se observa penumbra isquémica relativamente pequeña. En cambio, se produce edema vasogénico local, que no es característico del accidente cerebrovascular humano, lo que hace que este modelo sea indeseable para los estudios farmacológicos preclínicos centrados en el área del periinfarto6,8.
El objetivo general de las estrategias de biomateriales en el accidente cerebrovascular es administrar agentes bioactivos o actuar como una matriz extracelular sustituta para el crecimiento del tejido cerebral. Una estrategia que exploraremos utilizando nuestros métodos es administrar hidrogel directamente en el núcleo del accidente cerebrovascular, a diferencia del tejido periinfarto donde se administran muchas terapias celulares actuales10. La justificación de este enfoque es que la entrega en el tejido necrótico que se encuentra en el núcleo evitará interrumpir el tejido sano circundante o en recuperación. Suponemos que la difusión de cualquier agente activo incluido dentro del biomaterial podrá alcanzar el peri-infarto desde el núcleo, especialmente porque encontramos que la entrega de biomateriales de hidrogel reduce el grosor de la cicatriz glial11. Esto es importante ya que se ha demostrado que la región periinfarto exhibe neuroplasticidad después del accidente cerebrovascular, lo que la convierte en un objetivo atractivo. Además, la entrega de una matriz sustituta al núcleo del accidente cerebrovascular se puede cargar con12 factores angiogénicos o13 neurogénicos para guiar la formación de tejido nuevo, así como células para el parto14. La entrega celular se mejora en gran medida mediante el uso de una matriz porque protege a las células de las fuerzas de inyección severas y el entorno local presente durante la entrega, así como fomenta la diferenciación y el injerto15.
Estos biomateriales terapéuticos inyectables tienen relevancia clínica en aplicaciones de accidente cerebrovascular, ya que actualmente no existen terapias médicas que estimulen la recuperación neuronal después del accidente cerebrovascular. Los circuitos neuronales subyacentes involucrados en la recuperación se encuentran en el tejido cerebral que está adyacente al núcleo del accidente cerebrovascular16,mientras que el núcleo del accidente cerebrovascular en sí está desprovisto de tejido neural viable. Anticipamos que la entrega de un biomaterial en el núcleo del accidente cerebrovascular necrótico tiene el potencial de estimular el tejido adyacente hacia procesos regenerativos a través de una serie de mecanismos mencionados anteriormente, incluida la liberación de factores de crecimiento de depósito13,la estimulación del crecimiento del tejido y la promoción del desarrollo del tejido cerebral en recuperación11,12, la alteración de las respuestas inmunes17y la entrega de terapias derivadas de células madre14, 18. Sin embargo, para estudiar eficazmente la posibilidad de estas aplicaciones, se necesita un método consistente y reproducible para inducir el accidente cerebrovascular e inyectar biomateriales. El modelo de trazo PT utiliza técnicas que ofrecen un control preciso sobre la orientación y la ubicación del trazo. Un láser conectado al dispositivo estereotáxico guía las orientaciones, y las bombas conectadas a los dispositivos estereotáxicos controlan la velocidad de inyección del material sin la necesidad de formas adicionales de imágenes. Por lo tanto, hemos optado por describir los métodos para realizar un accidente cerebrovascular PT en las cortezas motoras de ratones y para inyectar biomateriales en el núcleo del accidente cerebrovascular. Aquí, utilizamos hidrogeles de partículas recocidas microporosas (MAP) como biomaterial para inyección sin células añadidas ni factores de crecimiento. Además, explicamos cómo recuperar con éxito el cerebro con biomaterial intacto, y discutimos los ensayos de inmunoquímica utilizados para analizar el resultado del accidente cerebrovascular con y sin inyección de biomateriales.
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Protocol
Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con IUCAC en la Universidad de Duke y la Universidad de California en Los Ángeles. En este estudio se utilizaron ratones machos C57Bl/6J de 8 a 12 semanas de edad. Los animales fueron alojados a temperatura controlada (22 ± 2 °C), con un período de ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso a alimentos granulados y agua ad libitum. Los protocolos de analgesia y sedación se describen como aprobados por el IUCAC, pero pueden diferir de los protocolos utilizados en otros laboratorios.
Los animales pueden ser sacrificados prematuramente si experimentan inquietud excesiva, vocalización (lo que indica dolor incontrolable), autotraumatismo, disminución o deterioro de la movilidad, signos físicos de infección dérmica, pérdida de apetito y / o pérdida de peso superior al 10% -15% como resultado de la cirugía de supervivencia. No hay efectos adversos anticipados de la inyección del gel, ya que está compuesto por un polímero natural dentro del cerebro. Los animales deben ser monitoreados diariamente, incluidos los fines de semana y días festivos, y volver a pesar cada dos días. Los estudios de nuestro laboratorio y otros no han encontrado déficits en el aseo, pérdida de peso corporal o signos / síntomas de abstinencia o estrés crónico en ratones después de estos pequeños accidentes cerebrovasculares corticales o subcorticales. Si los animales presentan algún signo de infección local de la herida en la cabeza, deben ser sacrificados. Los animales también deben ser monitoreados para detectar un aseo deficiente, condición de la herida y evidencia de peleas entre animales (heridas en la espalda). Si hay evidencia de peleas o dehiscencia de heridas, los animales primero deben ser tratados después de contactar a los veterinarios. Esto a menudo implica antibiótico en el agua y / o aplicación local de antibióticos tópicos. Si estas medidas no producen curación, los animales deben ser sacrificados.
