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Articolo metodologico

Iniezione di scaffold di idrogel Biomateriale al cervello dopo l'ictus

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DOI:

10.3791/61450

⸱

1 ottobre 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Neurology, University of California Los Angeles, 3Department of Neurology, Duke University, 4Department of Dermatology, Duke University

In questo articolo

Sommario

L'ictus è un problema globale con opzioni di trattamento minime e nessuna terapia clinica attuale per rigenerare il tessuto cerebrale perso. Qui descriviamo i metodi per creare un preciso colpo fototrombotico nella corteccia motoria dei roditori e la successiva iniezione di biomateriali idrogel per studiare i loro effetti sulla rigenerazione dei tessuti dopo l'ictus.

Abstract

L'ictus è la principale causa di disabilità e la quinta causa di morte negli Stati Uniti. Circa l'87% di tutti gli ictus sono ictus ischemici e sono definiti come il blocco improvviso di un vaso che fornisce sangue al cervello. Entro pochi minuti dal blocco, le cellule iniziano a morire e provocano danni irreparabili ai tessuti. Gli attuali trattamenti terapeutici si concentrano sulla rimozione del coagulo o sulla lisi per consentire la riperfusione e prevenire danni cerebrali più gravi. Sebbene la plasticità cerebrale transitoria possa salvare parte del tessuto danneggiato nel tempo, frazioni significative di pazienti rimangono con deficit neurologici che non si risolveranno mai. C'è una mancanza di opzioni terapeutiche per trattare i deficit neurologici causati dall'ictus, sottolineando la necessità di sviluppare nuove strategie per trattare questa crescente popolazione di pazienti. I biomateriali iniettabili sono attualmente in fase di progettazione per migliorare la plasticità cerebrale e migliorare la riparazione endogena attraverso la somministrazione di agenti attivi o cellule staminali. Un metodo per testare questi approcci è quello di utilizzare un modello di colpo di roditore, iniettare il biomateriale nel nucleo dell'ictus e valutare la riparazione. Conoscere la posizione precisa del nucleo dell'ictus è fondamentale per il trattamento accurato dopo l'ictus, pertanto, un modello di ictus che si traduce in una posizione di ictus prevedibile è preferibile per evitare la necessità di imaging prima dell'iniezione. Il seguente protocollo tratterà come indurre un ictus fototrombotico, come iniettare un idrogel in modo controllato e preciso e come estrarre e criosezionare il cervello mantenendo intatto il biomateriale. Inoltre, evidenzieremo come questi stessi materiali idrogel possono essere utilizzati per la co-consegna di cellule staminali. Questo protocollo può essere generalizzato all'uso di altri biomateriali iniettabili nel nucleo dell'ictus.

Introduzione

L'ictus è la principale causa di disabilità e la quinta causa di morte negli Stati Uniti1. Circa l'87% di tutti gli ictus sono ischemici, mentre la maggior parte del restante 13% sono emorragici2. Un ictus ischemico è definito come il blocco del flusso sanguigno in un'arteria al tessuto circostante. Questa occlusione si traduce in privazione di ossigeno e successiva necrosi che spesso porta a disabilità permanente nei pazienti sopravvissuti. Mentre c'è stata una diminuzione del tasso di mortalitàdell'ictus 3, la sua prevalenza dovrebbe aumentare a 3,4 milioni di persone entro il 20304. Questo aumento dei sopravvissuti disabili e il conseguente onere economico ha portato a una spinta per la ricerca sull'ictus che si concentra sui meccanismi di riparazione neurale. Dopo l'ictus c'è un periodo infiammatorio che porta alla formazione di una cicatrice che impedisce alla regione necrotica di espandersi. La regione che circonda il nucleo necrotico è definita "peri-infarto" e vi è una forte evidenza che la plasticità in questa regione, che include l'aumento dell'angiogenesi, della neurogenesi e della germinazione assonale, è direttamente collegata al recupero osservato nei modelli animali e umani5. Poiché non esistono modelli in vitro in grado di replicare correttamente le complesse interazioni successive all'ictus, i modelli animali sono essenziali per la ricerca sull'ictus.

