Method Article

Isolamento e arricchimento di cellule progenitrici epiteliali polmonari umane per la coltura di organoidi

DOI:

10.3791/61541

⸱

July 21st, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Lung and Regenerative Medicine Institutes, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per la dissociazione dei tessuti e gli approcci di frazionamento cellulare che consentono l'arricchimento di cellule epiteliali vitali dalle regioni prossimali e distali del polmone umano. Qui questi approcci sono applicati per l'analisi funzionale di cellule progenitrici epiteliali polmonari attraverso l'uso di modelli di coltura di organoidi 3D.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I modelli organoidi epiteliali servono come strumenti preziosi per studiare la biologia di base di un sistema di organi e per la modellazione delle malattie. Se coltivate come organoidi, le cellule progenitrici epiteliali possono auto-rinnovarsi e generare progenie differenziante che mostra funzioni cellulari simili a quelle delle loro controparti in vivo . Qui descriviamo un protocollo passo-passo per isolare i progenitori specifici della regione dal polmone umano e generare colture organoidi 3D come strumento sperimentale e di convalida. Definiamo le regioni prossimali e distali del polmone con l'obiettivo di isolare le cellule progenitrici specifiche della regione. Abbiamo utilizzato una combinazione di dissociazione enzimatica e meccanica per isolare le cellule totali dal polmone e dalla trachea. Specifiche cellule progenitrici sono state quindi frazionate dalle cellule di origine prossimale o distale utilizzando lo smistamento cellulare associato alla fluorescenza (FACS) basato su marcatori di superficie specifici del tipo cellulare, come NGFR per lo smistamento delle cellule basali e HTII-280 per lo smistamento delle cellule alveolari di tipo II. I progenitori basali o alveolari isolati di tipo II sono stati utilizzati per generare colture organoidi 3D. Sia i progenitori distali che quelli prossimali formavano organoidi con un'efficienza di formazione della colonia del 9-13% nella regione distale e del 7-10% nella regione prossimale quando placcati 5000 cellule / pozzetto il giorno 30. Gli organoidi distali hanno mantenuto le cellule alveolari di tipo II HTII-280+ in coltura, mentre gli organoidi prossimali si sono differenziati in cellule ciliate e secretorie entro il giorno 30. Queste colture organoidiche 3D possono essere utilizzate come strumento sperimentale per lo studio della biologia cellulare dell'epitelio polmonare e delle interazioni mesenchimali epiteliali, nonché per lo sviluppo e la convalida di strategie terapeutiche mirate alla disfunzione epiteliale in una malattia.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli spazi aerei del sistema respiratorio umano possono essere ampiamente suddivisi in zone conduttrici e respiratorie che mediano rispettivamente il trasporto di gas e il loro successivo scambio attraverso la barriera epiteliale-microvascolare. Le vie aeree conduttrici comprendono trachea, bronchi, bronchioli e bronchioli terminali, mentre gli spazi dell'aria respiratoria comprendono bronchioli respiratori, dotti alveolari e alveoli. Il rivestimento epiteliale di questi spazi aerei cambia nella composizione lungo l'asse prossima-distale per soddisfare i requisiti unici di ogni zona funzionalmente distinta. L'epitelio pseudostratificato delle vie aeree tracheo-bronchia....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il tessuto polmonare umano è stato ottenuto da donatori di tessuto deceduti in conformità con le procedure di consenso sviluppate dall'International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM) e approvate dal Cedars-Sinai Medical Center Internal Review Board.

1. Trattamento tissutale per l'isolamento di cellule polmonari da regioni tracheo-bronchiali o piccole vie aeree / parenchimali (piccole vie aeree e alveoli)

