Summary
מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.
Abstract
לכידת תהליכי השכפול וההרכבה הדינמיים של וירוסים הופרעה על ידי היעדר טכנולוגיות הכלאה חזקות באתרן (ISH) המאפשרות תיוג רגיש ובו-זמני של חומצת גרעין וחלבון נגיפיים. שיטות קונבנציונליות של הכלאה פלואורסצנטית של דנ"א באתרן (FISH) לרוב אינן תואמות את האימונוסטינינג. לכן פיתחנו גישת הדמיה, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based d etection של DNA, RNA ו-protein), המאפשרת הדמיה סימולטנית של דנ"א, רנ"א וחלבון. בהשוואה לדגי דנ"א רגילים, MICDDRP משתמש בטכנולוגיית DNA מסועפת (bDNA) ISH, המשפרת באופן דרמטי את הרגישות והזיהוי של בדיקת אוליגונוקלאוטידים. שינויים קטנים של MICDDRP מאפשרים הדמיה של חלבונים נגיפיים במקביל לחומצות גרעין (RNA או DNA) של גדילים שונים. יישמנו את הפרוטוקולים האלה כדי לחקור את מחזורי החיים של פתוגנים נגיפיים מרובים, כולל נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1, נגיף T-לימפוטרופי אנושי (HTLV)-1, נגיף הפטיטיס B (HBV), נגיף הפטיטיס C (HCV), נגיף זיקה (ZKV) ונגיף שפעת A (IAV). הדגמנו שאנחנו יכולים לתייג ביעילות חומצות גרעין וחלבונים נגיפיים במגוון רחב של נגיפים. מחקרים אלה יכולים לספק לנו הבנה מכניסטית משופרת של מערכות נגיפיות מרובות, ובנוסף, לשמש כתבנית ליישום הדמיה פלואורסצנטית מרובת של דנ"א, רנ"א וחלבון על פני ספקטרום רחב של מערכות תאיות.
Introduction
בעוד שאלפי נוגדנים מסחריים זמינים לתיוג ספציפי של חלבונים באמצעות גישות אימונוסטיזציה קונבנציונליות, ובעוד שניתן להנדס חלבוני היתוך באמצעות תגים פלואורסצנטיים שעברו אופטימיזציה לפוטו-אופטימיזציה למעקב אחר חלבונים מרובים בדגימה1, הדמיה מיקרוסקופית של חלבון לרוב אינה תואמת להכלאה פלואורסצנטית קונבנציונלית של DNA באתרה (FISH)2 . מגבלות טכניות בהדמיה סימולטנית של דנ"א, רנ"א וחלבון באמצעות גישות מבוססות פלואורסצנציה הפריעו להבנה מעמיקה של שכפול הנגיף. מעקב אחר חומצת גרעין נגיפית וחלבון במהלך ההדבקה מאפשר לווירולוגים לדמיין תהליכים בסיסיים העומדים בבסיס שכפול הנגיףוהרכבתו 3,4,5,6.
פיתחנו גישת הדמיה, multiplex immunofluorescent cell-based d etection של DNA, RNA ו- Protein (MICDDRP)3, המשתמשת בדנ"א מסועף (bDNA) בטכנולוגיית situ כדי לשפר את הרגישות של זיהוי חומצות גרעין 7,8,9 . בנוסף, שיטה זו משתמשת בבדיקות מזווגות לספציפיות משופרת. בדיקות ספציפיות לרצף bDNA משתמשות ב-DNAs של קדם-מגבר ומגבר מסתעפים כדי לייצר אות אינטנסיבי ומקומי, ולשפר את שיטות ההכלאה הקודמות שהסתמכו על מיקוד באזורים חוזרים בדנ"א9. תאים נגועים בהקשר קליני לעתים קרובות אינם מכילים חומר גנטי ויראלי בשפע, ומספקים מצרך לשיטה רגישה לזיהוי חומצות גרעין פלואורסצנטיות במסגרות אבחון. המסחור של טכנולוגיית bDNA באמצעות גישות כגון RNAscope7 ו- ViewRNA10 מילאו נישה זו. לרגישות של דימות פלואורסצנטי bDNA יש גם תועלת חשובה בביולוגיה של התא, והיא מאפשרת זיהוי של מיני חומצות גרעין נדירים במודלים של תרביות תאים. השיפור העצום ברגישות הופך את שיטות ההדמיה מבוססות ה-bDNA למתאימות לחקר וירוסים. חסרון פוטנציאלי, עם זאת, הוא ששיטות אלה מתמקדות בהדמיה של רנ"א או רנ"א וחלבון. לכל התאים המשוכפלים ולנגיפים רבים יש גנומים של דנ"א או שהם יוצרים דנ"א במהלך מחזור השכפול שלהם, מה שהופך את השיטות המסוגלות לדמות גם רנ"א וגם דנ"א, כמו גם חלבון, לרצויות מאוד.
בפרוטוקול MICDDRP אנו מבצעים bDNA FISH לזיהוי חומצת גרעין נגיפית בשיטת RNAscope, עם שינויים7. אחד השינויים העיקריים בפרוטוקול זה הוא אופטימיזציה של טיפול בפרוטאז בעקבות קיבוע כימי. טיפול בפרוטאז מקל על הסרת חלבונים הקשורים לחומצת גרעין כדי לשפר את יעילות הכלאת הבדיקה. הטיפול בפרוטאז מלווה בדגירה עם גשושיות אוליגונוקלאוטידים מסועפות. לאחר יישום של בדיקות bDNA, דגימות נשטפות ולאחר מכן מודגרות עם DNAs קדם-מגבר אות ומגבר. הכלאה מרובבת באתרה (ISH), תיוג של מטרות גנים מרובות, דורשת בדיקות מטרה עם ערוצי צבע שונים להתמיינות ספקטרלית7. דגירה עם מגברי DNA מלווה באימונופלואורסצנציה (IF).