Esistono diversi modelli in vivo che possono essere utilizzati per produrre ictus ischemico. Uno dei modelli più comuni utilizzati nei topi è l'occlusione dell'arteria cerebrale media, o MCAo, attraverso l'occlusione distale o prossimale (tramite filamento intra-arterioso). Il modello prossimale, noto anche come filamento MCAo (fMCAo), in genere si traduce in grandi ictus ischemici che comprendono ovunque dal 5% al 50% dell'emisfero cerebrale, a seconda del numero di fattori6. In questi modelli, una sutura o un filamento viene avanzato dall'arteria carotide interna alla base dell'arteria cerebrale media (MCA) e mantenuto in posizione per un determinato periodo di tempo. Questo metodo per l'occlusione, che può essere reso temporaneo o permanente, produce un infarto centrato nello striato e può o meno coinvolgere la corteccia sovrastante6. La dimensione del tratto risultante è altamente variabile e sono necessarie tecniche di imaging, come il doppler laser, per confermare l'efficacia della procedura in ciascun topo. L'occlusione del filamento intra-arterioso o intra-luminale che dura più di 30 minuti produce ictus all'estremità più ampia dell'intervallo di dimensioni. Alcuni ricercatori si sono concentrati su tempi di occlusione del filamento più brevi, che richiedono una sostanziale attenzione sperimentale e la convalida del laboratorio7. I modelli di filamento MCAo nei topi seguono fasi simili di morte cellulare, progressione ischemica e formazione di una regione peri-infartuale come osservato nei casi di ictus umano; tuttavia, gli ictus più grandi assomigliano più da vicino allo stato di malattia degli infarti cerebrali maligni, che sono meno comuni, meno curabili ictus umani6. Nel frattempo, l'occlusione MCA distale richiede un intervento chirurgico e una craniectomia più coinvolti. In questo modello, la parte distale dell'MCA che corre lungo la superficie del cervello è direttamente occlusa con una cravatta di sutura o cauterizzazione. In alcune varianti della tecnica, le arterie carotidi sono unilateralmente occluse unilateralmente o transitoriamente-bilateralmente. Un vantaggio dell'MCAo distale è che produce una corsa a base corticale di dimensioni inferiori rispetto al modello di filamento. Tuttavia, il modello distale produce un output comportamentale più povero a causa della traselezione dell'arteria carotide esterna (ECA), che è anche una preoccupazione con fMCAo6.

Un modello di corsa alternativo che è noto per essere meno invasivo è il modello fototrombotico (PT). Il modello PT si traduce in una posizione ben definita di ischemia ed è associato ad un alto tasso di sopravvivenza8. La tecnica si basa su un colorante fotosensibile iniettato per via intraperitoneale che consente la foto-ossidazione intravascolare semplicemente irradiando il tessuto desiderato con una luce o un laser9. Dopo l'eccitazione, si formano radicali di ossigeno che causano danni endoteliali, che attivano l'aggregazione piastrinica e la formazione di coaguli nell'area irradiata8,9. Lo stretto controllo sulla dimensione e la posizione della corsa, nonché l'elevata riproducibilità del modello PT, lo rendono ideale per lo studio dei biomateriali. Mentre la precisione è resa possibile utilizzando un laser e coordinate stereotassiche, ci sono alcuni svantaggi che possono rendere questo modello meno ideale per pochi studi. A differenza del modello fMCAo, il modello di corsa PT non può essere riperfuso. Pertanto, i materiali per studiare gli agenti neuroprotettivi specifici per i danni a seguito di riperfusione o i meccanismi successivi alla riperfusione non sarebbero utili qui8. Inoltre, a causa dell'insulto microvascolare del modello PT, si vede una penombra ischemica relativamente piccola. Invece, si verifica edema vasogenico locale, che è insolito per l'ictus umano, rendendo questo modello indesiderabile per gli studi farmacologici preclinici focalizzati sull'area peri-infartuale6,8.

L'obiettivo generale delle strategie dei biomateriali nell'ictus è quello di fornire agenti bioattivi o di agire come una matrice extracellulare surrogata per la crescita del tessuto cerebrale. Una strategia che esploreremo utilizzando i nostri metodi è quella di fornire idrogel direttamente nel nucleo dell'ictus, al contrario del tessuto peri-infartuale in cui vengono somministrate molte terapie cellulari attuali10. Il razionale di questo approccio è che la consegna nel tessuto necrotico trovato nel nucleo eviterà di interrompere il tessuto sano circostante o di recuperare. Supponiamo che la diffusione di qualsiasi agente attivo incluso nel biomateriale sarà in grado di raggiungere il peri-infarto dal nucleo, soprattutto perché troviamo che la consegna di biomateriali idrogel riduce lo spessore della cicatrice gliale11. Questo è importante poiché la regione del peri-infarto ha dimostrato di mostrare neuroplasticità dopo l'ictus, rendendola un bersaglio attraente. Inoltre, la consegna di una matrice surrogata al nucleo dell'ictus può essere caricata con12 angiogenici o13 fattori neurogeni per guidare la formazione di nuovo tessuto, così come le cellule per la consegna14. La consegna cellulare è notevolmente migliorata utilizzando una matrice perché protegge le cellule dalle dure forze di iniezione e dall'ambiente locale presente durante il parto, oltre a incoraggiare la differenziazione e l'attecchimento15.