  1. Preparare e autoclave tutti gli strumenti di dissezione, vetreria e le soluzioni appropriate un giorno prima dell'isolamento cellulare.
  2. Dopo aver ricevuto il tessuto polmonare, identificare e separare le r....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tessuto polmonare sorgente
La trachea e il bronco extrapolmonare (Figura 1A) sono stati utilizzati come tessuto di origine per l'isolamento delle cellule epiteliali delle vie aeree prossimali e la successiva generazione di organoidi prossimali. Il tessuto polmonare distale che comprende sia il parenchima che le piccole vie aeree di diametro inferiore a 2 mm (Figura 1A) è stato utilizzato per l'isolamento di piccole cellule epiteliali delle vi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un metodo affidabile per l'isolamento di sottopopolazioni definite di cellule polmonari dal tessuto polmonare umano per l'analisi molecolare o funzionale e la modellazione della malattia. Gli elementi critici dei metodi includono la capacità di ottenere la dissociazione dei tessuti con la conservazione degli epitopi superficiali, che consentono l'arricchimento mediato da anticorpi di cellule appena isolate, e l'ottimizzazione dei metodi di coltura per la generazione efficiente di organoidi epiteliali specific.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apprezziamo il supporto di Mizuno Takako per la colorazione IFC e H ed E, Vanessa Garcia per il sezionamento dei tessuti e Anika S Chandrasekaran per l'aiuto nella preparazione del manoscritto. Questo lavoro è supportato dal National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) e dal Celgene IDEAL Consortium.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Isolamento
10 mL Siringhe sterili, Luer-Lok TipFisher scientificBD 309646
30 mL Siringhe sterili, Luer-Lok TipVWRBD302832
Sacche per rischio biologicoVWR89495-440
Sacche per rischio biologicoVWR89495-440
anello di collegamentoPluriselect41-50000-03
Desossiribonucleasi (lotto # SLBF7798V)sigma AldrichDN25-1G
Piastre di Petri monousoCorning / Falcon25373-187
ImbutoPluriselect42-50000
HBSSCorning21-023
Liberase TM Research Gradesigma Aldrich5401127001
ago 16GVWR305198
ago 18GVWR305199
PluriStrainer 100 &; micro; m (Filtro cellulare)Pluriselect43-50100-51
PluriFiltro 300 µ m (Filtro cellulare)Pluriselect43-50300-03
PluriFiltro 40 µ m (Filtro cellulare)Pluriselect43-50040-51
PluriFiltro 500 µ m (Filtro cellulare)Pluriselect43-50500-03
PluriFiltro 70 µ m (Cell Strainer)Pluriselect43-50070-51
Lamette da barbaVWR55411-050
Tampone per lisi dei globuli rossieBioscience00-4333-57
Equipment' s
GentleMACS C TubesMACS Miltenyi Biotec130-096-334
GentleMACS Octo DissociatoreMACS Miltenyi Biotec130-095-937
Leica ASP 300s Processatore
LS ColonneMACS Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStand**Miltenyi Biotech130-042-303
ThermomixerEppendorf05-412-503
ThermomixerEppendorf05-412-503
HBSS+ Tampone
Amfotericina BThermo fisher scientific152900182ml
EDTA (0,5 M), pH 8,0, senza RNasiThermo fisher scientificAM9260G500µ l
Siero fetale bovino GeminiBio-Products100-10610ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 mlVWR45000-456500ml flacone
HEPES (1 M)Thermo fisher scientific156300805ml
Penicillina-Streptomicina-Neomicina (PSN) Miscela antibioticaThermo fisher scientific156400555ml
Elenco dei anticorpi per FACS
Alexa Fluor 647 anti-umano CD326 (EpCAM) AnticorpoBioLegend3698201:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Set di particelle di controllo negativeFisher ScientificBDB552843
CD31 MicroBead Kit, umanoMiltenyi Biotec130-091-93520µ l/ 107 cellule totali
CD45 MicroBeads, umanoMiltenyi Biotec130-045-80120µ l/ 107 cellule totali
DAPISigma AldrichD9542-10MG1:10000
FITC anti-umano CD235aBioLegend3491041:100
FITC anti-umano CD31BioLegend3031041:100
FITC anti-umano CD45BioLegend3040541:100
FITC anti-topo Anticorpo IgMBioLegend 406506s1:500
Topo IgM anti umano HT2-280TerrazzaBiotech TB-27AHT2-2801:300
PE anti-umano CD271 (NGFR)BioLegend3451061:50
Composizione dei terreni
MRC-5ATCCCCL-171
PneumaCult -ALI MediumStemcell Technologies5001
Epiteliale delle piccole vie aeree Terreno di coltura cellularePromoCellC-21170
Inserti per colture tissutali ThinCert, sterileGreiner Bio-One662641
Y-27632 (inibitore ROCK) 100mM stock (1000x)Stemcell Technologies72302
Topo Terreno basale:
Amfotericina BThermo fisher scientific1529001850 &; l
DMEM/F-12, HEPESThermoFisher scientific1133003250 ml
Siero Fetale Bovino GeminiBio-Products100-1065 ml
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS -G) (100X)ThermoFisher scientific41400045500 &; l
Penicillina-Streptomicina-Neomicina (PSN) Miscela di antibioticiThermo fisher scientific15640055500 &; l
SB431542 Inibitore della via TGF-β (stock 100 mM)Cellule staminali722345 &; l
Elenco degli anticorpi per immunoistochimica
Soluzione di smascheramento dell'antigene, vettore a base di acido citricoH-3300937 & micro; l in 100 ml di acqua
HistogelThermo ScientificHG-4000-012
Anticorpi
Anti HT2-280TerracebiotechTB-27AHT2-2801:500
FOXJ1 Anticorpo monoclonale (2A5)Thermo Fisher Scientific14-9965-821:300
Uteroglobina/SCGB1A1Anticorpi umani Sistemi di ricerca e sviluppoMAB42181:300
Anticorpo policlonale di pollo alla cheratina 5, purificato [Poly9059]Biolegend9059011:500
MUC5AC Anticorpo monoclonale (45M1)Thermo Fisher ScientificMA5-121781:300
PDPN / Anticorpo podoplanina (clone 8.1.1)LifeSpan BiosciencesLS-C143022-1001:300
Topo purificato anti-E-caderinaBD biosciences6101821:1000
Sox-2 AnticorpoSanta Cruz biotecnologiesc-3659641:300
Anticorpi
secondari Asino anti-coniglio lgG, 488Thermo Fisher ScientificA-212061:500
FITC anti-topo Anticorpo IgMBioLegend4065061:500
Capra anti-criceto IgG (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-211131:500
Anticorpo secondario anti-topo IgG1 di capra, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-211211:500
Anticorpo secondario anti-topo IgG2a di capra, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-211311:500
Anticorpo secondario adsorbito incrociato IgG2a anti-topo di capra, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-211341:500
Anticorpo secondario adsorbito incrociato IgG2b di capra anti-topo, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-21144:500
l'immunoistochimica3% BSA, o,4% Triton-x100 in TBS (soluzione salina a base di Tris)
Soluzione di incubazione3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS
SoluzioneTBS con 0,1% Tween 20
cellularedi tessutidi coltura organoidiprimari 1 tamponi Soluzione bloccante immunoistochimica di lavaggio per immunoistochimica

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lung Epithelial Progenitor CellsOrganoid CultureFluorescence Activated Cell SortingTissue DissociationCell Surface MarkersNGFR Basal CellsHTII 280 Alveolar CellsMagnetic Bead DepletionColony Forming Efficiency3D Organoid Generation

Related Articles