bDNA ISH מקנה שיפורים באותות לרעש על ידי הגברה של אותות ספציפיים למטרה, עם הפחתה לרעשי רקע מאירועי הכלאה לא ספציפיים 7,11. גשושיות מטרה מתוכננות באמצעות תוכנות הזמינות לציבור המנבאות את ההסתברות לאירועי הכלאה לא ספציפיים, כמו גם חישוב טמפרטורת התכה (Tm) של הגשושית-מטרה ההיברידית 7,11. גשושיות המטרה מכילות אזור של 18 עד 25 בסיסים המשלים את רצף הדנ"א/רנ"א של המטרה, רצף ספייסר ורצף זנב של 14 בסיסים. זוג גשושיות מטרה, שלכל אחת מהן רצף זנב מובחן, משתלבות לאזור מטרה (המשתרע על פני ~50 בסיסים). שני רצפי הזנב יוצרים אתר הכלאה עבור הגשושיות שלפני המגבר, המכילות 20 אתרי קישור עבור הגשושיות של המגבר, אשר בנוסף מכילות 20 אתרי קישור עבור גשושית התווית. לדוגמה, אזור של קילו-בסיס אחד (kb) על מולקולת חומצת הגרעין ממוקד על ידי 20 זוגות גשושיות, ויוצר פיגום מולקולרי להכלאה רציפה עם הקדם-מגבר, המגבר והגשושית התווית. זה יכול אפוא להוביל לתפוקה תיאורטית של 8000 תוויות פלואורסצנטיות לכל מולקולת חומצת גרעין, מה שמאפשר זיהוי של מולקולות בודדות ושיפורים עצומים לעומת גישות FISHקונבנציונליות 7 (ראו איור 1A לסכימות של הגברת אותות bDNA). כדי להגדיר בדיקות עבור ISH מרובב, כל בדיקת יעד חייבת להיות בערוץ צבע אחר (C1, C2 או C3). גשושיות מטרה אלה עם ערוצי צבע שונים הן בעלות רצפי זנב שונים של 14 בסיסים. רצפי זנב אלה יקשרו מגברי אותות שונים עם גשושיות פלואורסצנטיות שונות, ובכך יאפשרו התמיינות ספקטרלית על פני מטרות מרובות. בפרוטוקול המוצג, טבלה 4 בשלב 9, מספקת מידע נוסף על תיוג פלואורסצנטי של בדיקות מטרה. בנוסף, איור 2 ואיור 3 מספקים דוגמאות לאופן שבו בחרנו את המגבר המתאים 4-FL (A, B או C) (בדיקה פלואורסצנטית ושלב ההכלאה הסופי) כדי להשיג תיוג פלואורסצנטי ספציפי של מטרות מרובות של חומצות גרעין נגיפיות בעקבות זיהומים ב-HIV-1 וב-HTLV-1.
הדגמנו מספר יישומים של הדמיה פלואורסצנטית סימולטנית של RNA, DNA וחלבונים, תוך התבוננות בשלבים קריטיים של שכפול הנגיף ברזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה 3,4,5. לדוגמה, הדמיה סימולטנית של רנ"א נגיפי, דנ"א ציטופלסמי וגרעיני וחלבון אפשרה לנו לדמיין אירועי מפתח במהלך הידבקות ב-HIV-1, כולל מעקב אחר רנ"א המכיל ליבות בציטופלסמה לפני הכניסה הגרעינית ושילוב של דנ"א פרו-ויראלי3. בנוסף, יישמנו MICDDRP כדי לאפיין את ההשפעות של גורמים מארחים וטיפול תרופתי על זיהום ויראלי ושכפול 4,5. ב- Ukah et al., עקבנו אחר הפעלה מחדש של שעתוק HIV-1 במודלים של תאי חביון שטופלו בסוכני היפוך חביון שונים כדי לדמיין שעתוק HIV והיפוך חביון4. בנוסף, MICDDRP יכול לאפשר לנו לדמיין שינויים פנוטיפיים הקשורים עיכוב אנטי ויראלי המיוחס לטיפול במולקולות קטנות או הגבלת גורם מארח. כהוכחת היתכנות לעמידות ולתחולה הרחבה של הגישה שלנו, הוכחנו שאנו יכולים להשתמש בשינויים של הפרוטוקול שלנו כדי לתייג ביעילות חומצת גרעין נגיפית כדי לעקוב אחר זיהום לא רק בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1, אלא גם בנגיף T-לימפוטרופי אנושי (HTLV)-1, נגיף הפטיטיס B (HBV), נגיף הפטיטיס C (HCV), נגיף זיקה (ZIKV), ונגיף שפעת A (IAV). מכיוון שמחזור החיים של HIV-1 מורכב הן ממיני דנ"א נגיפיים והן ממיני RNA, ביצענו את רוב האופטימיזציה של MICDDRP בעקבות קינטיקה של שכפול HIV-1. עם זאת, בנוסף, הוכחנו כי אנו יכולים לעקוב אחר סינתזה של תעתיקי RNA נגיפיים שונים של גדילי החוש (+) והאנטיסנס (-) או שניהם בנגיפים כגון ZIKV, IAV, HBV ו- HCV כדי לעקוב אחר שעתוק ושכפול נגיפי 3,4,5,6. מטרת המחקרים היא לשפר את ההבנה המכניסטית של מספר תהליכים נגיפיים ולשמש קו מנחה ליישום טכנולוגיית הדמיה פלואורסצנטית זו במגוון רחב של מודלים תאיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תאי זרעים (תרחיף לעומת תאים דבקים) על כיסויים או שקופיות תא (פרוטוקול המוצג משתמש בכיסויים).
- זריעה של תאי תרחיף
- יש להכין כיסויים מצופים פולי-D-ליזין (PDL) (מקל על הדבקות של תאי תרחיף לכיסוי) על ידי הדגירה הראשונה של כיסויים באתנול (EtOH) למשך 5 דקות (מעקר את הכיסויים ומסיר שאריות). לאחר מכן יש לשטוף פי 2 במלח חצוב פוספט (PBS) לפני הדגירה של כיסויים ב-PDL (20 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 30 דקות (דקות) בטמפרטורת החדר (RT).
- יש להסיר PDL ולשטוף 2x ב-PBS. תאי גלולה (שנדבקו/טופלו בעבר בהתאם לתנאי ההדמיה הרצויים) והשעתה של 106 תאיםב-50 μL של PBS. יש לזהות 50 μL של תאים על זכוכית (מצופה PDL) ולדגור ב-RT למשך 30 דקות.