Questi biomateriali terapeutici iniettabili hanno rilevanza clinica nelle applicazioni dell'ictus, in quanto attualmente non esistono terapie mediche che stimolino il recupero neuronale dopo l'ictus. I circuiti neurali sottostanti coinvolti nel recupero si trovano nel tessuto cerebrale adiacente al nucleodell'ictus 16, mentre il nucleo dell'ictus stesso è privo di tessuto neurale vitale. Prevediamo che la consegna di un biomateriale nel nucleo dell'ictus necrotico ha il potenziale per stimolare il tessuto adiacente verso processi rigenerativi attraverso una serie di meccanismi precedentemente menzionati, tra cui il rilascio di depositi di fattori dicrescita 13,la stimolazione della crescita del tessuto e la promozione del recuperodellosviluppo del tessuto cerebrale11, 12,l'alterazione delle risposte immunitarie17e la consegna di terapie derivate da cellule staminali14, 18. Tuttavia, per studiare efficacemente la possibilità di queste applicazioni, è necessario un metodo coerente e riproducibile per indurre l'ictus e iniettare biomateriali. Il modello di corsa PT utilizza tecniche che offrono un controllo preciso sull'orientamento e sulla posizione del tratto. Un laser collegato al dispositivo stereotassico guida gli orientamenti e le pompe collegate ai dispositivi stereotassica controllano la velocità di iniezione del materiale senza la necessità di ulteriori forme di imaging. Pertanto, abbiamo scelto di descrivere i metodi per eseguire un colpo PT nelle cortecce motorie dei topi e per iniettare biomateriali nel nucleo dell'ictus. Qui, utilizziamo idrogel di particelle ricotte microporose (MAP) come biomateriale per iniezione senza cellule aggiunte o fattori di crescita. Inoltre, spieghiamo come recuperare con successo il cervello con biomateriale intatto e discutiamo i saggi di immunochimica utilizzati per analizzare l'esito dell'ictus con e senza iniezione di biomateriali.

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Protocollo

Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con IUCAC presso la Duke University e l'Università della California di Los Angeles. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6J di età compresa tra 8 e 12 settimane. Gli animali sono stati alloggiati a temperatura controllata (22 ± 2 °C), con un ciclo luce-buio di 12 ore e accesso a cibo e acqua pellettati ad libitum. I protocolli di analgesia e sedazione sono descritti come approvati dall'IUCAC, ma potrebbero differire dai protocolli utilizzati in altri laboratori.

Gli animali possono essere sottoposti a eutanasia prematura se sperimentano eccessiva irrequietezza, vocalizzazione (che indica dolore incontrollabile), autotrauma, diminuzione o compromissione della mobilità, segni fisici di infezione dermica, perdita di appetito e / o perdita di peso superiore al 10% -15% come risultato dell'intervento chirurgico di sopravvivenza. Non ci sono effetti avversi previsti dall'iniezione del gel, in quanto è composto da un polimero naturale all'interno del cervello. Gli animali dovrebbero essere monitorati quotidianamente, compresi i fine settimana e le festività, e ripesati a giorni alterni. Studi del nostro laboratorio e di altri non hanno trovato deficit nella toelettatura, perdita di peso corporeo o segni / sintomi di astinenza o stress cronico nei topi dopo questi piccoli ictus corticali o sottocorticali. Se gli animali mostrano segni di infezione locale della ferita alla testa, dovrebbero essere sottoposti a eutanasia. Gli animali dovrebbero anche essere monitorati per la scarsa toelettatura, le condizioni delle ferite e le prove di combattimento tra animali (ferite alla schiena). Se ci sono prove di combattimento o deiscenza della ferita, gli animali devono prima essere trattati dopo aver contattato i veterinari. Questo spesso comporta antibiotico nell'acqua e / o applicazione topica locale di antibiotici. Se queste misure non riescono a produrre guarigione, gli animali dovrebbero essere eutanasizzati.

1. Preparazione di materiali e strumenti

  1. Preparare il colorante fototrombotico prima dell'intervento chirurgico. Pesare 15 mg di Rose Bengal in un tubo microcentrifuga da 2 ml.
    ATTENZIONE: Rose Bengal può causare gravi danni agli occhi / irritazione.
    1. Sciogliere il Rose Bengal in 1,5 mL di PBS filtrato sterile per ottenere una concentrazione di lavoro di 10 mg/mL.
    2. Ruotare il tubo fino a quando non sono visibili grumi, indicando che il colorante si è completamente dissolto, quindi coprire in un foglio fino a un ulteriore utilizzo.
      NOTA: la quantità di colorante richiesta dipenderà dal numero di topi. Il colorante viene iniettato per via intraperitoneale IP ad una concentrazione di 10 μL/g, ad esempio 200 μL per un topo da 20 g.
  2. Accendere la piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea del mouse durante l'anestesia (37 °C).
  3. Preparare forbici autoclavate, pinze, cotone, unguento per gli occhi veterinari, colla chirurgica o materiale di sutura, un marcatore chirurgico blu o nero e salviette sterili di alcool e beta iodio. Preparare il trapano osseo con teste di punta sterilizzate.
  4. Attivare la sterilizzazione del tallone a 160 °C per consentire la sterilizzazione degli strumenti tra la chirurgia dei topi. Mettere da parte un tubo conico da 50 ml di soluzione salina sterile o 1x PBS per l'uso successivo nel mantenimento di un'area operativa idratata.
  5. Collegare il laser al dispositivo stereotassico. Indossando occhiali di sicurezza laser, misurare la potenza del laser (mW).
    ATTENZIONE: utilizzare occhiali di sicurezza laser ogni volta che il laser viene acceso nella procedura.
    1. Regolare la corrente sulla console laser, seguendo le istruzioni di produzione del laser, fino a quando la potenza di uscita del laser non legge 10 mW e impostare la corrente come preimpostata sulla console della schermata iniziale. Quindi regolare nuovamente la corrente per stabilire un altro preimpostato in cui la potenza di uscita del laser legge 40 mW. Ora spegni il laser fino a un ulteriore utilizzo.
      NOTA: i 10 mW verranno utilizzati per orientare il laser prima dell'uso.
  6. Preparare una gabbia pulita per i topi dopo l'intervento chirurgico. Quindi, posizionare il topo nella camera di induzione con una concentrazione di isoflurano del 4% per anestetizzarlo fino a quando il movimento spontaneo si ferma e la sua respirazione raggiunge una velocità lenta e costante.
  7. Una volta addormentato, pesare il topo per determinare la quantità di colorante Rose Bengal da iniettare. Quindi, trasferire e fissare il mouse al dispositivo stereotassico con una concentrazione di isoflurano di mantenimento dell'1,5%.
    NOTA: l'aumento delle concentrazioni di isoflurano può dilatare i vasi e prevenire un'occlusione sufficiente o colpi di dimensioni costanti tra topi.
  8. Applicare l'unguento per gli occhi veterinari su entrambi gli occhi.
    NOTA: Osservare la respirazione e la temperatura durante la procedura e pizzicare le dita dei piedi di tanto in tanto per assicurarsi che il mouse non possa sentire nulla.

