Summary
Este artículo proporciona una metodología detallada para los enfoques de disociación tisular y fraccionamiento celular que permiten el enriquecimiento de células epiteliales viables de las regiones proximal y distal del pulmón humano. En este caso, estos enfoques se aplican para el análisis funcional de células progenitoras epiteliales pulmonares mediante el uso de modelos de cultivo de organoides 3D.
Abstract
Los modelos organoides epiteliales sirven como herramientas valiosas para estudiar la biología básica de un sistema de órganos y para el modelado de enfermedades. Cuando se cultivan como organoides, las células progenitoras epiteliales pueden autorrenovarse y generar una progenie diferenciadora que exhibe funciones celulares similares a las de sus contrapartes in vivo . A continuación describimos un protocolo paso a paso para aislar progenitores específicos de la región del pulmón humano y generar cultivos organoides 3D como herramienta experimental y de validación. Definimos las regiones proximales y distales del pulmón con el objetivo de aislar las células progenitoras específicas de la región. Utilizamos una combinación de disociación enzimática y mecánica para aislar las células totales del pulmón y la tráquea. Las células progenitoras específicas se fraccionaron de las células de origen proximal o distal utilizando la clasificación celular asociada a la fluorescencia (FACS) basada en marcadores de superficie específicos del tipo celular, como NGFR para clasificar las células basales y HTII-280 para clasificar las células alveolares tipo II. Se utilizaron progenitores basales o alveolares aislados de tipo II para generar cultivos organoides 3D. Tanto los progenitores distales como los proximales formaron organoides con una eficiencia de formación de colonias del 9-13% en la región distal y del 7-10% en la región proximal cuando se chapan 5000 células / pozo en el día 30. Los organoides distales mantuvieron las células alveolares tipo II HTII-280+ en cultivo, mientras que los organoides proximales se diferenciaron en células ciliadas y secretoras para el día 30. Estos cultivos organoides 3D se pueden utilizar como una herramienta experimental para estudiar la biología celular del epitelio pulmonar y las interacciones mesenquimales epiteliales, así como para el desarrollo y validación de estrategias terapéuticas dirigidas a la disfunción epitelial en una enfermedad.
Introduction
Los espacios aéreos del sistema respiratorio humano se pueden dividir ampliamente en zonas conductoras y respiratorias que median el transporte de gases y su posterior intercambio a través de la barrera epitelial-microvascular, respectivamente. Las vías respiratorias conductoras incluyen tráquea, bronquios, bronquiolos y bronquiolos terminales, mientras que los espacios de aire respiratorio incluyen bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y alvéolos. El revestimiento epitelial de estos espacios aéreos cambia de composición a lo largo del eje proximo-distal para adaptarse a los requisitos únicos de cada zona funcionalmente distinta. El epitelio pseudoestratificado de las vías respiratorias traqueobronquiales está compuesto por tres tipos principales de células, basales, secretoras y ciliadas, además de los tipos celulares menos abundantes, incluidos el cepillo, el neuroendocrino y el ionocito 1,2,3. Las vías respiratorias bronquiolares albergan tipos de células epiteliales morfológicamente similares, aunque hay distinciones en su abundancia y propiedades funcionales. Por ejemplo, las células basales son menos abundantes dentro de las vías respiratorias bronquiolares, y las células secretoras incluyen una mayor proporción de células club frente a las células serosas y caliciformes que predominan en las vías respiratorias traqueobronquiales. Las células epiteliales de la zona respiratoria incluyen un tipo de célula cuboidal mal definida en los bronquiolos respiratorios, además de las células alveolares tipo I (ATI) y tipo II (ATII) de los conductos alveolares y alvéolos 1,4.
La identidad de los tipos de células madre epiteliales y progenitoras que contribuyen al mantenimiento y renovación de los epitelios en cada zona se describe de forma incompleta y se infiere en gran medida de los estudios en modelos animales 5,6,7,8. Los estudios en ratones han demostrado que las células basales de las vías respiratorias pseudoestratificadas, o las células club de las vías respiratorias bronquiolares o las células ATII del epitelio alveolar, sirven como células madre epiteliales basadas en la capacidad de autorrenovación ilimitada y diferenciación multipotente 7,9,10,11,12 . A pesar de la incapacidad de realizar estudios de rastreo de linaje genético para evaluar el tallo de los tipos de células epiteliales pulmonares humanas, la disponibilidad de modelos de cultivo basados en organoides para evaluar el potencial funcional de las células madre y progenitoras epiteliales proporciona una herramienta para estudios comparativos entre ratones y humanos 13,14,15,16,17.