- זריעה של תאים דבקים
- תאי תרבית על כיסוי סטרילי מונחים בצלחת 6 בארות ומדביקים תאים בחלקיקים נגיפיים או מטפלים בתרכובת של עניין. אפשר לתאים להגיע למפגש של 50-70% לפני הכנת הדגימה לניסויי הדמיה.
2. קיבוע תאי: לשימור המורפולוגיה התאית למחקרי הדמיה פלואורסצנטית
הערה: יש לשמור על 4% PFA ו-PBS ב-RT למשך 30 דקות לפחות לפני קיבוע הסלולר.
- שאפו את המדיה התאית, שטפו תאים על כיסויים 3x ב-PBS, וקבעו תאים ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 30 דקות. שאפו PFA ושטפו תאים ב-PBS 2x.
הערה: כעת ניתן לייבש ולאחסן תאים, אם הנסיין מעוניין לחדש את הניסוי בתאריך אחר. ניתן לייבש תאים קבועים ב-EtOH לפני האחסון.- יש להסיר PBS לאחר השטיפה לאחר קיבוע התאים ולהחליף ב-500 μL של 50% EtOH (v/v במים). דגירה ב- RT במשך 5 דקות.
- הסר 50% EtOH והחלף ב- 500 μL של 70% EtOH. דגירה ב- RT במשך 5 דקות.
- הסר 70% EtOH והחלף ב- 500 μL של 100% EtOH. דגירה ב- RT במשך 5 דקות.
- יש להסיר 100% EtOH ולהחליף ב-100% EtOH טרי.
הערה: ניתן לאחסן תאים מיובשים בטמפרטורה של -20°C למשך 6 חודשים. אטמו לוחות עם סרט הדבקה או פרפילם לפני האחסון כדי למנוע אידוי של EtOH. - ייבשו מחדש את התאים כדי לעבור לתיוג פלואורסצנטי מרובב של תאים/נגיף.
- הסר 100% EtOH והחלף עם 500 μL של 70% EtOH. דגירה ב- RT במשך 2 דקות.
הערה: אין לתת לתאים להתייבש בכל עת. השתמש תמיד בפתרון מספיק כדי להטביע את כל התאים. - הסר 70% EtOH והחלף ב- 500 μL של 50% EtOH. דגירה ב- RT במשך 2 דקות.
- הסר 50% EtOH והחלף ב- PBS אחד.
הערה: הכן דילול פרוטאזות, בדיקות הכלאה ומאגר שטיפה לפני הטיפול בפרוטאז (שלב 4) ויישום בדיקת יעד (שלב 5). הוראות ספציפיות להכנת מגיב מוצגות בתחילת כל שלב בהתאמה.
| ריאגנטים | הערות אחרות |
| פתרון פרוטאז | הכנה ב-PBS אחד |
| גשושיות אוליגונוקלטודיה ממוקדות | דילול במאגר הכלאה |
| מאגר שטיפה | שטיפות בעקבות שלבי הכלאה ממוקדים |
| מאגר הכלאה | המתכון מוצג בטבלה 3 |
טבלה 1: ריאגנטים מרכזיים בפרוטוקול MICDDRP.
3. חדירת תאים: הגברת הגישה לתא ולאברונים התאיים לכניסה של מולקולות גדולות (נוגדנים, בדיקות הכלאה של חומצות גרעין)
- הסר PBS אחד לאחר קיבוע או התייבשות תאית והחלף ב- 500 μL של 0.1% (v/v) Tween-20 ב- PBS אחד. דגירה ב- RT במשך 10 דקות. החלף אחד אחד. יש לכבס פעם אחת עם 500 מיקרו-ליטר של PBS אחד ולהוסיף PBS טרי אחד.
4. אימוביליזציה של כיסוי על שקופית זכוכית וטיפול בפרוטאז להסרת חלבונים קושרי חומצות גרעין מחומצת גרעין נגיפית/תאית קבועה כדי לשפר את יעילות ההכלאה
הערה: הכן את תמיסת פרוטאז III המדולל (ראה פרטים על מגיב בטבלת החומרים) במהלך חדירת התאים. תנו לפרוטאז להגיע ל-RT במשך 10 דקות לפני החדירה.
- מניחים טיפה קטנה של לק על מגלשת זכוכית מעוקרת. יש לייבש את הגב (צד ללא שכבת תאים) ולהניח את קצה הכיסוי על טיפת הלק, כאשר הצד עם התאים המודבקים פונה כלפי מעלה. יש להוסיף מעט טיפות של PBS על הכיסוי המשותק כדי למנוע התייבשות.
- ציירו עיגול (במרחק של כ-3 מ"מ מהכיסוי) סביב היקף הכיסוי שנדבק כעת למגלשה באמצעות עט מחסום הידרופובי (עט דוחה מים ששומר על ריאגנטים מקומיים על תאים).
- יש לדלל פרוטאז III ב-PBS אחד (100 μL/כיסוי).
הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוז הפרוטאז בהתאם להבדלים בסוגי תאים, בדיקות או חומצות גרעין מטרה באמצעות אופטימיזציה אמפירית ( ראה דיון). עבור תיוג RNA/DNA היעיל ביותר במערכות נגיפיות שונות, הצלחנו עם הדילולים הבאים המוצגים בטבלה 2 להלן עם דילולים הנעים בין (1 ל-2)-(1 עד 15) (פרוטאז ל-1x PBS).
| מטרות בדיקה | דילול פרוטאז ב-PBS אחד (פרוטאז III עד 1X PBS) |
| דנ"א/רנ"א של HIV-1 | 1 עד 5 |
| HTLV-1 דנ"א/רנ"א | 1 עד 5 |
| HBV pgRNA וסך HBV RNA | 1 עד 15 |
| IAV RNA | 1 עד 15 |
| ZIKV RNA | 1 עד 2 |
טבלה 2: דילולים של פרוטאז III ב-PBS להכלאה של חומצות גרעין נגיפיות.
- יש לרוקן את ה-PBS 1x על הכיסוי לאחר אימוביליזציה ולמרוח את הפרוטאז III המדולל.
- לדגור בתנור לח ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- תמיסת פרוטאז דקאנט ושקופיות שקועות ב- PBS אחד. התסיסו עם צלחת נדנדה במשך 2 דקות ב- RT. חזרו על הכביסה עם PBS 1x חדש.