1. Preparación de materiales e instrumentos
- Preparar el tinte fototrombótico antes de la cirugía. Pesar 15 mg de Rosa de Bengala en un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
PRECAUCIÓN: La rosa de Bengala puede causar daño/ irritación ocular grave.- Disuelva la rosa de Bengala en 1,5 ml de PBS 1x filtrado estéril para hacer una concentración de trabajo de 10 mg / ml.
- Vórtice el tubo hasta que no se vean grumos, lo que indica que el tinte se ha disuelto por completo, luego cúbralo con papel de aluminio hasta su uso posterior.
NOTA: La cantidad de tinte requerida dependerá del número de ratones. El colorante se inyecta IP intraperitonealmente a una concentración de 10 μL/g, por ejemplo, 200 μL para un ratón de 20 g.
- Encienda la almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón durante la anestesia (37 °C).
- Prepare tijeras en autoclave, fórceps, algodón, ungüento para ojos veterinarios, pegamento quirúrgico o material de sutura, un marcador quirúrgico azul o negro y toallitas estériles de alcohol y beta yodo. Prepare la perforación ósea con cabezales de broca esterilizados.
- Encienda la esterilización de cuentas a 160 ° C para permitir la esterilización de instrumentos entre la cirugía de ratones. Reservar un tubo cónico de 50 ml de solución salina estéril o 1 solución de PBS para su uso posterior en el mantenimiento de un área de operación hidratada.
- Conecte el láser al dispositivo estereotáxico. Usando gafas de seguridad láser, mida la potencia del láser (mW).
PRECAUCIÓN: Use gafas de seguridad láser cada vez que se encienda el láser en el procedimiento.- Ajuste la corriente en la consola láser, siguiendo las instrucciones de fabricación láser, hasta que la potencia de salida láser lea 10 mW, y configure la corriente como preestablecida en la consola de la pantalla de inicio. Luego ajuste la corriente nuevamente para establecer otro preestablecido donde la potencia de salida del láser lea 40 mW. Ahora apague el láser hasta su uso posterior.
NOTA: Los 10 mW se utilizarán para orientar el láser antes de su uso.
- Ajuste la corriente en la consola láser, siguiendo las instrucciones de fabricación láser, hasta que la potencia de salida láser lea 10 mW, y configure la corriente como preestablecida en la consola de la pantalla de inicio. Luego ajuste la corriente nuevamente para establecer otro preestablecido donde la potencia de salida del láser lea 40 mW. Ahora apague el láser hasta su uso posterior.
- Prepare una jaula limpia para ratones después de la cirugía. Luego, coloque al ratón en la cámara de inducción con una concentración de isoflurano del 4% para anestesiarlo hasta que el movimiento espontáneo se detenga y su respiración llegue a un ritmo lento y constante.
- Una vez dormido, pesa al ratón para determinar cuánto tinte de rosa de Bengala inyectar. Luego, transfiera y asegure el mouse al dispositivo estereotáxico con una concentración de isoflurano de mantenimiento del 1.5%.
NOTA: El aumento de las concentraciones de isoflurano puede dilatar los vasos y prevenir la oclusión suficiente o los accidentes cerebrovasculares de tamaño constante entre ratones. - Aplique ungüento para ojos veterinarios en ambos ojos.
NOTA: Observe la respiración y la temperatura durante todo el procedimiento y pellizque los dedos de los pies de vez en cuando para asegurarse de que el mouse no pueda sentir nada.
2. Trazo fototrombótico modelo9
- Afeitar el pelaje de la cabeza del ratón y preparar asépticamente el área usando una toallita con alcohol seguida de una toallita con beta yodo. Repetir tres veces.
NOTA: Si es necesario, use una toallita con alcohol adicional al final para limpiar todo el beta yodo, ya que causa irritación de la piel que lleva a los ratones a picar su cráneo después de la cirugía. - Usando tijeras de operación pequeñas, haga una incisión lateral entre las orejas y los ojos, aproximadamente 1-2 cm. Haga esto tirando de la piel hacia arriba con fórceps para crear una tienda de campaña, cortando una vez hacia abajo, luego insertando las tijeras en la abertura y creando una incisión continua en la línea media.
- Separe la piel y presione ligeramente sobre los huesos parietales con las pinzas para localizar el bregma. Marque el bregma con un punto usando el marcador quirúrgico.
NOTA: El movimiento del fragmento óseo resalta el borde frontal de los huesos parietales. El bregma es el punto central en el que se encuentran los fragmentos óseos frontales y parietales(Figura 1A). - Usando gafas de seguridad láser, mueva el láser sobre el cráneo del mouse, fijando el dispositivo estereotáxico en un ángulo de 90 °. Seleccione el preestablecido de 10 mW y encienda el láser.