Describimos métodos para el aislamiento de tipos de células epiteliales de diferentes regiones del pulmón humano y su cultivo utilizando un sistema organoide 3D para recapitular los tipos de células regionales. Se han desarrollado métodos similares para el análisis funcional y el modelado de enfermedades de células epiteliales de otros sistemas de órganos 18,19,20,21. Estos métodos proporcionan una plataforma para la identificación de células progenitoras epiteliales regionales, para realizar estudios mecanicistas que investiguen su regulación y microambiente, y para permitir el modelado de enfermedades y el descubrimiento de fármacos. Aunque los estudios de células progenitoras epiteliales pulmonares realizados en modelos animales pueden beneficiarse del análisis, ya sea in vivo o in vitro, los conocimientos sobre la identidad de las células progenitoras epiteliales pulmonares humanas han dependido en gran medida de la extrapolación de organismos modelo. Como tal, estos métodos proporcionan un puente para relacionar la identidad y el comportamiento de los tipos de células epiteliales pulmonares humanas con sus estudios que investigan la regulación de las células madre / progenitoras.
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Protocol
El tejido pulmonar humano se obtuvo de donantes de tejido fallecidos de conformidad con los procedimientos de consentimiento desarrollados por el Instituto Internacional para el Avance de la Medicina (IIAM) y aprobados por la Junta de Revisión Interna del Centro Médico Cedars-Sinai.
1. Procesamiento de tejidos para el aislamiento de células pulmonares de regiones traqueobronquiales o pequeñas de las vías respiratorias/parénquimas (vías respiratorias pequeñas y alvéolos)
- Preparar y autoclave todos los instrumentos de disección, cristalería y las soluciones adecuadas un día antes del aislamiento celular.
- Al recibir tejido pulmonar, identificar y separar las regiones proximal y distal. La tráquea y los bronquios se consideran "proximales". A los efectos de este protocolo, la tráquea y las primeras 2-3 generaciones de bronquios se diseccionan y se utilizan para el aislamiento del epitelio de las vías respiratorias "proximales". Las vías respiratorias pequeñas de 2 mm o menos de diámetro y el tejido parenquimatoso circundante se consideran, a los efectos de este protocolo, como epitelio pulmonar "distal" (Figura 1A).
NOTA: Todos los procedimientos que impliquen el procesamiento de tejido pulmonar humano deben realizarse en un gabinete de bioseguridad con el uso de equipo de protección personal adecuado.
2. Enriquecimiento y subestablecimiento de pequeñas células progenitoras epiteliales de las vías respiratorias y alveolares a partir del tejido pulmonar distal
- Preparación del tejido distal
- Coloque el tejido pulmonar distal en una placa de Petri estéril (150 x 15 mm). Cortar el tejido en dados en aproximadamente 1 cm3 piezas y colocar en un tubo limpio de 50 ml.
- Lave el tejido 3 veces con HBSS refrigerado, desechando el lavado de HBSS cada vez para eliminar la sangre y el líquido del revestimiento epitelial.
- Coloque el tejido en una nueva placa de Petri y seque con toallitas anti pelusa estériles. Usando fórceps y tijeras, retire la mayor cantidad de pleura visceral (una delicada membrana transparente que cubre la superficie del pulmón) como sea posible.
- Use tijeras para picar el tejido en trozos de aproximadamente 2 mm de diámetro. Transfiera el tejido picado a una placa de Petri limpia y pice aún más cortándolo a un tamaño aproximado de 1 mm con una cuchilla de afeitar estéril de un solo lado.
- Digestión enzimática
NOTA: La solución madre de Liberase es de 5 mg/ml (100x) y la cepa de DNasa es de 2,5 mg/ml (100x) (Tabla de materiales).- Añadir 50 μg/mL liberasa y 25 μg/ml de DNasa en HBSS estéril en un tubo cónico de 50 ml.
- Transfiera aproximadamente 2-3 g de tejido picado a un nuevo tubo cónico de 50 ml con 25 ml de HBSS, que contenga Liberase y DNasa. Incubar durante 40-60 min a 37 °C con agitación continua utilizando un mezclador a 900 rpm. Después de 30 min de incubación, triturar el tejido digerido usando una jeringa de 30 mL sin aguja para evitar la formación de grumos y continuar con la incubación.
NOTA: El tiempo de incubación con las enzimas puede variar dependiendo del tipo o condición del tejido. Por ejemplo, la digestión enzimática del tejido normal tarda aproximadamente 45 minutos. Sin embargo, el tejido fibrótico de muestras de fibrosis pulmonar idiopática puede requerir un tiempo de incubación más largo de hasta 60 min. Por lo tanto, controle el tejido cuidadosamente durante este paso para evitar daños en los marcadores de superficie, lo cual es crucial para FACS.