- לזיהוי דנ"א בלבד , יש לשטוף דגימות שלוש פעמים במים נטולי נוקלאז למשך 2 דקות כל אחת, ולאחר מכן דגירה עם 5 מ"ג/מ"ל RNase A מדולל ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- Decant RNase פתרון, ולשטוף 3x במשך 2 דקות עם מים טהורים במיוחד. המשך עם ISH של גשושיות מטרה.
הערה: מאגר ההכלאה משפר את זיהוי ה-vDNA מבלי להשפיע על יעילות צביעת ה-vRNA עבור התוצאות המוצגות (תוצאות מייצגות). דילול DNA ערוץ 1 (C1) בודק 1:1 עם בדיקת הכלאה. דילול בדיקות RNA C2 ו-C3 במאגר הכלאה. הגשושיות C2 ו-C3 המשמשות במחקרי ההדמיה שלנו נמצאות בפתרונות 50X (1:50; גשושית מטרה למאגר הכלאה).
- הכן חיץ הכלאה במים נטולי נוקלאז בהתאם להליך שלב אחר שלב להלן:
- בצינור של 15 מ"ל, יש להוסיף 700 μL של מים נטולי נוקלאז, 300 μL של 50% (משקל/נפח (w/v)) דקסטרן סולפט, 300 μL של 5 M NaCl, 125 μL של 200 mM נתרן ציטראט (pH 6.2), ו-375 מ"ג (אבקה) של אתילן קרבונט.
- מערבבים היטב באמצעות מערבולת כדי להמיס אתילן קרבונט (ודא שכל האבקה מומסת ותמיסה ברורה).
- הוסף 25 μL של 10% (נפח/נפח (v/v)) Tween-20 ומספיק מים ללא נוקלאז כדי להשלים 2.5 מ"ל (תמיסה פי 2).
הערה: את המתכון למאגר ההכלאה המוצג ניתן למצוא בטבלה 3 להלן. הפתרון יציב למשך שבוע. הקפידו על ערבוב מספיק של חומר הניקוי Tween-20, תוך הקפדה על מניעת מבעבע של תמיסה.
| מגיב | ריכוז מלאי | הערות נוספות |
| מים נטולי נוקלאז | נה | |
| דקסטרן סולפט | 50% (ללא כ"א) | צמיג מאוד |
| נתרן כלורי | 5 מ' | |
| נתרן ציטראט (pH 6.2) | 200 מ"מ | יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C |
| אתילן קרבונט | נה | אבקה |
| טווין-20 | 10% (וולט/ואט) |
טבלה 3: רשימת מאגרי הכלאה של ריאגנטים.
5. דגירה עם בדיקות הכלאה של מטרות DNA/RNA: גשושיות אוליגונוקלאוטיד מטרה נקשרות לאזורים מעניינים, ויוצרות פיגום מולקולרי עבור קדם-מגברים, מגברים ובדיקות פלואורסצנטיות להיקשר.
הערה: יש לחמם בדיקות DNA/RNA בטמפרטורה של 40°C למשך 10 דקות (במהלך פרמביליזציה של התא) ולהתקרר ל-RT למשך 10 דקות לפחות, אם לא כולל טיפול ב-RNase. אם יש צורך בטיפול ב-RNase או בטיפול נוסף בדגימה לפני הכלאת גשושית מטרה, יש לבצע בדיקות חמות בהתאם. סובבו את גשושיות C2 ו-C3 לאחר ההתחממות ודיללו במאגר ההכלאה. לאחר דילול, ניתן לחמם לזמן קצר את בדיקות C2 ו- C3. יש לחמם את מאגר הכביסה 50x (ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים) בטמפרטורה של 40°C למשך 10-20 דקות ולדלל עד פי 1 במים ברמת ביולוגיה מולקולרית.
- דגירה של 200 μL של מאגר ההכלאה ב-67 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני הוספת גשושיות הכלאה. בדיקה מדוללת במאגר הכלאה (מתכון המפורט בטבלה 2). יש להוסיף 50 מיקרוליטר/כיסוי.
- לדגור בתנור לח ב 40 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות (h). בדיקות Decant ושקע שקופיות במאגר שטיפה 1x. התסיסו על ידי נדנדה של צלחת במשך 2 דקות ב- RT. חזור על הכביסה עם מאגר כביסה חדש 1x.
6. הכלאה של מגבר (Amp) 1-FL: תוספת של קדם-מגבר המשלים את רצף הזנב של בדיקות ה-DNA/RNA של המטרה (שלב 5)
הערה: המגברים צריכים להיות ב-RT לפני השימוש. הוציאו כל מגבר בנפרד מהמקרר 30 דקות לפני השימוש והשאירו על הספסל ב-RT.
- יש להסיר את השקופיות ממאגר שטיפה 1x ולהקיש/לספוג כדי להסיר עודפי נוזלים.
- הוסיפו טיפה אחת של Amp 1-FL על הכיסוי. לדגור בתנור לח ב 40 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- מגבר דקנט 1-FL ושקע במאגר כביסה 1x. התסיסו על ידי נדנדה צלחת 2 דקות ב RT. חזור על הכביסה עם חיץ כביסה חדש 1x.
7. הכלאה של Amp 2-FL: אינקובציה עם מגבר אותות עם רצף זיהוי קוגנטי לקדם-מגברים (Amp 1-FL)
- יש להסיר את השקופיות ממאגר שטיפה 1x ולהקיש/לספוג כדי להסיר עודפי נוזלים.
- יש להוסיף טיפה אחת של Amp 2-FL על הכיסוי. לדגור בתנור לח ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- יש לטבול באמפר 2-FL ולטבול במאגר כביסה 1x. התסיסו על ידי נדנדה צלחת 2 דקות ב RT. חזור על הכביסה עם חיץ כביסה חדש 1x.
8. הכלאה של מגבר 3-FL: אינקובציה עם מגבר אות שני
- יש להסיר את השקופיות ממאגר שטיפה 1x ולהקיש/לספוג כדי להסיר עודפי נוזלים.
- יש להוסיף טיפה אחת של Amp 3-FL על הכיסוי. לדגור בתנור לח ב 40 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- יש לטבול באמפר 3-FL ולטבול במאגר שטיפה אחד. התסיסו על ידי נדנדה צלחת 2 דקות ב RT. חזור על הכביסה עם חיץ כביסה חדש 1x.