- Ajuste los ejes X e Y del láser hasta que esté directamente sobre el bregma. Restablezca la x y la y en la consola de la pantalla digital y, a continuación, mueva el láser 1,8 mm a la izquierda del bregma. Ahora lleve el láser lo más cerca posible del cráneo sin dejar que toque el cráneo.
- Mueva el láser a 2,2 mm a la izquierda del bregma para asegurarse de que pueda moverse sin obstrucciones. Apague el láser.
- Inyecte la cantidad adecuada de colorante de rosa de Bengala por vía intraperitoneal (IP) con una aguja desechable de 29 G. Inicie inmediatamente un temporizador durante 7 minutos para permitir que el tinte circule sistémicamente. Seleccione el preestablecido para 40 mW sin encender el láser.
NOTA: Una vez que se sienta cómodo con el procedimiento, el tinte se puede inyectar antes de la preparación aséptica del ratón y terminar antes de que terminen los 7 minutos para ahorrar tiempo. - Encienda el láser (40 mW) cuando se apague el temporizador de 7 minutos, mientras usa gafas de seguridad láser, y configure un temporizador de 10 minutos.
- Después de 10 minutos, mueva el láser a 2,2 mm a la izquierda del bregma sin apagarlo y configure otro temporizador de 10 minutos.
- Una vez que el segundo temporizador de 10 minutos se haya apagado, cambie el láser de nuevo a 10 mW y mueva el láser a 2,0 mm a la izquierda del bregma. Marque este punto con el marcador quirúrgico. A continuación, apague el láser.
- Levante el láser y desbloquéelo desde el ángulo de 90 ° para que pueda alejarse del mouse. En este punto, aplique la solución salina estéril o PBS con algodón si el área quirúrgica está seca.
- Perfore pequeñas ráfagas en la marca de 2,0 mm perpendicular a la superficie del cráneo.
NOTA: Tenga cuidado de perforar lentamente para evitar perforar demasiado profundamente y golpear el cerebro. Habrá una ligera caída / cambio en la resistencia una vez que el taladro haya atravesado el cráneo, y la perforación puede causar sangrado.- Use algodón para absorber cualquier exceso de sangre. Es típico ver algo de sangre de las arterias cortadas en el cráneo después de la perforación: el exceso de sangre significa que la broca golpea el cerebro. Si esto sucede, registre el identificador del mouse y continúe.
- Coloque una pequeña toallita junto al mouse. Usando las pinzas, tire de la piel muy junta para prepararse para el pegado.
NOTA: La sutura se puede hacer aquí en su lugar. La sutura generalmente requiere solo 3 suturas.- Usando las pinzas, agarre los dos lados de la piel y tire de ellos juntos y hacia arriba. Frote cualquier gota grande de pegamento quirúrgico al final de la punta en la toallita antes de aplicar al mouse.
- Aplique el pegamento quirúrgico con moderación y mantenga la piel unida con fórceps durante 10 s. Continúe hasta que no haya aberturas visibles.
NOTA: El pegamento sale rápidamente, no apriete la botella. Evite pegar la piel al cráneo o pegar pegamento en el ojo.
- Después de pegar o suturar, coloque al ratón en la nueva jaula para recuperarse de la anestesia. El animal tarda de 5 a 10 minutos en recuperarse, y ayuda a descansar la mitad de la jaula en una almohadilla térmica.
3. Operación de accidente cerebrovascular simulado
- Realice todos los procedimientos de manera idéntica a la operación descrita anteriormente en la sección 2, excepto inyectar 1x PBS o solución salina en lugar de colorante rosa de Bengala.
4. Inyección de hidrogel u otros biomateriales
- Realizar la inyección de biomateriales en un momento definido por el usuario. En este experimento, las inyecciones se realizaron entre 5 y 7 días después del accidente cerebrovascular. Se inyectan 2 - 6 μL de hidrogel (definido por el usuario).
- Encienda la almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón durante la anestesia (37 °C).
- Prepare tijeras en autoclave, fórceps, algodón, ungüento para ojos veterinarios, pegamento quirúrgico o material de sutura, y toallitas estériles con alcohol y beta yodo. Prepare el taladro óseo con cabezales de broca estériles y las jeringas Hamilton de vidrio de 25 μL con agujas metálicas de 30 G.
- Encienda la esterilización de cuentas a 160 ° C para permitir la esterilización de instrumentos entre ratones.
- Conecte las bombas de inyección al dispositivo estereotáxico. Ajuste el caudal a 1 μL/min y ajuste el volumen a 4 μL.
- Prepare una jaula limpia para los ratones después de la cirugía.
- Coloque el ratón en la cámara de inducción con una concentración de isoflurano del 4% para anestesiarlo hasta que el movimiento espontáneo se detenga y su respiración llegue a un ritmo lento y constante.