2. Modello di corsa fototrombotica9

  1. Rasare la pelliccia dalla testa del topo e preparare asetticamente l'area usando una salvietta alcolica seguita da una salvietta di iodio beta. Ripeti tre volte.
    NOTA: Se necessario, utilizzare una salvietta alcolica extra alla fine per pulire tutto lo iodio beta in quanto provoca irritazione della pelle che porta i topi a prudere il cranio dopo l'intervento chirurgico.
  2. Usando piccole forbici operative, fare un'incisione laterale tra le orecchie agli occhi, circa 1-2 cm. Fallo tirando la pelle verso l'alto con una pinza per creare una tenda, tagliando una volta verso il basso, quindi inserendo le forbici nell'apertura e creando un'incisione continua della linea mediana.
  3. Separare la pelle e premere leggermente sulle ossa parietali con la pinza per localizzare il bregma. Contrassegnare il bregma con un punto utilizzando il marcatore chirurgico.
    NOTA: il movimento del frammento osseo evidenzia il bordo frontale delle ossa parietali. Il bregma è il punto centrale in cui i frammenti ossei frontali e parietali si incontrano (Figura 1A).
  4. Indossando occhiali di sicurezza laser, spostare il laser sul cranio del mouse, fissando il dispositivo stereotassico con un angolo di 90 °. Selezionare il preimpostato da 10 mW e accendere il laser.
    1. Regolare l'asse x e y del laser fino a quando non si trova direttamente sopra il bregma. Reimpostare la x e la y sulla console di visualizzazione digitale, quindi spostare il laser di 1,8 mm a sinistra del bregma. Ora porta il laser il più vicino possibile al cranio senza lasciarlo toccare il cranio.
    2. Spostare il laser a 2,2 mm a sinistra del bregma per assicurarsi che possa muoversi senza ostacoli. Spegnere il laser.
  5. Iniettare la quantità appropriata di colorante Rose Bengal per via intraperitoneale (IP) utilizzando un ago monouso da 29 G. Avviare immediatamente un timer per 7 minuti per consentire al colorante di circolare sistemicamente. Selezionare il preimpostato per 40 mW senza accendere il laser.
    NOTA: Una volta a suo agio con la procedura, il colorante può essere iniettato prima della preparazione asettica del mouse e finito prima che i 7 minuti siano finiti per risparmiare tempo.
  6. Accendere il laser (40 mW) quando il timer da 7 minuti si spegne, indossando occhiali di sicurezza laser, e impostare un timer di 10 minuti.
    1. Dopo 10 minuti, spostare il laser a 2,2 mm a sinistra del bregma senza spegnerlo e impostare un altro timer di 10 minuti.
    2. Una volta spento il secondo timer da 10 minuti, riportare il laser a 10 mW e spostare il laser a 2,0 mm a sinistra del bregma. Segna questo punto con il marcatore chirurgico. Quindi spegnere il laser.
    3. Sollevare il laser e sbloccarlo dall'angolo di 90° in modo che possa essere spostato lontano dal mouse. A questo punto, applicare la soluzione salina sterile o PBS con cotone se l'area chirurgica è asciutta.
  7. Forare in piccole raffiche al segno di 2,0 mm perpendicolare alla superficie del cranio.
    NOTA: Fare attenzione a forare lentamente per evitare di perforare troppo in profondità e colpire il cervello. Ci sarà un leggero calo / cambiamento nella resistenza una volta che il trapano ha attraversato il cranio e la perforazione può causare sanguinamento.
    1. Utilizzare il cotone per assorbire il sangue in eccesso. È tipico vedere un po 'di sangue dalle arterie graffiate nel cranio dopo la perforazione - sangue eccessivo significa che la punta del trapano ha colpito il cervello. In questo caso, registrare l'identificatore del mouse e andare avanti.
  8. Posiziona una piccola salvietta accanto al mouse. Usando la pinza, tirare la pelle ravvicinata per prepararsi all'incollaggio.
    NOTA: la sutura può essere eseguita qui invece. La sutura richiede in genere solo 3 punti di sutura.
    1. Usando la pinza, afferrare i due lati della pelle e tirarli insieme e verso l'alto. Tamponare eventuali grandi gocce di colla chirurgica all'estremità della punta sulla salvietta prima di applicare al mouse.
    2. Applicare la colla chirurgica con parsimonia e tenere la pelle insieme con una pinza per 10 s. Continuare fino a quando non ci sono aperture visibili.
      NOTA: La colla esce rapidamente - non spremere la bottiglia. Evitare di incollare la pelle al cranio o ottenere colla negli occhi.
  9. Dopo l'incollaggio o la sutura, posizionare il mouse nella nuova gabbia per riprendersi dall'anestesia. Ci vogliono 5-10 minuti perché l'animale si riprenda e aiuta a riposare metà della gabbia su una piastra riscaldante.