9. הכלאה של Amp 4-FL: תווית פלואורסצנטית ושלב הכלאה סופי
הערה: ראשית, ראה טבלה 4 כדי לבחור את Amp 4 המתאים (A,B או C)- FL בהתבסס על הערוצים של גשושיות היעד. הערך מה Amp 4-FL נדרש כדי לסמן DNA / RNA של עניין. דוגמה לכך מופיעה בטבלה שלהלן:
| A | B | C | |
| דנ"א ערוץ 1 (C1) | 488 | 550 | 550 |
| ערוץ DNA/RNA 2 (C2) | 550 | 488 | 647 |
| RNA ערוץ 3 (C3) | 647 | 647 | 488 |
טבלה 4: בחירה של בדיקה פלואורסצנטית של Amp 4 (A, B או C)-FL עבור ISH מרובה.
הערה: עבור FISH מרובב (יעדים מרובים), בחירת Amp 4 (A, B או C) הנכון - FL היא קריטית לתיוג נכון של יעדי העניין שלך. לבדיקות מטרה (שלב 5) יש ערוצי צבע שונים (C1, C2 או C3), המכתיבים את התווית הפלואורסצנטית המתאימה להן (Alexa 488, Atto 550 או Alexa 647), בהתבסס על Amp 4-FL שנבחר. דוגמאות לבחירת שילובי פלואורופור להדמיה מרובבת מובאות באגדות של איור 2 ואיור 3. כדוגמה נוספת, בחירה של Amp 4B-FL תתייג באופן סלקטיבי בדיקות DNA C1 עם בדיקות Atto 550 ו- RNA C3 עם Alexa 647.
- יש להסיר את השקופיות ממאגר שטיפה 1x ולהקיש/לספוג כדי להסיר עודפי נוזלים.
- יש להוסיף טיפה אחת של Amp 4-FL על הכיסוי. לדגור בתנור לח ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
הערה: לאחר שלב 9.2, שמור על דגימות מכוסות, מוגנות מפני האור. - דרגנט אמפר 4-FL ושקע במאגר כביסה 1x. התסיסו על ידי נדנדה של צלחת במשך 2 דקות ב- RT. חזור על הכביסה עם מאגר כביסה חדש 1x. יש לשטוף עם PBS אחד (2 דקות) ולאחסן ב-PBS.
10. חלבון חיסוני: כדי לתייג חלבונים מעניינים
- דקנט PBS והוסף 200 μL של מאגר חוסם (1% עם BSA / v , 10% v/v FBS ב- PBS עם 0.1% v/v Tween-20 (PBST)) לכיסוי. דגירה של שעה אחת ב-RT.
- חיץ חוסם דקנט ומחיל 200 μL של נוגדן ראשוני מדולל ב- PBST + 1% w/v BSA. דגירה של שעה אחת ב-RT.
- שטפו את המגלשה פעמיים עם PBST למשך 10 דקות ב-RT עם רעידות.
- החל נוגדן משני לבחירה למשך שעה אחת ב- RT ב- PBST + 1% עם BSA / v.
- שטפו את המגלשה עם PBST למשך 10 דקות ב-RT עם רעידות.
11. הכתמה גרעינית: גרעינים נגד כתמים בעקבות אימונוסטינינג
- לנטרל PBST ולהחיל DAPI או כתם גרעיני לבחירה במשך דקה אחת ב- RT.
- שטפו את המגלשה פעמיים עם PBS למשך 10 דקות ב-RT עם רעידות.
12. הרכבה
- הנח טיפה אחת של תמיסת אנטי-פאף (לדוגמה, זהב ארוך) על שקופית זכוכית סטרילית חדשה (ראשית, יש לנקות את ההחלקה עם EtOH ולתת לה להתייבש כדי לוודא שאין שאריות על זכוכית). עם אותו קצה, יש למרוח את טיפת תמיסת האנטי-פה כך שתכסה שטח בגודל של כסוף הכיסוי.
הערה: תמיסת האנטי-פאדה צמיגה מאוד ועשויה להיות קשה לפיפטה. חיתוך קצה של 200 μL לפני צנרת עשוי להקל על בעיות אלה. - הסר את הכיסוי עם דגימת תאים מהשקופית ושקע ב- PBS כדי להסיר שאריות לק מאחור באמצעות מלקחיים ו- PBS. מלקחיים יבשים וגב הכיסוי באמצעות קימוויפ.
- יש להחליק בעדינות את הכיסוי בטיפת תמיסת אנטיפייד, תוך הצבת צד הדגימה (צד עם שכבת התא) של הכיסוי על טיפה).
- תנו לדגימות להתייבש למשך הלילה.
13. הדמיה
- תמונה עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שרטוט של MICDDRP מתואר באיור 1. תיוג של דנ"א ורנ"א מלווה באימונוסטיין. השימוש במגברי הסתעפות מגביר את האות, ומאפשר זיהוי של מולקולות של חומצות גרעין בודדות.
איור 1: סכמת MICDDRP וזרימת עבודה שלב אחר שלב. (A) אות bDNA מוגבר באמצעות DNAs מסתעפים ומגברים כדי לשפר את הזיהוי של דנ"א נגיפי (1) ו-RNA (2). גשושיות אוליגונוקלאוטידים עוברות הכלאה בזוגות (ZZ בסכמות) כדי למקד(ים) עניין, ויוצרות פיגום עבור קדם-מגבר (Amp 1-FL, שלב 6 בפרוטוקול), מגבר (Amp 2- & 3-FL) וגשושיות פלואורסצנטיות (Amp 4, שלב 9 בפרוטוקול). עיין בטבלה 4 לבחירת מגבר 4 (A, B או C)-FL המתאים עבור ISH מרובב. תיוג של חומצת גרעין מלווה בחלבונים מעוררי חיסון בעלי עניין (3). (B) שלושה עשר שלבים עיקריים בפרוטוקול MICDDRP עם הערכת משך הזמן עבור כל שלב בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
היישום של MICDDRP כדי לחקור את מהלך ההדבקה ב- HIV-1 היה כלי שימושי במעקב אחר קינטיקה של שכפול נגיפי בתאים ראשוניים. כהוכחת היתכנות של הליך זה, דנ"א, רנ"א וחלבון של HIV-1 מסומנים וממחישים בו-זמנית באופן מיקרוסקופי ברמת התא הבודד (איור 2). שני גנומים של דנ"א HIV-1 מוצגים בתא אחד, מכיוון שהם מתמללים באופן פעיל RNA נגיפי (vRNA). vRNA יוצא דרך קומפלקס הנקבוביות הגרעיניות וחלבון נגיפי מסונתז בציטופלסמה.