- Aislamiento de una sola célula
- Triture el tejido mediante la extracción 5x a través de una aguja de 16 G colocada en una jeringa de 30 ml. Extraiga la suspensión de tejido en una pipeta de diámetro ancho y pase a través de una serie de coladores celulares (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) bajo presión de vacío. Lave el colador con 20 ml de tampón HBSS+ para recoger las células restantes. La receta para el búfer HBSS+ se puede encontrar en la Tabla de materiales.
- Agregue un volumen igual de tampón HBSS +, después de 45 minutos al filtrado para inhibir la actividad de Liberase y evitar la sobredigestión.
- Filtra la centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante. Agregue 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) al pellet, balancee suavemente el tubo para desalojar el gránulo e incube en hielo durante 1 min.
NOTA: La cantidad y el tiempo en la solución de lisis de glóbulos rojos depende del tamaño del pellet. Es importante mantener las células en hielo y controlar cuidadosamente el tiempo en la solución de lisis de glóbulos rojos para prevenir la lisis de las células diana. Si la lisis de los glóbulos rojos es insuficiente, repita el paso. - Agregue 10-20 ml de tampón HBSS+ para neutralizar el tampón de lisis de RBC. Filtra la centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Si los glóbulos rojos lisados (células fantasma) forman una capa turbia sobre el gránulo celular, resuspenda el gránulo en 10 ml de tampón HBSS + y cuele la suspensión a través del colador de células de 70 μm para eliminar las células fantasma. Centrifugar el filtrado a 500 x g durante 5 min a 4 °C y continuar con los pasos posteriores.
- Agotamiento de las células inmunes y las células endoteliales (paso opcional)
- Agotar las células endoteliales CD31+ y las células inmunes CD45+ del grupo de células totales utilizando las microperlas CD31 y CD45 conjugadas con anticuerpos monoclonales antihumanos CD31 y CD45 (isotipo de ratón IgG1) y columnas LS de acuerdo con el protocolo del fabricante (Tabla de Materiales).
- Recoger el flujo a través, que consiste principalmente en células epiteliales y estromales, en un tubo estéril fresco y centrifugarlo a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Realice un recuento de celdas para determinar el número total de células en el flujo a través.
- Tinción de la superficie celular para la clasificación celular asociada a la fluorescencia (FACS)
- Resuspend 1 x 107 celdas por 1 ml de tampón HBSS+. Añadir anticuerpos primarios a la concentración requerida e incubar las células durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. En este estudio, se utilizaron anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos a menos que se indique lo contrario. Los detalles de las fuentes de anticuerpos y los títulos se describen en la Tabla de materiales.
NOTA: HTII-280 es actualmente el mejor anticuerpo reactivo de superficie que permite la subconfiguración de células pulmonares distales en fracciones celulares predominantemente de vías respiratorias (HTII-280-) y alveolares tipo 2 (HTII-280+). Una advertencia a esta estrategia es que las células AT1 no se tiñen utilizando este método y están mal representadas debido a su fragilidad. Sin embargo, las células AT1 están mal representadas en las preparaciones pulmonares distales, presumiblemente debido a su fragilidad y pérdida durante la selección de células viables por FACS y, por lo tanto, solo representan un contaminante raro de la fracción celular de las vías respiratorias. - Lave las células añadiendo 3 ml de tampón HBSS+ y centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Si usa anticuerpos primarios no conjugados, agregue la concentración requerida de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado e incube durante 30 minutos en hielo. Lave el exceso de anticuerpos secundarios agregando 3 ml de tampón HBSS+ y centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche las células sobrenadantes y resuspend en tampón HBSS+ por 1 x 107 células/ml. Filtre las células en tubos de poliestireno de 5 ml a través de una tapa de filtro para garantizar la formación de una suspensión de una sola célula. Añadir DAPI (1 μg/ml) para teñir las células permeables (muertas).
NOTA: Es esencial usar controles apropiados de un solo color y fluorescencia menos uno (FMO) (es decir, cóctel de tinción de anticuerpos menos un anticuerpo cada uno), para minimizar los falsos positivos durante FACS. En este estudio, se utilizaron perlas de selección positivas y negativas para la compensación empírica de la superposición de espectros de emisión entre fluoróforos (Tabla de Materiales). FACS enriquece los tipos de células de interés. Las células epiteliales viables se enriquecen en función de su fenotipo de superficie celular CD45 negativo, CD31 negativo, CD236 positivo y tinción negativa para DAPI. Esta fracción de células epiteliales se puede subconfigurar aún más en función de la tinción para marcadores de superficie específicos del tipo de célula, como la tinción específica para células HTII-280 positivas que están enriquecidas para células AT2. Por el contrario, la selección negativa para HTII-280 permite el enriquecimiento de pequeñas células epiteliales de las vías respiratorias como las células club y ciliadas (Figura 2).