- Una vez dormido, transfiera y asegure el ratón al dispositivo estereotáxico con una concentración de isoflurano de mantenimiento del 1,5%.
- Aplique el ungüento para ojos veterinarios en ambos ojos.
- Afeitar cualquier pelaje que pueda haber vuelto a crecer de la cabeza del ratón y preparar asépticamente el área usando una toallita con alcohol seguida de una toallita con beta yodo. Repetir tres veces.
NOTA: Si es necesario, use una toallita con alcohol adicional al final para limpiar todo el beta yodo, ya que causa irritación de la piel y lleva a los ratones a picar su cráneo después de la cirugía.
- Usando las tijeras pequeñas y / o fórceps, vuelva a abrir la piel por encima del cerebro. Use algodón con solución salina estéril o PBS para limpiar cualquier residuo del cráneo. Un círculo blanco-amarillo (el trazo, Figura 1B)y el orificio de rebaba del taladro serán visibles. Si el tejido muerto no es visible, es probable que no se haya producido ningún accidente cerebrovascular. Si el orificio de rebaba no está centrado por encima de la carrera, vuelva a perforar para centrarlo.
- Oriente la bomba de inyección sobre el ratón y bloquee a 90°. Limpie la jeringa con solución salina estéril o PBS antes de volver a cargar el material.
- Una vez limpia, desmonta la jeringa de vidrio para que no quede aguja. Retrocargue la jeringa utilizando una pipeta de desplazamiento positivo de 25 μL con los 10 μL de hidrogel (u otro biomaterial aquí con o sin células).
- Usando el émbolo de la jeringa, empuje el gel hasta la parte frontal de la jeringa. Luego, vuelva a montar la jeringa y continúe empujando hasta que el gel exuda visiblemente de la aguja.
- Coloque la jeringa en la bomba. Es posible que sea necesario ajustar la parte posterior de la bomba para que la jeringa se ajuste. Para ello, ajuste el caudal a 30 μL/min, seleccione Retirada o Inyección en función de la dirección en la que necesite moverse y, a continuación, pulse Inicio. Presione Detener cuando la parte posterior de la bomba esté en la ubicación correcta.
- Atornille la parte posterior de la bomba para que la jeringa esté segura. Si se realizaron ajustes anteriormente, asegúrese de que el caudal se haya ajustado a 1 μL/min y esté configurado para inyectar.
- Mueva la bomba en la dirección x e y para orientarla sobre el orificio. Mueva la bomba hacia abajo en la dirección z hasta que la aguja de la jeringa toque la parte superior del orificio.
- Restablezca la z en la consola de la pantalla digital. A continuación, mueva la jeringa hacia abajo en la dirección z 0,750 mm. Si la jeringa se dobla o hay resistencia, el cráneo se curó o no se perforó por completo y debe volver a perforarse.
- Pulse Start en la consola de la bomba para inyectar de 4 a 6 μL del hidrogel a una velocidad de 1 μL/min.
- Establezca un temporizador de 5 minutos cuando la bomba deje de inyectar para permitir que el gel comience a reticularse.
- Después de 5 minutos, levante lentamente la jeringa girando el z nob. Observe si algún material se extrae accidentalmente o se escapa del agujero. Desbloquee la bomba y aléjela del ratón cuando la aguja esté lo suficientemente lejos del cráneo.
- Usando fórceps, pegamento quirúrgico o suturas, cierre la piel por encima de la cabeza. Coloque el ratón en la jaula limpia y observe su recuperación. El ratón debe tardar entre 5 y 10 minutos en recuperarse de la anestesia.
5. Perfusión y recogida de muestras
- Anestesiar el ratón usando isoflurano.
- Fije al animal en posición supina y abra la cavidad abdominal con un corte mediano. Opcionalmente, sujete la aorta abdominal descendente para usar menos fijador y PBS.
- Abra el diafragma y muévase hacia arriba por los lados de la caja torácica para abrir la cavidad torácica. Inserte una cánula de perfusión en el ventrículo izquierdo y corte una abertura en la aurícula derecha. Comience a perfundirse lentamente con 10-20 ml de PBS o hasta que el líquido corra semi-claro.
- Una vez despejado, cambie a 4% de PFA por otros 10 – 20 ml. Desanclar los brazos les permite contraerse a medida que el PFA se infunde. Una vez que dejen de moverse, espere otros 30 s.
- Decapita al animal y tira hacia atrás de la piel para exponer el cráneo. Usando fórceps contundentes y delgados, retire cuidadosamente las piezas del cráneo para exponer el cerebro. Se debe tener especial cuidado al extraer el cráneo por encima del sitio del accidente cerebrovascular. Aquí se pueden usar tijeras quirúrgicas pequeñas para ayudar a cortar el cráneo. El mayor desafío es que el gel se adhiera al cráneo y salga del cerebro a medida que se extrae el cráneo.
- Una vez que el cerebro esté separado, coloque en 10 – 15 ml de PFA al 4% durante la noche (no más de 24 h).