3. Operazione di corsa fittizia

  1. Eseguire tutte le procedure in modo identico all'operazione descritta sopra nel paragrafo 2, ad eccezione dell'iniezione di 1x PBS o soluzione salina al posto del colorante Rose Bengal.

4. Iniezione di idrogel o altri biomateriali

  1. Eseguire l'iniezione di biomateriali in un momento definito dall'utente. In questo esperimento sono state eseguite iniezioni tra 5 e 7 giorni dopo l'ictus. Vengono iniettati 2 - 6 μL di idrogel (definiti dall'utente).
    1. Accendere la piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea del mouse durante l'anestesia (37 °C).
    2. Preparare forbici autoclavate, pinze, cotone, unguento per occhi veterinari, colla chirurgica o materiale di sutura e salviette sterili di alcool e beta iodio. Preparare il trapano osseo con teste di punta sterili e le siringhe Hamilton in vetro da 25 μL con aghi metallici da 30 G.
    3. Accendere la sterilizzazione del tallone a 160 °C per consentire la sterilizzazione degli strumenti tra topi.
    4. Collegare le pompe di iniezione al dispositivo stereotassico. Impostare la portata a 1 μL/min e impostare il volume su 4 μL.
    5. Preparare una gabbia pulita per i topi dopo l'intervento chirurgico.
  2. Posizionare il topo nella camera di induzione con una concentrazione di isoflurano del 4% per anestetizzarlo fino a quando il movimento spontaneo si ferma e la sua respirazione raggiunge una velocità lenta e costante.
    1. Una volta addormentati, trasferire e fissare il mouse al dispositivo stereotassico con una concentrazione di isoflurano di mantenimento dell'1,5%.
    2. Applicare l'unguento per gli occhi veterinari su entrambi gli occhi.
    3. Radere qualsiasi pelliccia che potrebbe essere ricresciuta della testa del topo e preparare asetticamente l'area usando una salvietta alcolica seguita da una salvietta di iodio beta. Ripeti tre volte.
      NOTA: Se necessario, utilizzare una salvietta alcolica extra alla fine per pulire tutto lo iodio beta in quanto provoca irritazione della pelle e porta i topi a prudere il cranio dopo l'intervento chirurgico.
  3. Usando le piccole forbici e / o pinze, riaprire la pelle sopra il cervello. Utilizzare cotone con soluzione salina sterile o PBS per pulire eventuali detriti dal cranio. Saranno visibili un cerchio bianco-giallo (il tratto, Figura 1B)e il foro della bava del trapano. Se il tessuto morto non è visibile, probabilmente non si è verificato alcun ictus. Se il foro della bava non è centrato sopra la corsa, trivellare nuovamente per centrarlo.
  4. Orientare la pompa di iniezione sul mouse e bloccarla a 90°. Pulire la siringa con soluzione salina sterile o PBS prima di scaricare il materiale.
    1. Una volta pulito, smontare la siringa di vetro in modo che non ci sia ago. Scaricare la siringa utilizzando una pipetta a spostamento positivo da 25 μL con i 10 μL di idrogel (o altro biomateriale qui con o senza cellule).
    2. Utilizzando lo stantuffo della siringa, spingere il gel fino alla parte anteriore della siringa. Quindi, rimontare la siringa e continuare a spingere fino a quando il gel trasuda visibilmente dall'ago.
  5. Posizionare la siringa sulla pompa. Potrebbe essere necessario regolare la parte posteriore della pompa in modo che la siringa si adatti. A tale scopo, regolare la portata a 30 μL/min, selezionare Prelievo o Iniezione a seconda della direzione in cui deve muoversi, quindi premere Avvia. Premi Stop quando la parte posteriore della pompa si trova nella posizione corretta.
    1. Avvitare la parte posteriore della pompa in modo che la siringa sia sicura. Se le regolazioni sono state effettuate in precedenza, assicurarsi che la portata sia riportata a 1 μL/min e impostata per l'iniezione.
  6. Spostare la pompa nella direzione x e y per orientarla sul foro. Spostare la pompa verso il basso nella direzione z fino a quando l'ago della siringa tocca la parte superiore del foro.
  7. Reimpostare la z sulla console di visualizzazione digitale. Quindi, spostare la siringa verso il basso nella direzione z di 0,750 mm. Se la siringa si piega o c'è resistenza, il cranio è guarito o non è stato completamente perforato e deve essere nuovamente perforato.
  8. Premere Start sulla console della pompa per iniettare 4 - 6 μL dell'idrogel ad una velocità di 1 μL/min.
  9. Impostare un timer di 5 minuti quando la pompa smette di iniettare per consentire al gel di iniziare la reticolazione.
  10. Dopo 5 minuti, tirare lentamente su la siringa ruotando lo z nob. Guarda per vedere se qualche materiale viene accidentalmente tirato o fuoriesce dal foro. Sblocca la pompa e allontanala dal mouse quando l'ago è abbastanza lontano dal cranio.
  11. Usando pinze, colla chirurgica o suture, chiudere la pelle sopra la testa. Metti il mouse nella gabbia pulita e osserva il suo recupero. Dovrebbero essere necessari circa 5 – 10 minuti affinché il mouse si riprenda dall'anestesia.