- Resuspend 1 x 107 celdas por 1 ml de tampón HBSS+. Añadir anticuerpos primarios a la concentración requerida e incubar las células durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. En este estudio, se utilizaron anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos a menos que se indique lo contrario. Los detalles de las fuentes de anticuerpos y los títulos se describen en la Tabla de materiales.
3. Enriquecimiento y subestablecimiento de células progenitoras epiteliales de las vías respiratorias traqueobronquiales
- Preparación de tejidos
- Diseccionar las vías respiratorias proximales (tráquea/bronquios) de los pulmones. Abra las vías respiratorias a lo largo de su longitud usando tijeras para exponer la luz y agregue 50 μg / ml de Liberase para cubrir completamente el tejido.
- Incubar durante 20 min a 37 °C con agitación continua utilizando un termomejorador a 900 rpm.
- Retire la vía aérea proximal del tubo de la centrífuga y colóquela en una placa de Petri estéril (150 x 15 mm). Raspe suavemente la superficie de las vías respiratorias con un bisturí para eliminar completamente las células epiteliales luminales del tejido.
- Lave la placa de Petri con 5 ml de tampón HBSS+ estéril para recoger todas las células epiteliales luminales desprendidas y transferir las células desalojadas a un tubo de centrífuga cónica de 50 ml. Triture la suspensión extrayendo una aguja de 5x a 16 G y una aguja de 18 G instalada en una jeringa de 10 ml para obtener una suspensión de una sola célula.
- Centrifugar la suspensión a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender el pellet en un tampón HBSS + fresco y almacene estas células luminales de las vías respiratorias en hielo, listas para combinarse con la suspensión de una sola célula generada a partir de las vías respiratorias proximales picadas en los próximos pasos.
- Usando tijeras, corte el tejido traqueobronquial restante a lo largo de sus anillos para generar pequeñas tiras de tejido y transfiera las tiras a una placa de Petri fresca. Picar las tiras de tejido con una hoja de afeitar de un solo lado para hacer piezas más pequeñas.
NOTA: Dado que las vías respiratorias proximales son cartilaginosas, no se pueden picar tan finamente como el tejido pulmonar distal. - Transfiera el tejido picado a los tubos C, agregue 2 ml de Liberase al tubo asegurándose de que el tejido esté sumergido. Cargue el tubo C en el disociador automatizado y ejecute el Protocolo pulmonar humano-2 para disociar mecánicamente el tejido aún más.
NOTA: El disociador utilizado en este protocolo ofrece un programa optimizado llamado protocolo pulmonar humano-2 para esta aplicación específica (ver Tabla de Materiales).
- Digestión enzimática y aislamiento unicelular
- Transfiera aproximadamente 2 g de tejido proximal picado del tubo C a cada tubo centrífugo cónico de 50 ml y agregue 50 μg/ml de Liberase y 25 μg/ml de solución de DNasa a cada tubo.
NOTA: Para garantizar una disociación eficiente, los tubos no deben llenarse más allá de la marca de 30 ml. - Incubar el tejido picado durante 45 min a 37 °C con agitación continua utilizando un mezclador a 900 rpm.
- Pase la suspensión de tejido disociado a través de una serie de coladores celulares (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) bajo presión de vacío como se mencionó anteriormente y recoja el flujo a través. Lave el colador con 20 ml de tampón HBSS+ para recoger las células restantes.
NOTA: Dado que el tejido proximal es cartilaginoso y voluminoso en comparación con el tejido distal, existe una mayor posibilidad de obstrucción de los filtros. El uso de un embudo puede ayudar a prevenir el desbordamiento del líquido al pasar a través de los coladores. - Agregue un volumen igual de tampón HBSS+ al filtrado para inhibir la actividad de Liberase y evitar la sobredigestión. Agregue las células aisladas de las vías respiratorias proximales luminales de 3.1.5 a la suspensión celular en este paso.
- Centrifugar la suspensión de celda combinada a 500 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y repita el lavado celular en el tampón HBSS+. Realizar el agotamiento de las células inmunes CD45+ y las células endoteliales CD31+ como se mencionó anteriormente en 2.4 (paso opcional).
- Los métodos para la tinción son similares al tejido pulmonar distal, siga los pasos en 2.5. Enriquezca las células epiteliales viables en función de su fenotipo de superficie celular CD45 negativo, CD31 negativo, CD236 positivo y tinción negativa para DAPI.
- Subconjunto adicional de la fracción de células epiteliales basada en la tinción para marcadores de superficie específicos del tipo celular, como NGFR, lo que permite el enriquecimiento de tipos de células basales (NGFR positivas) y no basales (NGFR negativas; secretoras, ciliadas, neuroendocrinas) (Figura 3).