איור 2: MICDDRP של תאים חד-גרעיניים ראשוניים בדם (PMBCs) הנגועים ב-HIV-1. PMBCs נגועים ב- HIV-1 (NL4.3) בריבוי של זיהום (MOI) של 2. התאים תוקנו 48 שעות לאחר ההדבקה (hpi). (A) בדיקת HIV-1 bDNA FISH (מסומנת ב-ATTO 550; אדום באיור). בדיקה זו מבצעת הכלאה לתבנית (3'<-5') גדיל vDNA כדי למנוע הצלבה עם vRNA הגיוני (+). (B) RNA HIV-1 לא מחובר (מסומן ב-Alexa 647; ירוק באיור). הבדיקה של HIV-1 vRNA עוברת הכלאה לתעתיקים נגיפיים המתומללים באוריינטציה של 5'->3'. (C) חיסון של חלבון קפסיד HIV-1 (p24) (נוגדן משני המצומד ל-Alexa 488; לבן באיור). (D) תמונה ממוזגת. סרגל קנה המידה מייצג 5 מיקרומטר. גרעינים היו מוכתמים ב-DAPI (כחול). כדי לתייג דנ"א של HIV-1 (בדיקת DNA C1) עם ATTO 550 ו- HIV-1 RNA (בדיקה RNA C3) עם Alexa 647, בהתאמה, דגימות דוגרו עם Amp 4-FL 'B' (עיין בטבלה 4 בפרוטוקול כדי לבחור צבעי ערוצים מתאימים עבור בדיקות היברידיזציה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
בנוסף, ביצענו דנ"א נגיפי כפול (vDNA) והכתמת vRNA כדי לעקוב אחר זיהום HTLV-1. לצורך אופטימיזציה של תיוג חומצות גרעין, דבקנו באופן הדוק בהליך צביעת ה-vDNA/VRNA שפותח להדמיה פלואורסצנטית מרובת של הידבקות ב-HIV. הוכחנו שאנו יכולים לתייג באופן ספציפי את הדנ"א והרנ"א של HTLV-1 בו-זמנית.
איור 3: התוויה סימולטנית של HTLV-1 vDNA ו-vRNA בתאי MT-2. (A) HTLV-1 vDNA (מסומן ב-ATTO 550; אדום באיור) (B) חוש HTLV-1 לא מחובר (+) RNA (בדיקת RNA C2 ומסומן ב-Alexa 488; ירוק באיור)). (C) HTLV-1 HBZ antisense (-) vRNA (בדיקה RNA C3 & (מסומן עם Alexa 647; לבן באיור)). (D) תמונה ממוזגת. סרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרומטר. גרעינים היו מוכתמים ב-DAPI (כחול). נעשה שימוש ב- Amp 4-FL 'B' (עיין בטבלה 4 בפרוטוקול) כדי להשיג תיוג מרובב של HTLV-1 ('+' ו- '-') RNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניסויי בקרה להערכת הספציפיות והרקע של גשושיות המטרה. הספציפיות של בדיקות המטרה של HIV-1 ו- HTLV-1 הוערכה לאחר זיהום בקווי תאים לימפוציטיים (תאי Jurkat T לא נגועים, תאים נגועים ב- HTLV-1 (MT2) ותאים נגועים ב- HIV-1 (H9111B)). מוטות קנה המידה מייצגים 10 מיקרומטר. (A) תאים טופלו בבדיקות RNA HTLV-1. (B) התאים טופלו בבדיקת RNA מסוג HIV-1 (+) (C-D). הדגמה נוספת של הספציפיות של בדיקות HTLV-1 ללא תגובתיות צולבת עם HIV-1. חיצים לבנים באיור 4C מציינים דנ"א HTLV-1 (אדום). (E-F). מכתים vRNA (ירוק) +/- טיפול ב-RNase. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
כדי לאמת את הספציפיות של בדיקות ההכלאה ולהעריך כיצד שיטת הסימון של ISH משפיעה על יעילות צביעת החלבון ועל הרקע הכולל, אנו מבצעים בקרות קריטיות כדי להבטיח את הרמה הגבוהה ביותר של קפדנות ויכולת שכפול עבור הניסויים. לדוגמה, באיור 4A-D, אנו מאמתים את הספציפיות של בדיקות ה-vDNA וה-vRNA של HIV-1 ו-HTLV-1, מכיוון שאנו מראים מעט מאוד תגובתיות צולבת בין קבוצות הבדיקה בין שני הנגיפים. למרות התיוג של שני רטרו-וירוסים עם פוטנציאל לתגובתיות צולבת של בדיקה, בדיקות ה- HIV-1 הן ספציפיות רק לחומר גנטי של HIV-1 ולא HTLV-1. אותה מגמה נכונה גם לגבי בדיקות HTLV-1. בנוסף, באיור 4F אנו מראים שאנו יכולים לסלק כתמי vRNA אם אנו מטפלים בתאים שלנו באמצעות RNase במהלך הכנת הדגימה. כדי להעריך את האפשרות של הנחתה של יעילות צביעת חלבונים עקב ISH (טיפול בפרוטאז (שלב 4 בפרוטוקול ובאיור 1B) ותנאי הכלאה, שיכולים להוביל לאבלציה של זיהוי אפיטופים או אות רקע מוגבר, אנו מדגימים כי יעילות צביעת החלבון עבור סמן הכתם הגרעיני, sc-35, דומה לגישות IF קונבנציונליות ולחיסוניות במהלך פרוטוקול MICDDRP. בפרוטוקול IF הקונבנציונלי, התאים חלחלו עם 0.1% Triton X-100 למשך 15 דקות, במקום חלחול עם 0.1% Tween-20 למשך 10 דקות, המשמש בפרוטוקול MICDDRP (שלב 3 בפרוטוקול וזרימת עבודה באיור 1B). הכתמת חלבונים בשני המצבים (IF לעומת MICDDRP) יצרה אות גדול בכמה סדרי גודל מהבקרה (MICDDRP ללא נוגדן ראשוני), מה שמדגים עוד יותר את הרקע הנמוך שנוצר בעקבות פרוטוקול זה ושימור אפיטופים של חלבונים לחיזוק יעיל של איברונים. כימות תמונה של עוצמת פלואורסצנטיות משולבת ממוצעת של אות sc-35 לתא (איור 5E) בוצע כפי שתואר קודםלכן 3. עבור כל תוצאות ההדמיה שהוצגו, הבטחנו ספציפיות בדיקה ונוגדנים, וכן הערכנו כל הפרעה אפשרית או רעשי רקע גבוהים מהרגיל המיוחסים לגישת ISH שלנו.