5. Perfusione e raccolta dei campioni

  1. Anestetizzare il mouse usando isoflurano.
  2. Fissare l'animale in posizione supina e aprire la cavità addominale con un taglio mediano. Opzionalmente, bloccare l'aorta addominale discendente per utilizzare meno fissativo e PBS.
  3. Tagliare aprire il diaframma e spostarsi verso l'alto sui lati della gabbia toracica per aprire la cavità toracica. Inserire una cannula di perfusione nel ventricolo sinistro e tagliare un'apertura nell'atrio destro. Iniziare a perfondere lentamente con 10-20 ml di PBS o fino a quando il liquido non diventa semi-chiaro.
  4. Una volta chiaro, passare al 4% di PFA per altri 10 – 20 ml. Lo sblocco delle braccia consente loro di contrarsi mentre il PFA si infonde. Una volta che smettono di muoversi, aspetta altri 30 s.
  5. Decapitare l'animale e tirare indietro la pelle per esporre il cranio. Usando una pinza smussata e sottile, rimuovere con cura i pezzi del cranio per esporre il cervello. È necessario prestare particolare attenzione quando si rimuove il cranio sopra il sito dell'ictus. Piccole forbici chirurgiche possono essere utilizzate qui per aiutare a tagliare via il cranio. La sfida più grande è che il gel si attacca al cranio e esce dal cervello mentre il cranio viene rimosso.
  6. Una volta che il cervello è distaccato, posizionare in 10 – 15 ml di PFA al 4% durante la notte (non più di 24 ore).
  7. Spostare il cervello dal PFA al 30% di saccarosio il giorno seguente. Il cervello è pronto per la criosezione una volta che affonda sul fondo (circa 2 – 3 giorni). Può anche essere lasciato per la conservazione a questo punto.