- Mueva los cerebros de PFA a 30% de sacarosa al día siguiente. El cerebro está listo para la criosección una vez que se hunde hasta el fondo (aproximadamente 2 – 3 días). También se puede dejar para almacenamiento en este punto.
6. Crioseccionamiento y tinción
- Saque el cerebro de la sacarosa y colóquelo en un portaobjetos de vidrio. Corta una pequeña porción de la parte posterior del cerebro con una cuchilla de afeitar para crear una porción plana que se montará en un mandril.
- Coloque una cucharada de Compuesto de Temperatura óptima de corte (OCT) en el mandril, y luego coloque el cerebro, plano hacia abajo, sobre el mandril en el OCT. Coloque esta muestra en hielo seco hasta que se congele o en el criostato en el bloque de congelación.
NOTA: La OCT se puede agregar para abarcar completamente el cerebro para ayudar a evitar que el material se separe del cerebro durante la sección.
- Coloque una cucharada de Compuesto de Temperatura óptima de corte (OCT) en el mandril, y luego coloque el cerebro, plano hacia abajo, sobre el mandril en el OCT. Coloque esta muestra en hielo seco hasta que se congele o en el criostato en el bloque de congelación.
- Corte los cerebros en serie en un criostato a -20 °C a secciones de 30 μm de espesor en 10 diapositivas recubiertas de gelatina. Tenga cuidado al seccionar asegurándose de no perder el hidrogel. Si esta parte es difícil, coloque un poco de OCT en la parte superior del cerebro sobre el gel(Figura 3). Conservar a -80 °C hasta su uso posterior.
- Saque los toboganes de los -80 °C y colóquelos en una bandeja de tinción para que se sequen. Las diapositivas que no se han congelado, sino que solo se han seccionado, también se pueden manchar de inmediato.
- Usando una pluma hidrofóbica, dibuja un círculo alrededor de las rodajas cerebrales en la diapositiva. Una vez seco, rehidrate las rodajas cerebrales con 1x PBS filtrado y colóquelas en un agitador a temperatura ambiente durante 15 min. Esto toma aproximadamente 1 ml de búfer por diapositiva con 9 a 12 secciones cerebrales.
- Lave las diapositivas con 1x PBS filtrado durante 5 minutos a temperatura ambiente, repita tres veces.
- Bloquee los toboganes durante 30 minutos a una hora con suero de burro al 10% en PBS-Tritón X al 0,01% a temperatura ambiente en la bailarina del vientre. Esto toma alrededor de 200 μL por diapositiva.
- Incubar el anticuerpo primario en suero de burro al 10% con PBS-Triton X al 0,01% durante la noche a 4 °C en un agitador. Pruebe primero los anticuerpos primarios para determinar las concentraciones correctas. Aquí se utilizaron GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500)(Figura 4).
- Lave las diapositivas con 1x PBS filtrado al día siguiente durante 5 minutos a temperatura ambiente, repita tres veces.
- Incubar con anticuerpos secundarios en suero de burro al 10% en PBS-Triton X al 0,01% y DAPI durante 2 h en el agitador de laboratorio a temperatura ambiente. 1:1.000 se utilizó para todos los secundarios y DAPI.
- Lave las diapositivas durante 5 minutos con 1x PBS filtrado.
- Deje que las secciones se sequen a temperatura ambiente en la oscuridad. Esto puede tomar de 20 minutos a 4 h; colocar las diapositivas en un desecador puede acelerar el proceso.
- La deshidratación se desliza en concentraciones ascendentes de alcohol (1 min por solución) de 50%, 70%, 95%, 100% y 100%.
- Desgrasar en el primer baño de xileno durante 1 min, luego en el segundo baño de xileno durante 5 min.
- Saque rápidamente las diapositivas una por una y agregue medio de montaje mientras las secciones del cerebro están húmedas con xileno. Agregue rápidamente una funda de vidrio en la parte superior. Use un resbalón de cubierta que sea de la longitud y el grosor correctos necesarios para el portaobjetos y el microscopio utilizados para la obtención de imágenes, respectivamente.
- Deshágase de las burbujas debajo de la cubierta presionando suavemente con una punta de pipeta en un movimiento hacia afuera desde el centro de la diapositiva. Deje que DPX se seque durante 4 h hasta pasar la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Use una cuchilla de afeitar para raspar cualquier medio de montaje seco que se haya derramado sobre las diapositivas. Limpie las diapositivas con el limpiador de lentes. Las diapositivas ahora se pueden obtener imágenes con microscopía de fluorescencia.
NOTA: Es mejor almacenar la diapositiva en la oscuridad o a 4 °C hasta que finalicen las imágenes.