- Transfiera aproximadamente 2 g de tejido proximal picado del tubo C a cada tubo centrífugo cónico de 50 ml y agregue 50 μg/ml de Liberase y 25 μg/ml de solución de DNasa a cada tubo.
4. Cultivo de organoides
- Agregue 5,000 (este número se puede ajustar para producir la densidad deseada de organoides epiteliales) células epiximales o distales clasificadas a un tubo estéril de 1.5 ml junto con 7.5 x 104 células MRC-5 (línea celular de fibroblastos pulmonares humanos). Las interacciones epitelial-mesenquimal son críticas para la expansión de las células progenitoras.
- Centrifugadora a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
NOTA: Es importante confirmar manualmente el recuento de células obtenidas del clasificador para garantizar la precisión de la eficiencia de formación de colonias organoides. - Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular en 50 μL de medios helados suplementados con antibióticos. Mantenga la suspensión celular sobre hielo.
- Agregue 50 μL de medio de matriz de membrana basal agotado con factor de crecimiento helado 1x al vial y pipetee suavemente la suspensión sobre hielo para mezclar.
NOTA: Es importante utilizar medios helados y mantener las células en hielo para evitar la polimerización prematura del medio de la matriz de membrana basal. - Transfiera la suspensión celular a un inserto de cultivo celular de tamaño de poro de 0,4 μm en una placa de 24 pocillos (1,4 x 104 células/cm2), teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire.
- Incubar a 37 °C durante 30-45 min para permitir que la matriz se solidifique.
- Agregue 600 μL de medio de crecimiento precalentado al pozo.
NOTA: Media se suplementó con agentes antimicóticos (0,4%) y estreptococo de pluma (1%) durante las primeras 24 h después de la siembra y 10 μM de inhibidor de la Rho quinasa durante las primeras 72 h. - Cultivo a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 30 días, tiempo durante el cual se deben cambiar los medios cada 48 h.
NOTA: La duración del cultivo se puede modificar en función del propósito del experimento. Los puntos finales más largos se utilizan para estudiar la diferenciación, mientras que los puntos finales más cortos de 7 días, 14 días, etc., se pueden usar si el propósito del experimento no es lograr una diferenciación completa. - Añadir un inhibidor de TGFβ de 10 μM al medio de cultivo durante 15 días para mantener las células en la fase proliferativa y suprimir el crecimiento excesivo de fibroblastos.
NOTA: Los resultados difieren según el medio de cultivo utilizado para el ensayo. Por ejemplo, los resultados mostrados en este documento se generaron utilizando Pneumacult-ALI Medium, lo que resulta en la generación de organoides grandes a partir del pulmón distal, organoides bien diferenciados y más grandes del pulmón proximal.
5. Tinción organoidea
- Fijación e incrustación de organoides
- Aspire los medios de las cámaras de inserción transmembrana superior e inferior y enjuague una vez con PBS caliente.
- Fije los cultivos colocando 300 μL de PFA (2% p/v) en el inserto y 500 μL en el pozo durante 1 hora a 37 °C. Retire el fijador y enjuague con PBS caliente teniendo cuidado de no desalojar el tapón de la matriz de membrana basememt.
NOTA: Los organoides fijos se pueden almacenar sumergidos en PBS a 4 °C durante una o dos semanas antes de iniciar nuevos pasos. - Aspire PBS, invierta el inserto y corte cuidadosamente la membrana del inserto alrededor de su periferia. Usando fórceps, retire la membrana transwell, teniendo cuidado de no molestar el tapón de la matriz.
- En una placa de Petri, toque el inserto para recuperar el tapón de matriz.
- Agregue una gota de gel de procesamiento de muestras como Histogel (mantenido a 37 ° C) al tapón de la matriz y manténgalo a 4 ° C hasta que el gel se solidifique.
- Transfiera el tapón a un cassette de incrustación, deshidrate a través del aumento de las concentraciones de etanol (70, 90 y 100%), claro en xileno e incruste en cera de parafina.
- Cortar secciones de 7 μm en un microtomo y recoger en portaobjetos cargados positivamente.
- Tinción por inmunofluorescencia de organoides
- Coloque los toboganes a 65 °C durante 30 minutos hasta el desparafinado.
- Desparafinar las secciones por inmersión en xileno y rehidratar a través de concentraciones decrecientes de etanol.
- Realice la recuperación de antígenos a alta temperatura en una solución de desenmascaramiento de antígenos, base de ácido cítrico utilizando un recuperador disponible comercialmente sumergiendo portaobjetos en la solución durante 15 min (Tabla de materiales).
- Rodear el tejido con una barrera hidrofóbica usando una pluma de Papanicolaou.
- Bloquear la tinción inespecífica entre los anticuerpos primarios y el tejido, incubando en el tampón de bloqueo.