6. Criosezione e colorazione

  1. Togliere il cervello dal saccarosio e metterlo su un vetrino. Tagliare una piccola porzione della parte posteriore del cervello con una lama di rasoio per creare una porzione piatta da montare su un mandrino.
    1. Posizionare una cucchiaiata di Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) sul mandrino, quindi posizionare il cervello, con il lato piatto verso il basso, sul mandrino nell'OCT. Posizionare questo campione su ghiaccio secco fino a quando non è congelato o nel criostato sul blocco di congelamento.
      NOTA: OCT può essere aggiunto per comprendere completamente il cervello per aiutare a prevenire la separazione del materiale dal cervello durante il sezionamento.
  2. Tagliare il cervello in serie su un criostato a -20 °C a sezioni spesse 30 μm su 10 vetrini rivestiti di gelatina. Fare attenzione durante il sezionamento assicurandosi di non perdere l'idrogel. Se questa parte è difficile, posiziona un po 'di OCT sulla parte superiore del cervello sopra il gel (Figura 3). Conservare a -80 °C fino a nuovo utilizzo.
  3. Togliere i vetrini dai -80 °C e metterli su un vassoio di colorazione per lasciarli asciugare. Anche le diapositive che non sono state congelate ma solo sezionate possono essere macchiate immediatamente.
  4. Usando una penna idrofoba, disegna un cerchio attorno alle fette di cervello sul vetrino. Una volta asciutte, reidratare le fette di cervello con 1x PBS filtrato e metterle su uno shaker a temperatura ambiente per 15 minuti. Questo richiede circa 1 mL di buffer per diapositiva con 9 – 12 sezioni cerebrali.
  5. Lavare le diapositive con 1x PBS filtrato per 5 minuti a temperatura ambiente, ripetere tre volte.
  6. Blocca le diapositive da 30 minuti a un'ora con il 10% di siero d'asino nello 0,01% PBS-Triton X a temperatura ambiente sulla danzatrice del ventre. Questo richiede circa 200 μL per diapositiva.
  7. Incubare l'anticorpo primario in siero d'asino al 10% con lo 0,01% di PBS-Triton X durante la notte a 4°C su uno shaker. Testare prima gli anticorpi primari per determinare le concentrazioni corrette. Qui sono stati utilizzati GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500)(Figura 4).
  8. Lavare i vetrini con 1x PBS filtrato il giorno seguente per 5 minuti a temperatura ambiente, ripetere tre volte.
  9. Incubare con anticorpo secondario in siero d'asino al 10% in PBS-Triton X allo 0,01% e DAPI per 2 ore sullo shaker di laboratorio a temperatura ambiente. 1:1.000 è stato utilizzato per tutti i secondari e DAPI.
  10. Lavare le diapositive per 5 minuti con 1x PBS filtrato.
  11. Lasciare asciugare le sezioni a temperatura ambiente al buio. Questo può richiedere da 20 minuti a 4 ore; posizionare le diapositive in un essiccatore può accelerare il processo.
  12. Disidratare i vetrini in concentrazioni crescenti di alcol (1 minuto per soluzione) del 50%, 70%, 95%, 100% e 100%.
  13. Disgrassare nel primo bagno di xilene per 1 min, poi secondo bagno di xilene per 5 min.
  14. Estrai rapidamente le diapositive una per una e aggiungi il mezzo di montaggio mentre le sezioni del cervello sono bagnate di xilene. Aggiungi rapidamente una copertura di vetro sulla parte superiore. Utilizzare un coperchio di lunghezza e spessore corretti necessari rispettivamente per il vetrino e il microscopio utilizzati per l'imaging.
  15. Sbarazzati di eventuali bolle sotto il coperchio premendo delicatamente con una punta della pipetta in un movimento verso l'esterno dal centro della diapositiva. Lasciare asciugare DPX per 4 ore a notte al buio a temperatura ambiente.
  16. Utilizzare una lama di rasoio per raschiare via qualsiasi mezzo di montaggio essiccato che si è rovesciato sulle diapositive. Pulire le diapositive con un detergente per lenti. Le diapositive possono ora essere visualizzate con la microscopia a fluorescenza.
    NOTA: è meglio conservare la diapositiva al buio o a 4 °C fino al termine dell'imaging.

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Risultati

Lo scopo di questo metodo era dimostrare come iniettare biomateriali nel cervello dopo l'ictus. Un modello fototrombotico con rose bengal e un laser a 520 nm è stato utilizzato per l'orientamento controllato della lesione del tratto sia in termini di dimensioni che di posizione. Cinque giorni dopo l'ictus l'infarto poteva essere visualizzato durante l'intervento chirurgico (Figura 1B) e mediante TTC e imaging di vetrini macchiati IHC (Figura 2). Un aumento del d...

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Discussione

Qui dimostriamo un modello di ictus permanente facilmente riproducibile, minimamente invasivo e descriviamo come iniettare un biomateriale nell'infarto cinque giorni dopo l'ictus. L'uso del colorante fototrombotico Rose Bengal e di un laser collimato a 520 nm collegato al dispositivo stereotassico ci dà la possibilità di posizionare il tratto sulla corteccia motoria del mouse con maggiore precisione. Cinque giorni dopo l'ictus, la posizione dell'infarto è visibile a occhio al centro dell'irradiazione, 2,0 mm medio-latera...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che TS è uno dei fondatori di Tempo Therapeutics, che cerca di commercializzare idrogel MAP.