איור 5: השוואה של יעילות צביעת חלבונים בעקבות IF קונבנציונלי לעומת MICDDRP. החלבון התאי, sc-35, סמן ביולוגי עבור כתמים גרעיניים, היה מוכתם חיסונית בתאי Jurkat T. כל סרגלי האבנית מייצגים 10 מיקרומטר. (A) תאי Jurkat T לא נגועים עברו את פרוטוקול MICDDRP וטופלו בבדיקות הכלאה של דנ"א/רנ"א HIV-1 המשמשות באיור 2 ובאיור 4 לעיל. במהלך החיסון לא נוסף נוגדן ראשוני. (B). תאי Jurkat T לא נגועים עברו IF, תיוג sc-35 (לבן). התאים היו מחלחלים עם 0.1% טריטון X-100 במשך 15 דקות. (C). MICDDRP בוצע על תאי Jurkat T נגועים ב- HIV. vRNA מסומן בירוק, vDNA אדום ו-sc-35 לבן. (D). תקריב של vRNA, vDNA ותיוג חלבונים (sc-35) בתאים נגועים ב- HIV. (E) כימות של אות פלואורסצנטי משולב ממוצע לכל תא של sc-35 בתנאי חיסון שונים. ציר ה-y הוא בסולם לוגריתמי. הקו המקווקו מייצג את אות הרקע מתאים לא נגועים שעברו את פרוטוקול MICDDRP שבו לא נוסף נוגדן ראשוני. אין הבדל משמעותי באות בעקבות MICDDRP לעומת IF קונבנציונלי. יותר מ-500 תאים נדגמו לצורך כימות של מצב ההגעה בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לחקור נגיפי RNA שעשויים לכלול או לא לכלול תבניות דנ"א לשכפול נגיפי. לדוגמה, ניתן לתכנן בדיקות bDNA ספציפיות לגדילים כדי לנטר ביטוי של RNA גדיל (+) או אנטיסנס (-) ומיני vRNA שונים בנגיפים כגון HBV, HCV, IAV ו- ZIKV. ההדמיה של מיני RNA שונים במהלך ההדבקה יכולה לספק תובנה לגבי קינטיקה של שכפול של מערכות נגיפיות שונות.
בעקבות מהלך הזמן של זיהום HBV, אנו יכולים לראות כי כמות ה-RNA הקדם-גנומי של HBV (pgRNA) וסך ה-HBV RNA גדלה כפונקציה של זמן. בנוסף, חידשנו בו-זמנית גורם מארח תאי, MOV10 (איור 6).
איור 6: HBV. מהלך הזמן של זיהום HBV של 3E8 תאים. התאים היו נגועים ב-300 גנומים של HBV לכל תא. שכפול נגיפי מוצג בשלוש נקודות זמן (24, 48 ו-72 hpi). pgRNA (מסומן ב-ATTO 550; אדום באיור), RNA HBV כולל (מסומן ב-Alexa 647; ירוק באיור), ו-MOV10 (נוגדן משני המצומד ל-Alexa 488; לבן באיור). גרעינים מוכתמים ב- DAPI בכחול. סרגל קנה המידה בתמונות ממוזגות מייצג 10 μm. hpi, שעות לאחר ההדבקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
ההדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות מטרת טבילת שמן פי 60. אורכי הגל של עירור/פליטת מזהמים ששימשו לזיהוי DAPI, Alexa 488, ATTO 550 ו-Alexa 647 נקבעו ל-405/420-480, 488/505-550, 550/560-610 ו-647/655-705 ננומטר, בהתאמה (איור 7, איור 8 ואיור 9).