- Incubar secciones en la concentración adecuada de anticuerpos primarios diluidos en solución de incubación durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada.
- Enjuague las secciones 3x a temperatura ambiente con un tampón de lavado.
- Incubar en la concentración adecuada de anticuerpo secundario conjugado fluorocromo durante 1 h a temperatura ambiente.
- Enjuague las secciones 3x a temperatura ambiente con Tween 20-TBS al 0,1%. Incube las secciones durante 5 min en DAPI (1 μg/mL). Enjuague las secciones una vez en TBS (solución salina tamponada Tris) con Tween 20 al 0,1%, seque y monte en una solución de montaje (Figura 4 y Figura 5).
NOTA: La fuente y la dilución óptima de trabajo de los anticuerpos primarios y secundarios utilizados para la tinción por inmunofluorescencia se incluyen en la Tabla de Materiales.
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Representative Results
Fuente de tejido pulmonar
La tráquea y el bronquio extrapulmonar (Figura 1A) se utilizaron como tejido fuente para el aislamiento de las células epiteliales de las vías respiratorias proximales y la posterior generación de organoides proximales. Se utilizó tejido pulmonar distal que incluye tanto parénquima como vías respiratorias pequeñas de menos de 2 mm de diámetro (Figura 1A) para el aislamiento de células epiteliales alveolares y de vías respiratorias pequeñas (epitelio pulmonar distal) y la generación de organoides alveolares o de vías respiratorias pequeñas. Las vías respiratorias proximales revestidas por un epitelio pseudoestratificado incluyen abundantes células progenitoras basales que son inmunorreactivas para la proteína de membrana NGFR (Figura 1B, C). En contraste, las células epiteliales que recubren los alvéolos incluyeron un subconjunto que muestra inmunorreactividad de la membrana apical con el anticuerpo monoclonal HTII-280, lo que sugiere su identidad de células alveolares tipo 2 (AT2) (Figura 1B, D). Estos marcadores de superficie se utilizaron para subestablecer suspensiones unicelulares de células epiteliales aisladas de regiones proximales o distales.
Disociación tisular y fraccionamiento celular
Las suspensiones unicelulares de células totales se aislaron de regiones proximales o distales del tejido pulmonar humano y se fraccionaron utilizando perla magnética y FACS para producir poblaciones de células epiteliales enriquecidas (Figura 2 y Figura 3). Se tiñeron abundantes tipos de células contaminantes, incluidos los glóbulos rojos, las células inmunes y las células endoteliales, utilizando anticuerpos contra CD235a, CD45 y CD31, respectivamente, seguidos de la clasificación celular asociada magnéticamente para el agotamiento de estos tipos de células del grupo total de células pulmonares. Las suspensiones celulares "agotadas" resultantes se enriquecieron significativamente para las poblaciones de células epiteliales en muestras de tejido distal (Figura 2E) y proximal (Figura 3E), con el correspondiente aumento en la eficiencia de FACS. Después del agotamiento de las células CD235a/CD45/CD31 positivas utilizando microperlas CD45 y CD31, el porcentaje de CD31-/CD45-/CD235a- aumentó del 14% (Figura 2A,B) al 51,7% (Figura 2E,F) en la población distal. El agotamiento adicional de FACS de las células que se tiñen positivamente para CD235a, CD45 o CD31, la eliminación de células con tinción positiva para DAPI y la selección positiva para el marcador de superficie de células epiteliales CD326, condujo a una población de células distales altamente enriquecida que representó el 33,5% (Figura 2E, G) en comparación con el 7% (Figura 2A, C ) antes del agotamiento de la población negativa. Se logró un subconjunto adicional de las poblaciones de células epiteliales distales mediante fraccionamiento basado en la tinción superficial con el anticuerpo monoclonal HTII-280 (Figura 2D, H), respectivamente. En consecuencia, las células epiteliales pulmonares distales incluyeron subconjuntos HTII-280+ y 2,6% HTII-280- (Figura 2D sin agotamiento de CD31/CD45/CD235a) y subconjuntos HTII-280+ y 3,6% HTII-280- (Figura 2H después del agotamiento de CD31/CD45/CD235a).
El total de células aisladas de la región proximal se agotó para las células CD235a/CD45/CD31 positivas utilizando microperlas CD45 y CD31 y el porcentaje de CD31-/CD45-/CD235a- aumentó del 17% (Figura 3A,B) al 56,6% (Figura 3E,F). La selección positiva para el marcador de superficie de células epiteliales CD326 en células aisladas de la región proximal, condujo a una población de células proximales altamente enriquecida que representó el 38% (Figura 3E,G) de las fracciones totales de células pulmonares en comparación con el 9,3% (Figura 3A, C) sin agotamiento de la población negativa, respectivamente. Se logró un subconjunto adicional de las poblaciones de células epiteliales proximales mediante fraccionamiento basado en la tinción superficial con anticuerpos contra NGFR (Figura 3D, H), respectivamente. En consecuencia, las células epiteliales pulmonares proximales incluyeron 2,7% NGFR+ y 6,5% NGFR- subconjuntos (Figura 3D sin agotamiento de CD31/CD45/CD235a) y 13% fueron NGFR+ y 25% NGFR- (Figura 3H después del agotamiento de CD31/CD45/CD235a).