Ringraziamenti

Ci piace riconoscere il National Institutes of Health e il National Institute of Neurological Disorders and Stroke per il finanziamento (R01NS079691).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10% Siero di capra normaleVWR100504-028Per tampone bloccante
Pre pad alcolico a 2 strati, sterile, medioMedlineMDS090735
25uL Hamilton Siringa 702RN, senza agoFishcer Scientific14824663Siringhe utilizzate per iniettare biomateriali
25uL Pipetta a spostamento positivoGilsonM-25
2x Beam Expander, 400-650nmThorlabsGBE02-AEspansore di raggio laser
Piattaforma di palco regolabileKopf Instruments901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 anticorpo, coniglioAbcamab113435
Anticorpo Anti-Iba1, capraabcamab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Set di raccolta del sangue. 25G, 12"Medsupply367294per perfusioni
BKF12- Foglio di alluminio nero opacoThorlabsBKF12Per coprire tutto ciò che è riflettente quando si utilizza il laser.
Mini forbici per ossa Iris - Strumenti chirurgici Sklar da 3-1/2"64-2035
C57BL/6 TopiJackson Laboratory0006648-12 settimane di età
Assemblaggio della gabbia RobThorlabsER3-P43" Lungo, diametro 6 mm, confezione da 4 - per il fissaggio del laser alle
frese in acciaio al carbonio sterotax -0,5 mm di diametroStrumenti di scienza fine19007-05Per la creazione di fori per bave
Cromo (III) solfato di potassio dodecaidratoVWREM1.01036.0250
Controller compatto per laser a coda di maialeThorlabsCLD1010LP
Cotton SwabsVWR89031-288
CP 25 puntali per pipetteGilsonF148012
Donkey anti-goat IgG H& L (488)abcamab150129
Asino Anti-coniglio IgG H& L (647)abcamab150075
Asino Anti-ratto IgG H& L (555)abcamab150154
EMS DPX MountantElecron Microscopy Sciences13512Soluzione di montaggio per vetrini
EMS Gelatina in polvere Tipo A 300 BloomScienze di microscopia elettronica16564Per vetrini di rivestimento in gelatina
EMS Paraformaldeide, granulareVWR100504-162Per la realizzazione di 45 PFA
ESD Worstation kitElmstatWSKK5324SBNecessità per l'installazione del laser Piastra da
parete per banco in fibra, non filettataThorlabsHCA3Necessità di collegare il laser all'albero Kopf
FiberPortThorlabsPAF-X-5-AFC/APC& APC, f = 4,6 mm, 350-700 nm, diametro 0,75 mm
Forbici fini - dritte / affilate-smussate / 10 cmFine Science Tools14028-10
Anticorpo GFAP, rattoThermo Fisher Scientific13-0300
Piastra riscaldanteKopf InstrumentsHP-4M
ImmEdge Penna barriera idrofobicaVector LaboratoriesH-4000Per colorare i
vetriniCentro di anestesia multipaziente integrato IMPAC 6VetEquip901808
Iodio, Pad per la preparazione dello iodioMedx SuppleMED MDS093917H
Jewlers Pincipe #5GFS, prodotti chimici GFS46085
Occhiali di sicurezza laserThorlabsLG10B, 35% di luce visibile (disponibili anche le versioni di google)
M27-1084 Potente LED a doppio collo d'ocaUnited ScopeLED-11C
Medical USP Grade Oxygen AirgasOX USP250
Miltex Adson Dressing Pinze,Intefra MiltexV96-118
Mini Cord / Cordless Small Animal TrimmerHarvard aparatus72-6110
Mini-pompa a flusso variabileThomas Scientific70730-064Pompa per perfusioni
Mouse Brain Matrici, fette coronali, 1mmKent ScientificRBMA-200cPer fette TTC
Mouse Gas Anethesia Head HolderKopf Instruments923-B
Nanojet Control BoxChemyx10050
Nanojet pump headerChemxy10051Collegare al dispositivo stereotassico per l'iniezione di biomateriale
Ago RN 30G PT STY 3, 0,5 polliciFishcer Scientific
Auricolari antirottura 60ºKopf Instruments922
PBS tampone pH 7.4VWR97062 338
Laser a spirale 520 nm, 100mW, 5G PinThorlabsLP520-MF100
Vetrini a carica positivaHaretaAHS90-WH
Misuratore di energiaThorlabsPM100DUtilizzato per misurare l'uscita laser in mW
Unguento veterinario PuralubeDr. Foster Smith9N-76855
Sonda rettale Mousekopf InstrumentsRet-3-ISO
Rose Bengal Dye 95%Sigma-Aldrich330000-5G
Albero modificato 8-32 foro filettato 1/2" di profonditàKopf Instruments1770-02Per il collegamento del laser al dispositivo sterotassico
Sensore di potenza a fotodiodo sottileThorlabsS130VCUtilizzato con energia elettrica metro
SM1-Threaed 30 mm Piastra a gabbia 0,35" di spessore 2 RitenzioneThorlabsCP02Per il collegamento dell'espansore laser
Sol-M U-100 Siringa per insulina con marcature da 1/2 unità 0,5 mLVWR10002-726Per iniettare il rosa bengala
StainTray Sistema di colorazione per vetriniSimport ScientificM920-2Per la colorazione di vetrini
Dispositivo sterotassicoKopf Instruments940Strumento stereotassico
piccoli animali Studente Adson Pinze -1x2 dentiStrumenti per le scienze fini91127-12
Pinze per studenti - gambi dritti/larghi Strumenti perscienze fini91113-10
Regolatore di temperaturaKopf InstrumentsTCAT-2LV
Composto OCT Tissue-TekVWR25608-930
Triton X-100VWR97063-864
Morsetto staffa superioreKopf Instruments1770-cPer il collegamento del laser al dispositivo sterotassico
Vetbond Tissue Adhessive 3mLSanta Cruz Biotechnologysc-361931
Vogue Professional My ManicureBargin Source6400Per sbavature
VWR Sterilizzatori di perlineVWR VWR75999-328
Tissue Tek OCT compostoSakura4583Per l'inclusione di tessuti
, , , , lenti ambrate NC9459562 elettrica per le

Riferimenti

  1. National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229(2017).
  3. Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69(2017).
  4. Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
  5. Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
  6. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
  7. Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
  8. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  9. Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794(2015).
  10. Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14(2018).
  11. Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
  12. Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
  13. Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
  14. Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
  15. Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
  16. Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
  17. Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
  18. Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
  19. Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
  20. Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
  21. Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
  22. Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
  23. Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943(2017).
  24. Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
  25. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
  26. Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
  27. Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
  28. Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
  29. Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
  30. Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
  31. Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).

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