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Representative Results
El objetivo de este método era demostrar cómo inyectar biomateriales en el cerebro después de un accidente cerebrovascular. Se utilizó un modelo fototrombótico con rosa de bengala y un láser de 520 nm para la orientación controlada de la lesión del accidente cerebrovascular tanto en tamaño como en ubicación. Cinco días después del accidente cerebrovascular, el infarto se pudo visualizar durante la cirugía(Figura 1B)y mediante TTC e imágenes de diapositivas teñidas de IHC(Figura 2). Un aumento en el diámetro del láser con una lente 2x conduce a un aumento visual en la lesión del accidente cerebrovascular que abarcó más de 2,5 mm en comparación con una sola sección de 1 mm con el láser solamente(Figura 2). La mortalidad durante la cirugía con el modelo PT rara vez ocurrió, menos del 1%, debido al procedimiento mínimamente invasivo. La muerte después de la cirugía también fue baja y se observó en menos del 5% de los ratones.
Las micropartículas de hidrogel a base de ácido hialurónico (HMP) se inyectaron cinco días después del accidente cerebrovascular(Figura 3). Los HMP anneal después de la inyección en la lesión del accidente cerebrovascular para formar partículas microanneadas (MAP) con un andamio poroso que permitió la migración celular al núcleo del accidente cerebrovascular (Figura 4). Diez días después de la inyección, los ratones fueron perfundidos con 4% de PFA y sus cerebros fueron extraídos, colocados en 4% de PFA durante la noche, y luego en sacarosa al 30% durante dos días antes de que fueran congelados y seccionados para tinción y análisis de IHC.
Trabajos previos en nuestro laboratorio demostraron la inyección de hidrogeles MAP en la lesión del ictus cinco días después del ictus26. La inyección de hidrogeles hialurónicos que coinciden con el módulo de la corteza condujo a una disminución significativa de los astrocitos reactivos dentro del peri-infarto, así como dentro del gel MAP. Además, la microglía que también estaba dentro del hidrogel expresó marcadores M2 pro-reparación. Esto sugiere que el hidrogel MAP puede reducir la reactividad de los astrocitos en solo dos días después de las inyecciones y promover un ambiente más antiinflamatorio con astrocitos y microglía pro-recuperación(Figura 5).
Figura 1: Representación esquemática de bregma y localización del trazo. (A) Los lóbulos parietales se unen en la parte superior para formar el bregma. La colocación del láser se centró 2,0 mm a la izquierda del bregma. (B) La conformación visual del accidente cerebrovascular y el orificio de rebaba se observaron 5 días después del accidente cerebrovascular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Secciones coronales que abarcan el infarto. (A) Secciones IHC seriales de cerebros 5 días después del accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular con láser solo (arriba) y lente 2x (abajo). Las rebanadas tenían un grosor de 30 μm con cada sección a 300 μm de distancia de la sección anterior. (B) Tinción IHC ampliada, barra de escala de 500 μm. Los núcleos (DAPI) se muestran en azul, los astrocitos (GFAP+) en rojo y los microgliales (Iba1+) en verde, con aumento de 4x. (C) Secciones de cerebros teñidas con TTC para visualizar el volumen de la lesión 5 días después del accidente cerebrovascular, secciones de 1 mm de espesor con barra de escala de 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inyección y visualización de biomaterial. (A) Visual de la inyección de gel durante la cirugía. (B) El gel podría visualizarse a ojo al extraer el cráneo. (C)Una vez congelado y montado, el gel era visible en el cerebro mientras se seccionaba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tinciones inmunohistoquímicas de accidente cerebrovascular solo en comparación con accidente cerebrovascular con hidrogeles. (A) Esquema de cerebros crioseccionados de 30 μm de espesor. Se eligieron varias secciones en el medio para el análisis de imágenes. (B) Accidente cerebrovascular solamente, las manchas de inmunohistoquímica (IHC) 15 días después del accidente cerebrovascular. Las células de los astrocitos (GFAP+) se muestran en rojo, la microglía (Iba1+) es verde y los vasos (GLUT1+) son blancos. Accidente cerebrovascular + condición de hidrogel, IHC 10d después de la inyección, 15 días después del accidente cerebrovascular. Las células de los astrocitos (GFAP+) se muestran en rojo, la microglía (Iba1+) es verde, el material de hidrogel es blanco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efectos de los hidrogeles de partículas recocidas microporosas sobre los astrocitos reactivos y la microglía después del accidente cerebrovascular. (A) Esquema de la línea de tiempo experimental donde flecha significa día de trazo, + significa día de inyección, y x significa sacrificio y punto de tiempo de análisis. (B) Esquema de configuración del análisis que muestra dónde se tomaron imágenes y analizaron las secciones. (C) Imágenes de IHC que muestran la reactividad de los astrocitos a través de pERK, S100b, GFAP. (D) Cuantificación del porcentaje de pERK/GFAP de astrocitos altamente reactivos. (E) Cuantificación del porcentaje S100b/GFAP de astrocitos altamente reactivos. (F) Imágenes IHC de reactividad de la microglía a través de la tinción CD11b, Arg1 e iNOS. (G) Cuantificación de iNOS/Dapi para la determinación del fenotipo proinflamatorio microglial. (H) Cuantificación de Arg1/Dapi para la determinación del fenotipo microglial pro-reparación. Barra de escala total = 100 μm. El análisis estadístico se realizó en GraphPad Prism. * Los datos indicados se analizaron mediante la prueba post-hoc de Tukey y un intervalo de confianza del 95% con P<0,05. Los valores p individuales indicaron la prueba T. Esta cifra se modifica a partir de la ref.26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí demostramos un modelo de accidente cerebrovascular permanente fácilmente reproducible, mínimamente invasivo y describimos cómo inyectar un biomaterial en el infarto cinco días después del accidente cerebrovascular. El uso del tinte fototrombótico Rose Bengal y un láser colimado de 520 nm conectado al dispositivo estereotáxico nos da la capacidad de posicionar el trazo en la corteza motora del ratón con mayor precisión. Cinco días después del accidente cerebrovascular, la ubicación del infarto es visible a simple vista en el centro de la irradiación, 2,0 mm mediolateral al bregma. El hidrogel se inyecta con precisión en el núcleo de carrera utilizando bombas de jeringa. La mortalidad durante la cirugía y después del accidente cerebrovascular en este modelo está prácticamente ausente, con solo un puñado de ratones que mueren después de la cirugía debido a complicaciones anestesiológicas. A pesar de las ventajas de usar el accidente cerebrovascular PT para aplicaciones de biomateriales, existen varias limitaciones biológicas y dificultades técnicas que deben abordarse.