Cultivos de organoides pulmonares
Los organoides epiteliales pulmonares distales se cultivaron dentro de la matriz de membrana basal agotada del factor de crecimiento en medios que se probaron empíricamente para optimizar el crecimiento y la diferenciación de organoides. Se evaluaron tres medios diferentes, incluidos PneumaCult-ALI medio, medio de crecimiento de células epiteliales de vías respiratorias pequeñas (medio SAECG) y medio basal de ratón. El crecimiento organoide óptimo se obtuvo utilizando el medio PneumaCult-ALI, que fue seleccionado para estudios adicionales. Los cultivos de células epiteliales pulmonares distales HTII-280+ produjeron organoides de rápida expansión con una eficiencia promedio de formación de colonias del 10% (Figura 4A, B). La tinción por inmunofluorescencia de cultivos del día 30 utilizando el anticuerpo monoclonal HTII-280 y SPC reveló organoides que contienen lumen compuestos predominantemente de células epiteliales pulmonares distales HTII-280+ y SPC+ (Figura 4C, C' y Figura 4D,D'). Los cultivos de células HTII-280- epiteliales pulmonares distales produjeron organoides que estaban compuestos por un epitelio pseudoestratificado parecido al de las vías respiratorias pequeñas (no se muestra).
Los organoides epiteliales pulmonares proximales se cultivaron a partir de células NGFR+ sembradas en Matrigel y se cultivaron durante 30 días en medio PneumaCult-ALI. Se observaron grandes organoides que contenían lúmenes (Figura 5D, E, F) con una eficiencia promedio de formación de colonias del 7,8% (Figura 5A, B, C). Los organoides estaban compuestos por un epitelio pseudoestratificado compuesto por células basales Krt5+ y NGFR+ autorrenovantes (Figura 5D, 5E) y tipos de células luminales diferenciadas, incluidas las células ciliadas FoxJ1+ y las células secretoras MUC5AC+ (Figura 5D,E).
Figura 1: Muestreo de tejido pulmonar humano. (A) Representación esquemática del pulmón humano que muestra la estrategia para el muestreo de las regiones proximal y distal para el aislamiento celular. (B) Tinción H&E de las regiones proximal y distal del pulmón. (C,D) Tinción inmunofluorescente de las regiones correspondientes que muestra células progenitoras basales NGFR+ (rojas) en la membrana basal de las vías respiratorias bronquiales y progenitores alveolares tipo II HTII-280+ (verdes) en los alvéolos. barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estrategia de clasificación representativa para las células pulmonares distales. (A,E) Porcentaje de varias poblaciones celulares antes y después del agotamiento de la población CD45+ y CD31+ utilizando perlas magnéticas CD31 y CD45 en regiones distales del pulmón de una muestra biológica. (B,F) Imagen representativa de la gráfica FACS que muestra la estrategia de cierre de la población distal CD31-/CD45-/CD235a- antes y después del agotamiento de la población CD31/CD45/CD235a positiva (C,G) población Epcam+ antes y después del agotamiento de la población CD31/CD45/CD235a positiva. (D,H) Población HTII-280+/- antes y después del agotamiento de las células CD31/CD45/CD235a positivas. Los paneles A-D son de la misma muestra biológica y los paneles E-H son de la misma muestra biológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Estrategia de clasificación representativa para células pulmonares proximales. (A,E) Porcentaje de varias poblaciones celulares antes y después del agotamiento de la población CD45+ y CD31+ utilizando perlas magnéticas CD31 y CD45 en regiones proximales del pulmón. (B,F) Imagen representativa de la gráfica FACS que muestra la estrategia de gating de la población proximal CD31-/CD45-/CD235a- antes y después del agotamiento de la población CD31/CD45/CD235a positiva (C,G) población Epcam+ antes y después del agotamiento de la población CD31/CD45/CD235a positiva. (D,H) NGFR+/- población antes y después del agotamiento de las células CD31/CD45/CD235a positivas. Los paneles A-D y E-H se prepararon a partir de dos muestras biológicas diferentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Caracterización de organoides pulmonares distales. (A) Imagen representativa de los organoides distales humanos cultivados en medio PneumaCult-ALI (aumento 2x). (B) La eficiencia formadora de colonias (%CFE) se calculó en pozos triplicados de organoides derivados de dos muestras biológicas diferentes. (C, C') Tinción inmunofluorescente de organoides distales correspondientes cultivados en medio ALI que muestra células HTII-280+ AT2 (verde). (D, D') El marcador utilizado para el aislamiento de células AT2 en este estudio, HTII-280 costaínas (verde) para el otro marcador celular AT2 bien caracterizado, SPC (rojo). Barra de escala = 50um. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Caracterización de organoides proximales del pulmón proximal humano. (A,B) Imagen representativa de los organoides proximales humanos cultivados en PneumaCult-ALI barra de escala media 50 μm. (C) El porcentaje de eficiencia formadora de colonias (%CFE) se calculó sobre pocillos triplicados de organoides derivados de dos muestras biológicas diferentes. Tinción inmunofluorescente de organoides proximales diferenciados en el día 30 con (D) células basales Krt5+ (verde), células ciliadas FoxJ1+ (rojo) (E) células basales Krt5+ (verde) y células caliciformes MUC5AC+ (rojas). (F) El marcador utilizado para el aislamiento de células basales en este estudio, las tinciones conjuntas NGFR (verde) para el marcador de células basales bien caracterizado, Krt5 (rojo). Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Describimos un método confiable para el aislamiento de subpoblaciones definidas de células pulmonares del tejido pulmonar humano para análisis molecular o funcional y modelado de enfermedades. Los elementos críticos de los métodos incluyen la capacidad de lograr la disociación tisular con la preservación de epítopos superficiales, que permiten el enriquecimiento mediado por anticuerpos de células recién aisladas, y la optimización de los métodos de cultivo para la generación eficiente de organoides epiteliales específicos de la región. Nos centramos en la recuperación y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales capaces de formar organoides cuando se recombinan con células de soporte estromal en cultivo tridimensional. Aunque no definimos la clonalidad de organoides en estos cultivos, se demostró que estudios similares realizados con células progenitoras epiteliales pulmonares de ratón aisladas se basaban clonalmente en el uso de cultivos mixtos de células que albergaban distintos reporteros fluorescentes22,23.
Los métodos descritos en este documento incluyen adaptaciones destinadas a mejorar la recuperación celular del tejido pulmonar digerido. Las muestras digeridas se pasan a través de una aguja de calibre 16 para interrumpir aún más cualquier grupo restante no digerido y para lograr una suspensión celular homogénea. La agregación celular causada por el ADN genómico extruido se mitigó mediante la adición de DNasa I, que produjo una preparación celular homogénea que proporciona un flujo fluídico ininterrumpido durante el aislamiento de FACS. Juntas, estas modificaciones simples mejoran la recuperación de las poblaciones de células objetivo y evitan retrasos debido a la aglomeración durante el enriquecimiento de FACS.
Los protocolos anteriores requieren la digestión tisular con elastasa, dispasa y tripsina/2 mM EDTA para producir una suspensión de una sola célula antes del aislamiento celular 4,5. Sin embargo, esta combinación de proteasas conduce a la pérdida de proteínas de superficie y requiere que las células se cultiven durante la noche en placas de cultivo recubiertas de purcol para la reexpresión de proteínas de superficie antes de la tinción de anticuerpos y FACS. Por el contrario, la combinación de Liberase y agitación mecánica para alterar suavemente el tejido pulmonar proporciona un protocolo de disociación más eficiente, pero más suave, que se puede realizar más rápidamente mientras se preservan los epítopos superficiales para la tinción de anticuerpos y el enriquecimiento de FACS. Por lo tanto, el tiempo total de procesamiento del tejido se condensa y el aislamiento de FACS se puede realizar inmediatamente después de la disociación del tejido.
Estos métodos permiten el aislamiento y el cultivo in vitro de células progenitoras epiteliales que producen una progenie especializada representativa de su región de origen. Sin embargo, estos métodos se pueden aplicar de manera similar a la identificación y enriquecimiento de otras poblaciones celulares, como los tipos de células inmunes, vasculares y estromales. Esto podría ser particularmente aplicable al desarrollo de sistemas regionales de epitelio pulmonar en chip que permiten el modelado de compartimentos vasculares y epiteliales y la introducción de otros tipos de células como las células inmunes 24,25,26. En un estudio reciente, utilizamos cultivos organoides 3D de epitelio alveolar generados utilizando esta metodología que se utilizaron como herramienta para estudiar el modelado covid 19 del pulmón y para detectar dianas terapéuticas contra la infección por SARS-CoV-2. 27
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo de Mizuno Takako para IFC y tinción H y E, Vanessa García para la seccionamiento de tejidos y Anika S Chandrasekaran por ayudar con la preparación del manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) y el Consorcio Celgene IDEAL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 |
References
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