איור 7: מהלך הזמן של זיהום HCV של תאי Huh-7.5.1. תאי Huh-7.5.1 נדבקו בנגיף הפטיטיס C (HCV) Jc1/Gluc2A ב-MOI של 0.5. במרווחי הזמן שצוינו, התאים היו קבועים ונחקרו ברצף עבור חוש (+) vRNA, אנטיסנס (-) vRNA ו- NS5A (חלבון HCV). גרעינים היו מוכתמים ב- DAPI. תמונות ממוזגות מייצגות מכל נקודת זמן, המציגות (+) RNA בירוק (מסומן ב-Alexa 647) (-) RNA באדום (מסומן ב-Atto 555), NS5A בלבן (עז משנית נגד עכברים המצומדת ל-Alexa 488) וגרעינים בכחול. סרגלי קנה מידה מייצגים 10 מיקרומטר. התמונות התחתונות הן גזרות מוגדלות מנקודת הזמן המתאימה. hpi, שעות לאחר ההדבקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: bDNA FISH ספציפי לגדילים וחיזוק חיסוני של תאי A549 הנגועים בנגיף שפעת A. תאי A549 שנדבקו בנגיף PR8 Flu A תוקנו ונבחנו עבור (A) נוקלאופרוטאין IAV (NP) RNA (מסומן ב-Alexa 488; ירוק באיור), ו-(B) חלבון IAV פולימראז (PB1) (עז שניונית נגד עכבר Atto 550; אדום באיור) וגרעינים היו מוכתמים ב-DAPI (כחול). (C) תמונה ממוזגת. סרגל קנה המידה מייצג 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 9: דגי דנ"א bDNA ספציפיים לגדילים בתאים נגועים בנגיף זיקה (ZIKV). תאי Vero נדבקו ב-ZIKV ב-MOI של 0.1. התאים תוקנו ב-48 hpi. (A) התאים הוכתמו בו-זמנית עבור vRNA חושי (+) (מסומן ב-Alexa 488; ירוק באיור) ו-vRNA אנטיסנס (-) (מסומן ב-Atto 550; אדום באיור). גרעינים היו מוכתמים ב- DAPI. ב- (A), התיבה הלבנה מציינת אזור עם (+) ו- (-) vRNA. הסטים מציגים תקריב של (+) vRNA (ירוק) ושל מיני ה-vRNA הנדירים יותר (-) (באדום). (B) חוש (+) vRNA (ירוק). (C) אנטיסנס (-) vRNA (אדום). סרגל קנה המידה ב- (A) מייצג 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה סימולטנית של RNA, DNA וחלבון דורשת לעתים קרובות אופטימיזציה נרחבת. שתי שיטות נפוצות הן תיוג 5-אתיניל-2-דאוקסיורידין (EdU) ודגי DNA. תיוג EdU יושם כדי לדמיין דנ"א ויראלי וחלבון בו זמנית, שכן EdU משולב בדנ"א מתהווה ולאחר מכן מתויג עם צבעים פלואורסצנטיים המכילים אזיד באמצעות כימיה של קליקים. לפיכך, ניתן להשתמש בתיוג EdU כדי לעקוב אחר קינטיקה מקורית של שכפול וירוסים של נגיפי דנ"א או וירוסים באמצעות תבניות דנ"א לשכפול12. חסרון בתיוג EdU, לעומת זאת, הוא שבחלוקת תאים, הגנום המשוכפל ישלב את EdU, מה שייצור רקע גבוה וניתוח תמונה מבלבל. דגי דנ"א יכולים לעקוף בעיות אלה על ידי הכלאה ישירה של גשושית חומצת גרעין למטרה המתאימה ללא קשר למחזור התא. עם זאת, FISH קונבנציונלי הסתמך לעתים קרובות על טמפרטורות גבוהות כדי להשיג הכלאה יעילה של בדיקה, מה שהפריע ל-immunostaining או אפילו לצביעת RNAסימולטנית 13. MICDDRP יכול לעקוף את הבעיות הללו באופן פוטנציאלי ולספק תיוג פלואורסצנטי חזק בו-זמנית של דנ"א, רנ"א וחלבון במגוון מערכות תאיות.
אמנם הוכחנו שאנו יכולים לסמן חלבונים וחומצות גרעין בו-זמנית באמצעות פרוטוקול MICDDRP שלנו, אך היה צורך באופטימיזציה במערכות שונות. הפרמטר העיקרי הראשון שהיינו צריכים לייעל היה טיפול בפרוטאזות. שינינו את ריכוז פרוטאז III בין התנאים. אופטימיזציה של טיפול בפרוטאזות הייתה אמפירית, שכן השתמשנו בדילולים שונים כדי להעריך מה הניב את יעילות ההכלאה הגדולה ביותר, מבלי להתפשר על יעילות החיסון. בקרות מתאימות בוצעו זו לצד זו כדי להעריך את ספציפיות הבדיקה ואת השינויים ביעילות מכתים החלבון המיוחסים לטיפול בפרוטאזות. הפרמטרים העיקריים הבאים שהיו זקוקים לאופטימיזציה היו תכנון בדיקה והכלאה של בדיקה.
תכנון נכון של בדיקות לכידה ומגבר הם קריטיים להשגת הרגישות והספציפיות של טכנולוגיית bDNA. חבילות תוכנה המנבאות את ההסתברות לאירועי הכלאה לא ספציפיים זמינות לשיפור תכנון הבדיקה 7,11. כעת ניתן לרכוש באופן מסחרי בדיקות bDNA עם בדיקות קדם-מגבר, מגבר ותווית פלואורסצנטית הנלוות כדי להבטיח תאימות לערכות הדמיה של bDNA. משתמשים יכולים לספק ליצרנים מידע על רצף (~300-1000 זוגות בסיסים) עבור אזורי היעד בצורה של קובץ fasta (תבנית מבוססת טקסט לייצוג רצף נוקלאוטידים). גשושיות מטרה נוצרות עם > 90% הומולוגיה של רצף לרצף המסופק.
עבור תיוג דנ"א, מצאנו כי דילול של הגשושיות במאגר ההכלאה המתואר בשלב 5 של הפרוטוקול משפר את הכלאת הדנ"א. כאשר מתייגים גם דנ"א וגם רנ"א, ניתן לדלל את בדיקת הרנ"א במאגר ההכלאה. תיוג דנ"א בהיעדר RNase אינו יכול לשלול את האפשרות שחומצת הגרעין הנצפית כוללת RNA של גדיל ממוקד. ייתכן שיהיה צורך גם להתאים את הטמפרטורה כדי לשפר את יעילות ההכלאה. עליית הטמפרטורה עלולה להשפיע על יעילות צביעת החלבון, שכן עלייה בטמפרטורות עלולה לקדם דנטורציה של חלבונים, ולבטל את זיהוי האפיטופ של הנוגדן העיקרי. בנתונים המייצגים המוצגים שלנו, ביצענו ISH ב 40 מעלות צלזיוס.
בהשוואה לדגי דנ"א רגילים, MICDDRP מספק הליך משופר לתיוג בו-זמני של דנ"א, רנ"א וחלבון להמחשה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מגבלה אפשרית היא שבחירת הגשושית עשויה להשפיע על יעילות ההכלאה והיכולת להשוות נתונים באופן כמותי בין גשושיות. פרוטוקול זה היה יעיל בכל מגוון מערכות תאיות וויראליות בידינו, עם אופטימיזציה קלה בלבד הדרושה בתנאים משתנים. פרסומים בעלי פרופיל גבוה לאחרונה השתמשו בגישה שלנו לחקר בחירת אתר שילוב HIV14 וקינטיקה של שעתוק לאחור של HIV15. יישומים עתידיים של MICDDRP יכולים לכלול הדמיה של חומצות גרעין נגיפיות במקביל לרצפי חומצות גרעין של גנים תאיים ספציפיים וחלבונים תאיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה במלואה או בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 ו- U54 AI150472). אנו מודים לד"ר ריימונד פ. שינזי וסיידי עמיחי על אספקת תאים נגועים בנגיף שפעת A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