En términos de limitaciones biológicas, la PT no es un modelo de accidente cerebrovascular que ofrezca la opción de reperfusión cerebral, un proceso que puede ocurrir espontáneamente en accidentes cerebrovasculares humanos o en respuesta a la recuperación / lisis de coágulos endovasculares. Además, a diferencia del modelo MCAo que imita la etiología de la mayoría de los accidentes cerebrovasculares humanos al ocluir un vaso cerebral importante, la PT afecta el flujo sanguíneo a través de muchos vasos más pequeños. Una dificultad técnica de inyectar biomateriales de hidrogel es su tendencia a adherirse a la jeringa durante la cirugía o al cráneo durante las extracciones. Diseñar un hidrogel que permanezca como líquido durante la inyección y luego geles in situ puede abordar el primer problema; sin embargo, evitar que el gel se adhiera a la duramadre a menudo es inevitable ya que el sitio de inyección y el núcleo del accidente cerebrovascular residen en la superficie del cerebro. Esto puede dificultar la extracción del tejido cerebral mientras se mantiene intacto el biomaterial. Como tal, se debe tener especial cuidado al extraer trozos de cráneo del cerebro para garantizar que la duramadre no se levante con el cráneo y desarraigue involuntariamente el gel. La criosecciona cerebral también requiere habilidad técnica porque tanto el proceso de manipulación como la transección de la cuchilla pueden separar fácilmente el gel de su tejido circundante, lo que limita la recopilación de datos sobre la infiltración celular. El desprendimiento se exacerba cuando el material no está completamente integrado con el tejido. La preparación de la muestra con OCT crea una carcasa de refuerzo que ayuda a minimizar la separación del material durante el corte.
Antes de inyectar biomateriales, recomendamos optimizar el tamaño de carrera deseado dependiendo de la tensión del roedor y la configuración del laboratorio. Se pueden realizar infartos más pequeños o más grandes ajustando tres parámetros principales: intensidad de salida del láser, aumento del haz y tiempo de irradiación. Otros factores que también se ha demostrado que afectan el tamaño del accidente cerebrovascular incluyen la concentración de isoflurano19 y la cantidad de tiempo que se permite que el tinte circule antes de la irradiación. En cuanto a la intensidad de salida del láser (potencia/área o mW/cm2),encontramos que una potencia láser de 10 mW era suficiente para producir un pequeño infarto con diámetro horizontal ligeramente menor al del rayo láser. La mayor potencia del láser produjo infartos marginalmente más anchos pero sustancialmente más profundos (datos no mostrados) debido a que el rayo láser tenía un perfil de irradiación gaussiana. Al aumentar la intensidad, el punto central de máxima irradiancia puede penetrar más profundamente más allá del cráneo, así como causar un ligero aumento en la penetración del tamaño del punto del láser. Otros modelos de trazo han adelgazado el cráneo lijándolo antes de aplicar luz o láser con el fin de aumentar la penetración de la luz y la posterior reproducibilidad de la coagulación manteniendo una menor intensidad del láser20; sin embargo, esto puede causar hemorragia en el cráneo y toma una buena cantidad de tiempo durante la cirugía y la habilidad para dominar sin dañar accidentalmente el cerebro en el proceso. Similar a la intensidad, el aumento del diámetro del rayo láser también aumentó el tamaño del infarto; sin embargo, la intensidad del láser y el diámetro del haz no escalan linealmente entre sí, sino que siguen la ecuación, densidad de potencia = potencia del láser (w) /πr 2, donde son es el radio del haz. En cuanto al tiempo de irradiación, encontramos que se necesitaba un mínimo de 10 min para producir accidentes cerebrovasculares reproducibles. Para aumentar el diámetro horizontal del infarto mientras se mantiene constante la profundidad vertical, aplicamos el láser a ubicaciones adyacentes durante 10 minutos cada una, secuencialmente. Para abordar la influencia de la concentración de isoflurano y el tiempo de circulación de la rosa de bengala, encontramos que la concentración de isoflurano al 1,5% y los 7 minutos de circulación después de la inyección de IP dieron como resultado una formación constante de accidentes cerebrovasculares. Estos cinco parámetros fueron optimizados para nuestro uso particular. Se requirió un accidente cerebrovascular lo suficientemente grande como para causar cambios de comportamiento, pero sin interferir con la zona subventricular, donde nuestro objetivo era estudiar el efecto de nuestro material en las células progenitoras neurales. Además del tamaño de la carrera, también necesitábamos determinar el volumen óptimo de gel para inyectar. Como mínimo, necesitábamos suficiente gel para llenar completamente la cavidad del accidente cerebrovascular porque encontramos que los espacios entre el gel y el tejido circundante condujeron a resultados similares a los de nuestros grupos de control, mientras que el contacto entre el gel y el tejido resultó en menos astrocitos reactivos y una mayor infiltración celular. Se llegó a un límite inferior de 4-6 μL de gel, que no produjo efectos adversos después de la inyección (datos no publicados).
Con respecto a la evaluación del resultado del accidente cerebrovascular, hay varias opciones más allá de la tinción de IHC, como la resonancia magnética, las pruebas de comportamiento, el análisis histológico y la tinción TTC (cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio). Es muy recomendable utilizar TTC para la optimización preliminar del accidente cerebrovascular debido a su facilidad de uso y resultados inmediatos. Las pruebas de comportamiento anteriores en nuestro laboratorio han analizado la prueba de cilindro / tarea espontánea de la extremidad anterior, la prueba de caminar en cuadrícula y la prueba de pasta12,21. Cabe señalar que las pruebas de rotarod no mostraron disminuciones significativas en los resultados conductuales después de que se implementó el método de accidente cerebrovascular PT (datos no mostrados). Por lo tanto, las pruebas de comportamiento deben evaluar tareas muy complejas que requieren una entrada cortical significativa.
Aquí demostramos la técnica de inyectar hidrogeles después de un accidente cerebrovascular sin la entrega de factores de crecimiento o células. Sin embargo, los hidrogeles también se han utilizado para el trasplante de células, así como para la administración de fármacos y factores de crecimiento, y pueden resultar ser un recurso valioso tanto para estudiar la biología después del accidente cerebrovascular como para investigar nuevos métodos de terapia. En el contexto del accidente cerebrovascular, nuestro laboratorio ha inyectado hidrogeles de ácido hialurónico no poroso que encapsulan células progenitoras neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas14,18 a concentraciones que van desde 25,000 células / μL a 50,000 células / μL de gel. El uso de un hidrogel resultó en un aumento en la viabilidad y diferenciación celular. Otros laboratorios también han reportado diferenciación celular y aumento de la regeneración de tejidos en respuesta a hidrogeles utilizados para trasplantar células madre después de un accidente cerebrovascular 22-24. Además, hemos inyectado hidrogeles con factores de crecimiento después del accidente cerebrovascular que conducen a la regeneración de los tejidos y la mejora del comportamiento después del accidente cerebrovascular13,14. En términos de diseño de materiales, la inyectabilidad es una característica valiosa que sirve para minimizar la invasividad; por lo tanto, los hidrogeles deben formularse como sol-geles (líquido a sólido), adelgazamiento por cizallamiento (G' > G" en condiciones estáticas; G" > G' durante el flujo), o geles granulares compuestos por bloques de construcción cuyo diámetro es menor que el diámetro interior de una aguja12,25,26. Luego se debe realizar la optimización para probar la difusión de medicamentos o factores de crecimiento, la viabilidad celular bajo un rango de concentraciones celulares, las condiciones del gel y los parámetros de inyección, como la velocidad, el medidor de la aguja, la profundidad de la inyección y el día de la inyección en relación con el momento en que se indujo el accidente cerebrovascular. Por ejemplo, el día de la inyección de material ha variado desde un día después del accidente cerebrovascular hasta, hasta tres semanas después del accidente cerebrovascular27,28. Aquí, informamos cinco días, pero previamente nos inyectamos siete días después del accidente cerebrovascular al trasplantar células. Estos días se eligieron en función de la línea de tiempo de la respuesta inflamatoria, así como la actividad máxima de la angiogénesis y la neurogénesis observada una semana después del accidente cerebrovascular5,29,30,31. La caracterización del volumen también debe realizarse en cada punto de tiempo de inyección, ya que el volumen sistólico disminuirá con el tiempo debido a la atrofia. Dado que estos parámetros se optimizan antes de la inyección, los métodos aquí son suficientes para guiar a los usuarios a inyectar biomateriales con la adición de células y / o factores de crecimiento y medicamentos.
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Disclosures
Los autores declaran que TS es fundador de Tempo Therapeutics, que busca comercializar hidrogeles MAP.
Acknowledgments
Nos gusta reconocer a los Institutos Nacionales de Salud y al Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares por su financiación (R01NS079691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
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